植物腺毛特异表达基因HD-9、其表达载体及应用

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种植物腺毛特异表达基因hd-9、其表达载体及应用。
背景技术：
：植物表皮毛是表皮细胞的特化结构，作为植物与环境间的天然屏障，在植物应对环境中生物胁迫及非生物胁迫中发挥重要作用。此外，作为分泌器官，腺毛可以促进重金属外泌，减少重金属在植物体内积累。植物表皮毛的结构和形态多样，由单个至多个细胞组成，依据分泌腺的有无，可分为保护毛(非腺体毛)和腺毛。腺毛可以特异合成和分泌多种次生代谢物，萜类是是腺毛代谢物中最主要的成分。例如，薄荷腺毛中的薄荷醇单萜具有抗炎、镇痛、解热和杀菌等药理作用；青蒿素是黄花蒿在腺毛中合成、积累和分泌的一种倍半萜内酯，以青蒿素为基础的联合用药(acts)是治疗疟疾的一线药物；菊科植物除虫菊的腺毛可以特异合成除虫菊酯，是一种常用的广谱杀虫剂；烟草腺毛可以特异地合成西柏烷双萜烯类化合物，该化合物具有抗真菌和蚜虫活性。已知拟南芥的表皮毛是一种特化的、无腺体的单细胞表皮毛，其形态建成的分子调控模式已被解析。不同于拟南芥，茄科、豆科、菊科、大麻科和唇形科等植物属于多细胞表皮毛。这些物种的表皮毛类型丰富，同时具有保护毛和腺毛。而茄科烟草属植物的表皮毛发达，包括保护毛和腺毛，腺毛约占总表皮毛的85%，腺毛分泌物的含量约占整个叶面化学成分的60%。其中，烟草腺毛属于多细胞结构，由1个基细胞、1～5个柄细胞和1～12腺头细胞组成，包括长柄腺毛、短柄腺毛和保护毛。目前多细胞表皮毛的调控机制尚未解析。近年来多个基因被报道参与腺毛的发育调控。例如，抑制生长素相应因子arf基因参与调控番茄i、v和vi型腺毛的数量；水通道类似蛋白编码基因dialytic参与调控腺毛的开叉；肌动蛋白微丝相关的hairless基因能调控番茄腺毛形态；c2h2锌指结构蛋白hair基因参与番茄和烟草腺毛发育调控；青蒿r2r3myb转录因子aamixta1在幼嫩叶片及分泌型腺毛基细胞中特异表达，与hd-zipiv转录因子aahd8互作调控腺毛发育相关基因aahd1表达，进而促进腺毛的发育。同属于hd-zipiv家族的cd2和wo基因也可以调控腺毛的密度。尽管关于腺毛发育基因的报道日益增多，但是这些基因之间主要集中在调控腺毛的密度，而对于腺毛头部分泌细胞的发育调控（如腺毛类型的调控及腺毛分泌物含量提高等）尚未见报道。技术实现要素：本发明目的在于提供一种能调控腺毛头部分泌细胞发育的植物腺毛特异表达基因hd-9，并利用其表达载体转化植物，以期解决当前缺乏植物腺毛头部分泌细胞发育调控手段的技术问题，进而达到对植物腺毛类型的定向改良和/或提高腺毛分泌物含量的目的。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明基于对烟草hd-zipiv家族成员的长期分析研究，鉴定出一个可以调控腺毛细胞发育的基因hd-9（homeodomain-leucinezipperiv），该基因hd-9的编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别见seqidno.1和seqidno.2。hd-9cds全长为2472bp，编码823个氨基酸和1个终止密码子，具有典型的hox和start保守结构域。向植物腺毛特异表达基因hd-9插入强启动子35s后，得过表达载体，转化受体植物可得过表达植株。基于保守序列设计sgrna引物，构建hd-9基因的crispr/cas9载体，转化受体植物后可获得相关基因敲除株系。在本发明具体研究过程中，基于上述载体通过农杆菌介导法分别转化烟草栽培品种k326，还分别获得了hd-9过表达株系（k326-t）和基因敲除株系（k326-m）。对上述所得不同转基因株系进行腺毛形态观察发现，hd-9过表达株系腺毛的腺毛头体积明显增大，而基因敲除株系中长柄腺毛的腺毛头显著变小，保护毛的密度显著增加。而叶面化学成分检测结果表明，k326、过表达和敲除株系中均含有西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烃；其中，这三种成分在过表达株系中的含量最高，与对照相比k326-t的分泌物总量显著提高；而敲除株系中仅有微量的西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烃。以上结果证明了hd-9对腺毛头分泌细胞的发育起关键的调控作用，具体而言，其在腺毛类型的定向改良（如调控及提高腺毛分泌物含量）中具有重要的应用价值和应用前景。与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：1.本发明筛选、鉴定出了植物腺毛特异表达基因hd-9，基于其过表达和敲除株系的表型和生理特征鉴定、检测研究表明，其能够调控长柄腺毛腺头细胞的发育，具体而言，其在调控增加腺毛分泌物含量、定向改良腺毛类型等方面具有重要的应用价值。2.本发明有利于进一步研究揭示腺毛分泌细胞发育的调控机制，并生产中加以利用。附图说明图1为hd-9的保守域结构分析图。图2为hd-9的组织表达特性分析图。图3为hd-9过表达株系的sourthern杂交分析图。图4为hd-9基因突变体测序的分析图。