CA8基因或蛋白作为黑色素瘤诊断标志物的用途的制作方法

ca8基因或蛋白作为黑色素瘤诊断标志物的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及ca8基因或蛋白作为黑色素瘤诊断标志物的用途。


背景技术：

2.黑色素瘤，又称为恶性黑色素瘤(malignant melanoma，mm)，约占所有恶性肿瘤的1％～3％。皮肤黑色素瘤(cmm)是由表皮黑色素细胞恶性转化而来的侵袭性肿瘤，是所有皮肤肿瘤中进展最快且预后最为不良的恶性肿瘤，后期出现血运或淋巴结转移。其发病隐匿，易于早期转移，就诊患者多为中晚期，且发生转移5年内死亡率较高。近年来，mm的发病率和死亡率呈明显上升趋势，美国癌症协会(acs)2017年报道称，除mm和甲状腺癌的发病率和死亡率呈上升趋势外，其他常见恶性肿瘤都呈下降趋势。我国流行病学研究显示，每年新发病例约20000人，《中国黑色素瘤诊治指南(2015版)》更新显示，与欧美国家相比，我国mm呈现死亡率随发病率上升而上升状态，这反映了我国在mm诊断治疗上与欧美国家存在差距，需要在临床工作中做到早预防、早发现、早治疗。
3.目前关于黑色素瘤基础和临床研究的探索不断增多，但其发病机制仍然未明，很多患者确诊时已经是中晚期。临床治疗上无显著进展，现状仍不容乐观。因此，进一步探索黑色素瘤发生和发展的相关机制，寻找新的肿瘤标志物以及治疗靶点延长患者生存期成为亟待解决的问题。
4.已显示某些基因与黑色素瘤相关。如cxcr4基因沉默对黑色素瘤侵袭及转移的影响，spink5在皮肤恶性黑色素瘤临床组织样本中的表达情况。寻找更多黑色素瘤的新靶标，对黑色素瘤的生物诊断和治疗具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与黑色素瘤发生相关的分子标志物，将其应用到临床中，实现对黑色素瘤早期诊断，提高患者的生存率和生存质量。
6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
7.本发明首先提供了ca8的定量检测剂在制备用于黑色素瘤的诊断或预后分析的试剂盒中的应用。
8.在一些实施方式中，所述定量检测剂用于执行以下任一种方法：酶联免疫吸附试验、免疫印迹法、高通量测序、定量pcr。
9.优选的，所述定量检测剂为ca8蛋白的特异性抗体。
10.优先的，所述特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
11.优选的，所述定量检测剂为ca8基因的特异性引物。
12.优选的，所述特异性引物包括能够在mrna水平检测ca8基因表达水平的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.4所示。
13.在一些实施方式中，所述ca8基因或蛋白在黑色素瘤细胞中表达上调。所述ca8基因或蛋白随着黑色素瘤细胞的转移程度越高，表达水平越高。
14.在一些实施方式中，所述检测剂还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
15.在一些实施方式中，所述样品选自受试者的血液、血清、血浆、组织或细胞以及唾液样品中的至少一种。
16.进一步地，本发明提供了ca8基因或蛋白作为标志物在制备预防或治疗黑色素瘤的药物中的应用。
17.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
18.本发明证实ca8在小鼠和人的黑色素瘤细胞中高表达，其表达水平随黑色素瘤的转移程度的升高而升高，且与生存率呈负相关，可作为黑色素瘤的诊断或预后标志物。进一步通过tcga数据库中451个黑色素瘤样本分析ca8表达水平与黑色素瘤疾病具有统计学相关性。本发明首次证实ca8与黑色素瘤的相关性，是黑色素瘤治疗领域的一种非常有价值的潜在药物筛选或治疗靶点。
附图说明
19.图1检测ca8 mrna在小鼠黑色素瘤细胞中的表达水平；
20.图2检测ca8蛋白在小鼠黑色素瘤细胞中的表达水平；
21.图3检测ca8 mrna在人黑色素瘤细胞中的表达水平；
22.图4检测ca8蛋白在人黑色素瘤细胞中的表达水平；
23.图5ca8表达与黑色素瘤患者的生存关系。
具体实施方式
24.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.实施例1
