酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因和应用的制作方法

文档序号：25483084发布日期：2021-06-15 21:43阅读：118来源：国知局

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone)又称f-2毒素，最初从发霉玉米中分离得到，主要由镰刀菌属fusarium产生的非甾体雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物及其副产品中。玉米赤霉烯酮通过污染的谷物农副产品及饲料进入食物链，被动物吸收后，引起牲畜雌激素综合症状，导致牲畜体内雌激素过多，引起不孕不育、流产、死胎和畸胎现象，并有很强的致癌性，严重危害牲畜及人类健康。目前玉米赤霉烯酮脱毒主要方法有物理法、化学法和生物法。物理法脱毒效率不高，而且破坏谷物营养成分，影响食品口感；化学法可以有效脱毒，但是如何从谷物食品中去掉脱毒用的化学成分很困难，容易造成二次污染。因此利用生物技术对玉米赤霉烯酮及其衍生物进行降解是未来解决这一问题的主要方法。玉米赤霉烯酮降解酶可以催化玉米赤霉烯酮酯键断裂，形成非毒性产物。但目前玉米赤霉烯酮降解酶的工程菌株产酶水平较低、催化活力较低、底物适用范围窄，大规模的推广应用还存在相当的阻力。

易错pcr技术是在采用dna聚合酶进行pcr反应扩增目的片段时，通过调整反应条件，增加扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，从而筛选需要的正向突变体。易错pcr技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

技术实现要素：

本发明提供了酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过构建突变体文库和定向筛选的方法，对clonostachysrosea来源的玉米赤霉烯酮降解酶基因进行改良，筛选得到酶活力提高的突变体，对高效降解玉米赤霉烯酮具有重要的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01的氨基酸序列如seqidno：5所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01是由氨基酸序列为seqidno：1的玉米赤霉烯酮降解酶的第3位的异亮氨酸变为赖氨酸获得的。

本发明还提供了所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01的编码基因，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01的编码基因的核苷酸序列如seqidno：6所示。

本发明还提供了一种酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02的氨基酸序列如seqidno：7所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02是由氨基酸序列为seqidno：1的玉米赤霉烯酮降解酶的第23位的甘氨酸变为谷氨酸获得的。

本发明还提供了所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02的编码基因，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02的编码基因的核苷酸序列如seqidno：8所示。

本发明还提供了一种酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的氨基酸序列如seqidno：9所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03是由氨基酸序列为seqidno：1的玉米赤霉烯酮降解酶的第251位的缬氨酸变为丙氨酸获得的。

本发明还提供了所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的编码基因，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的编码基因的核苷酸序列如seqidno：10所示。

本发明还提供了含有所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01的编码基因、或含有所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02的编码基因、或含有所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的编码基因的重组菌株。

本发明还提供了所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01、或所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02、或所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03在用于制备降解玉米赤霉烯酮的生物制剂中的应用。

进一步的，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01、所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02和所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的反应温度为35-50℃。

进一步的，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01、所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds02和所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds03的反应ph为6-9。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过以clonostachysrosea来源的玉米赤霉烯酮降解酶基因为基础，并利用易错pcr方法对其进行改造，再利用酶活力检测筛选得到了包含i3k的突变体ymds01，和包含g23e的突变体ymds02，以及包含v251a的突变体ymds03。本发明改造后的突变体ymds01，ymds02和ymds03的酶活力比原始玉米赤霉烯酮降解酶分别提高了35.5%、22.4%和18.5%，也说明了这些突变体的降解玉米赤霉烯酮的能力得到明显的提高。所以通过本发明技术方案得到的玉米赤霉烯酮降解酶突变体对玉米赤霉烯酮降解效率较野生型有较大提高，使其在饲料、食品等领域有很好的应用潜力，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中玉米赤霉烯酮降解酶突变体在30l发酵罐中的酶活力数据。

图2是本发明中玉米赤霉烯酮降解酶突变体降解玉米皮粉的实验结果。

图3是本发明中玉米赤霉烯酮降解酶突变体降解ddgs的实验结果。

图4是本发明中玉米赤霉烯酮降解酶突变体降解酵母培养物的实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照j.萨姆布鲁克（sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

1、菌株和载体

毕赤酵母gs115，质粒ppic9k，大肠杆菌dh5α，大肠杆菌bl21，质粒pet21a(+)购自invitrogen公司；优化后的基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2、试剂与培养基

质粒提取试剂盒、片段纯化回收试剂盒、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；genemorphii随机突变pcr试剂盒购自stratagene公司；氨苄青霉素、iptg等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白marker：blueplusiiproteinmarker(14-120kda)购自北京全式金生物技术有限公司。

lb培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%nacl。

md培养基：1.34%ynb，0.4mg/l生物素，2%葡萄糖；

ypd培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

bmgy培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液（ph6.0），1.34%ynb，0.4mg/l生物素，1%甘油；

bmmy培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液（ph6.0），1.34%ynb，0.4mg/l生物素，1%甲醇；

bsm培养基：26.7ml85%的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mllpmt1。

以上培养基为固体时加入2%的琼脂粉。

3、实验方法

菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。

毕赤酵母gs115转化方法：

将活化的毕赤酵母gs115接种到含有20mlypd液体培养基中，30℃摇瓶培养至od600为1.2～1.5后低温离心收集菌体，依次用20ml冰冷无菌水和5ml浓度为1mol/l的冰冷山梨醇溶液清洗菌体，最后用1ml山梨醇溶液重悬菌体制得酵母感受态悬液。将100μl酵母感受态与10μl线性化载体混匀后转移到预冷的电转杯中电击转化，电转化的条件为1.5kv，6msec。电击后加入1ml山梨醇溶液，转移至1.5ml离心管中30℃温育1h。5000rpm离心5min，收集菌体涂布于md筛选平板上倒置培养，直至长出阳性单克隆。

玉米赤霉烯酮降解酶酶活力检测：

hplc法酶活定义：每分钟降解1μg玉米赤霉烯酮所需的酶量为一个单位u。

步骤一：50μl酶上清液+50μlbuffer（0.2mol/ltris-hcl，ph8.5），充分混匀。

步骤二：取上步混合液50μl（含25μl酶上清液），加入430μlbuffer（0.2mol/ltris-hcl，ph8.5）和20μl玉米赤霉烯酮（500μg/ml），45℃反应5min，加入500μl乙腈终止反应。

步骤三：hplc检测玉米赤霉烯酮剩余含量。

高效液相色谱参考条件如下：

a)色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度4μm，或等效柱；

b)流动相：乙腈-水-甲醇（46：46：8，体积比）；

c)流速：1.0ml/min；

d)检测波长：激发波长274nm，发射波长440nm；

e)进样量：100μl；

f)注温：40℃

实施例1：易错pcr构建玉米赤霉烯酮降解酶突变体文库和筛选

参考clonostachysrosea来源的玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列(seqidno：1)和其优化后的dna序列(seqidno：2)，人工合成该基因，并在5’端设计ecori限制性酶切位点，3’端设计noti限制性酶切位点。将合成的基因片段，用ecori和noti双酶切，切胶回收，连接到pet-21a(+)载体上，转化大肠杆菌dh5α，氨苄青霉素抗性lb平板筛选阳性克隆，测序验证得到重组载体pet–ymds0，重组菌bl21-ymds0。

用genemorphii随机突变pcr试剂盒以seqidno：2所示的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：

ymds-f：agaattcatgcgcattcgcagcacaat（seqidno：3）；

ymds-r：agcggccgctcaaagatacttctgcgtag（seqidno：4）；

下划线处分别为ecori和noti酶切位点。

pcr反应条件为：94°c预变性3min，94°c变性30s，55°c退火60s和72°c延伸5min，共30个循环。

将扩增好的pcr产物用ecori和noti双酶切，纯化回收后连接到pet-21a(+)载体上，转化大肠杆菌bl21-de3，涂布于氨苄青霉素抗性lb平板上，筛选阳性克隆，得到多个重组载体pet-ymdsx和重组菌株bl21-ymdsx，分别进行编号。

将上述筛选得到的阳性重组菌株bl21-ymdsx的单菌落接种到96孔深孔板，每个平板同时接入2个重组菌株bl21-ymds0（表达ymds0）的单菌落作为对照。每孔装入300μllb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50μl菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200μl含有iptg的lb-amp培养基，使iptg终浓度为1mm，氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达玉米赤霉烯酮降解酶；将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，上清液即为粗酶液，备用。

通过hplc方法测定玉米赤霉烯酮降解酶酶活力，发现3株玉米赤霉烯酮降解酶突变体的酶活力明显提高。将突变体进行基因测序，得到了以ymds0为出发模板的、分别含i3k、g23e、v251a单突变的突变体，依次命名为ymds01、ymds02、ymds03。ymds01的氨基酸序列如seqidno：5所示，其编码基因的核苷酸序列如seqidno：6所示；ymds02的氨基酸序列如seqidno：7所示，其编码基因的核苷酸序列如seqidno：8所示；ymds03的氨基酸序列如seqidno：9所示，其编码基因的核苷酸序列如seqidno：10所示。

实施例2：玉米赤霉烯酮降解酶突变体在毕赤酵母gs115中的表达

将人工合成的基因ymds0和实施例1中筛选到的玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01、ymds02、ymds03构建到ppic9k质粒上，得到各突变体在毕赤酵母中的表达载体ppic-ymds0、ppic-ymds01、ppic-ymds02、ppic-ymds03；将各突变体的表达载体用sali酶切线性化后电转入毕赤酵母gs115中，md平板筛选得到各突变体表达菌株的转化子并转接到ypd平板中活化。

挑取活化后的转化子接于bmgy培养基中，30℃振荡培养18h后，离心获得菌体。将适量菌体转入bmmy培养基中，使菌体浓度达到od600=1，继续振荡培养，每24h添加培养体积1%的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，通过sds-page，每种突变体选取蛋白表达量较高，即条带较深的转化子，可以认为酶活力较高的转化子，进行菌种保藏和30l罐发酵。