26.比较小鼠正常表皮细胞jb6和小鼠黑色素瘤高转移细胞b16
‑
f10及小鼠黑色素瘤低转移细胞b16
‑
f1中ca8的mrna水平含量。
27.小鼠黑色素瘤细胞b16
‑
f10接种于含有10％胎牛血清dmem培养基中(加入青霉素、链霉素100u/ml)，置于37℃、5％co2培养箱中培养，以0.25％胰蛋白酶消化传代。
28.操作步骤如下：
29.rna抽提和荧光定量pcr检测：使用总rna极速抽提试剂盒(飞捷生物)提取细胞的rna，按照常规步骤进行反转录形成cdna后，实时荧光定量pcr检测ca8的表达效果，其中，cdna扩增引物对序列分别：
30.qpcr引物f：5
’‑
gggaagagaaaaccagcgtg
‑3’
(seq id no:1)；
31.qpcr引物r：5
’‑
cagccttcaagccaacatgt
‑3’
(seq id no:2)。
32.结果如图1显示，ca8表达水平在肿瘤细胞中的含量高于正常表皮细胞的含量，且随着黑色素瘤细胞的转移程度越高，其表达水平越高。
33.实施例2
34.比较小鼠正常表皮细胞和和小鼠黑色素瘤高转移细胞b16
‑
f10及小鼠黑色素瘤低转移细胞b16
‑
f1中ca8的蛋白水平含量。
35.操作步骤如下：
36.收集80％汇合度时细胞，离心后弃上清，pbs润洗两次，弃上清。加入ripa裂解液，冰上裂解20min。12000g离心10min收集上清。加入1xsds上样缓冲液，吹打混匀后煮沸变性5min。10％sds
‑
page凝胶分离总蛋白，然后转移到pvdf膜。5％bsa室温封闭2h，与ca8抗体(abcam，ab275656(1:1000稀释))4℃孵育过夜，tbst洗涤3次。二抗室温孵育1h，tbst洗涤3次。ecl超敏化学发光液显影，经tannon成像系统成像。以tubulin(abcam，ab7291(1:2000稀释))作为内参比较不同细胞中ca8蛋白的表达水平。
37.结果如图2所示，与正常表皮细胞相比，肿瘤细胞中系ca8蛋白表达明显升高，且随着黑色素瘤细胞的转移程度越高，其表达水平越高。
38.实施例3
39.比较人正常表皮细胞hacat和人黑色素瘤细胞sk
‑
mel
‑
24，sk
‑
mel
‑
28中ca8的表达量。
40.具体步骤参见实施例1所述的实验方法。
41.cdna扩增引物对序列分别：
42.qpcr引物f：5
’‑
gagcttcatcgaagataccgtc
‑3’
(seq id no:3)；
43.qpcr引物r：5
’‑
ggtcatacctagcctctcttgag
‑3’
(seq id no:4)。
44.结果如图3所示，发现ca8表达水平在人黑色素瘤细胞中的含量高于正常表皮细胞的含量。
45.实施例4
46.比较人正常表皮细胞hacat和人黑色素瘤细胞sk
‑
mel
‑
24，sk
‑
mel
‑
28中ca8的蛋白水平含量。
47.具体步骤参见实施例2所述的实验方法。
48.结果如图4所示，与人正常表皮细胞相比，人黑色素瘤细胞中系ca8蛋白表达明显升高。
49.实施例5
50.分析tcga数据库中黑色素瘤患者的基因表达数据，根据ca8表达量的高低分为两类患者，比较这两类患者的生存期。
51.从tcga数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载黑色素瘤患者的mrna数据和每位患者的临床信息，选择黑色素瘤患者的数据做后续分析，共有451个黑色素瘤样本。
52.使用r程序包中的edger package(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edger.html)进行基因表达分析，根据ca8的表达水平将451名黑色素瘤患者分为低表达组和高表达组。再进行kaplan
‑
meier生存分析，根据two
‑
sided long
‑
rank test计算p值，p值小于0.05说明两组之间的生存曲线具有统计学差异(图5)，发现ca8表达量低的患者，生存期明显优于ca8表达量高的患者。。
53.进一步验证，ca8可作为黑色素瘤诊断或预后标志物。
54.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在
本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。