实施例3：玉米赤霉烯酮降解酶突变体在30l发酵罐中发酵和制备

将保种于甘油管中的毕赤酵母划线于ypd平板上，30℃倒置培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在ypd平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于50mlbmgy培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2%的接种量接种到1000mlbmgy培养基中，30℃、200rpm培养至od600为5，用作种子液接种发酵罐。

发酵生产工艺：bsm培养基，ph4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20%以上。

发酵过程分为三个阶段：（1）菌体培养阶段：按8%比例接入种子液，30℃培养20~24h，使发酵液中甘油耗尽；（2）饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80%饥饿阶段结束；（3）诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节ph至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，诱导时间为160~200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，用于酶活力、酶学性质和应用测试。

酶活力测定结果如图1：突变体ymds01，ymds02和ymds03的酶活力比原始玉米赤霉烯酮降解酶分别提高了35.5%、22.4%和18.5%，也说明了这些突变体对玉米赤霉烯酮的降解能力得到明显的提高。

实施例4：玉米赤霉烯酮降解酶突变体酶学性质评价

按照常规方法对实施例3中得到的各突变体的粗酶液，进行酶学性质测定。

（1）最适反应温度：分别在20℃，30℃，40℃，45℃，50℃，60℃下进行反应并用hplc方法检测酶活力；

（2）最适反应ph：分别在ph2.0，ph3.0，ph4.0，ph5.0，ph6.0，ph7.0，ph7.5，ph8.0，ph8.5，ph9.0，ph10.0下进行反应并用hplc方法检测酶活力；

（3）ph耐受性实验：分别将各粗酶液在不同ph下于37℃处理120min，再进行残余酶活力检测；

（4）热稳定性：分别在50℃，55℃，60℃下将各粗酶液处理1min后，再进行残余酶活力检测；

（5）胰蛋白酶耐受性：分别在ph6.8buffer和ph6.8buffer+胰蛋白酶条件下，37℃处理4h后，再进行残余酶活力检测。

结果表明：突变体ymds01，ymds02、ymds03和原始基因ymds0的酶学性质基本一致；最适反应温度为45℃，在35-50℃范围内，相对酶活力在80%以上；最适反应ph8.0-8.5；ph耐受性，在ph6-9能保持较高酶活，当ph＜6时酶活急剧减少，ph＞10酶活降低至50%以下；热稳定性，在50℃处理1min，剩余酶活力为83%，60℃处理1min，剩余酶活力30%；经过胰蛋白酶处理4h后完全失活，说明可以完全在动物体内消化，不会残留。

实施例5：玉米赤霉烯酮降解酶突变体ymds01应用实验

1、玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米皮粉：

实验条件：25g玉米皮粉加入20ml水后再加入5ml酶液（酶活40u/ml）氢氧化钠缓冲液调节ph8.0，37℃处理不同时间，hplc检测玉米赤霉烯酮（zen）剩余含量。

结果如图2所示，玉米赤霉烯酮降解酶将玉米皮粉处理3h，其玉米赤霉烯酮含量由2142ppb下降为258ppb，继续处理3h，玉米赤霉烯酮残余含量仅为113ppb，玉米赤霉烯酮降解酶降解zen效果显著。

2、玉米赤霉烯酮降解酶降解ddgs（干酒糟及其可溶物）：

50g原料（ddgs）加入1400u酶，ph8.0，37℃处理不同时间，hplc检测zen剩余含量。

结果如图3所示：未处理ddgs的zen含量为316ug/kg(0.316ug/ml)；加酶在37℃，ph7.0条件下处理24h，zen降为92ug/kg，低于200ug/kg标准，降解率70.89%；处理48h后zen含量较处理24h后zen含量几无变化。

3、玉米赤霉烯酮降解酶降解酵母培养物

酵母培养物原料组成：酿酒酵母、玉米、玉米浆干粉、玉米胚芽粕、甘蔗糖蜜等。

25g原料加入800u玉米赤霉烯酮降解酶（25g原料加入20ml酶液），ph8.0，37℃处理不同时间，hplc检测zen剩余含量。

结果如图4所示：处理0h，zen含量3732ug/kg；处理48h，zen含量416ug/kg，降解率88.86%；处理72h，zen含量111.6ug/kg，降解率97%；处理96h，zen含量100ug/kg，降解率97.32%。

通过本发明技术方案得到的玉米赤霉烯酮降解酶突变体酶活力比野生型有较大提高，并且对玉米赤霉烯酮降解效果显著，使其在饲料、食品等领域有很好的应用潜力，具有良好的市场应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>青岛根源生物技术集团有限公司

<120>酶活力提高的玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因和应用

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<213>人工序列(artificialsequence)

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glnglypheargvalthrthrpheaspmetproglymetserargser

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65707580

alasertyrvalileservalleuaspalaleuaspilelyshisala

859095

thrvaltrpglycysserserglyalaserthrvalvalalaleuleu

100105110

leuglytyrproaspargileargasnalametcyshisgluleupro

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180185190

proseralaprovallysaspleuglualaleuargglylysproleu

195200205

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210215220

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