图5为对照、过表达株系和基因敲除株系的腺毛观察照片。以上图4、图5中，k326为对照，k326-t为过表达株系；k326-m为hd-9基因突变体植株。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的质粒载体如无特别说明，均为常规商业载体；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验检测方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：腺毛特异表达基因hd-9基因的克隆和组织表达分析hd-zipⅳ家族基因广泛参与调控植物表皮毛形成、表皮细胞分化和花青素积累。长期以来，发明人对普通烟草(nicotianatobacum)hd-zipⅳ的各基因成员进行了深入的组织表达特性分析研究，发现hd-9基因在腺毛中特异表达。1.烟草hd-9的分离（1）用trizol提取普通烟草的总rna。（2）反转录cdna：使用primerscriptrtreagentkit（takara，japan）将rna反转录为cdna。（3）hd-9基因的克隆：根据本发明人的前期实验结果，对腺毛特异表达基因hd-9进行克隆，pcr反应条件为95°c5min；95°c40s，58°c50s，72°c3min，35个循环；72°c10min。扩增引物为（见seqidno.3～4）：5'-gaccatttagatagaaaagagtgacc-3'；5'-gttgcacgttaattctcggac-3'。（4）电泳检测：pcr扩增结束后，进行凝胶电泳检测是否扩增到hd-9序列，结果显示约在2400bp的位置有一个明显条带。（5）切胶回收dna：电泳结束后，将hd-9从凝胶中切下，并用dna回收试剂盒进行dna片段回收。（6）载体连接：将回收后dna和pmd19-t载体（takara）进行连接。（7）筛选测序：将连接产物热激转化db3.1菌株，并用氨苄抗性的lb平板进行筛选，提取质粒进行测序分析。2.序列保守域的预测利用在线分析软件prosite(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)进行保守结构域分析。将hd-9的氨基酸序列提交至prosite进行保守结构域分析。结果如图1所示，克隆所得的hd-9基因具有典型的hox和start结构域，属于hd-zipiv家族。3.组织表达特性分析分别采集长势优良的普通烟草品种k326的根部、茎部、叶片、腺毛、刷去腺毛的叶片和花朵。用冻刷法收集腺毛样品：叶片放于液氮中冷冻约5分钟，用毛笔沿着叶片主脉从叶基往叶尖的方向轻轻刷取腺毛。提取样品总rna，反转录合成cdna。以l25作为内参基因，采用半定量rt-pcr方法分析hd-9基因的组织表达特性。扩增引物为（见seqidno.10～13）：hd-9-f:5'-tggtggctgatagtccatacaac-3'；hd-9-r:5'-tggtatttcttttttctggatgatt-3'；l25-f:5'-cccctcaccacagagtctgc-3'；l25-r:ttctaactcctgttgttgtgggaa。pcr反应条件：95°c5min；95°c50s，60°c50s，72°c30s，28个循环；72°c10min。结果如图2所示：hd-9基因在腺毛中的表达量最高，叶片次之，茎部的表达量较弱，而在根部、花和去除腺毛的叶片中无表达。该结果表明hd-9基因为腺毛特异表达基因。实施例二：hd-9基因的过表达株系的获得1.过表达载体的构建烟草hd-9基因（核苷酸序列如seqidno.1所示，表达载体采用pcambia-npt载体）。（1）选用spei和nrui两个酶切位点为连接酶位点，利用如下hd-9克隆引物进行pcr扩增（见seqidno.5～6）：f：5'-aggactagtcaccatttagatagaaaagagtgacc-3'，r：5'-gagatcgcgaaaccttggaatgcaactaacc-3'；下划线标注的酶切位点分别是spei和nrui。pcr反应体系为：2μl基因组dna（100ng/μl）；1μlprimerstardna聚合酶；2μl引物1（10μm）；2μl引物2（10μm）；10μl5×pcr反应buffer；4μldntps（2.5mm）；29μl水；总体积为50μl；反应程序为：94℃预变性3min；94℃20s，65℃20s，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min；16℃保温；（2）电泳检测：pcr扩增结束后，进行凝胶电泳检测是否扩增到hd-9序列，结果显示约在2600bp的位置有一个明显条带；（3）切胶回收启动子dna：电泳结束后，将hd-9从凝胶中切下，并用dna回收试剂盒进行dna片段回收；（4）酶切和灭活：用spei和nrui两个内切酶分别酶切回收后的dna片段和pcambia-npt载体；酶切反应体系为：10uldna（100ng/μl）；1ul限制性内切酶1（15u/μl）；1ul限制性内切酶2（15u/μl）；5ul限制性内切酶反应10×buffer；总体积为50μl；37℃水浴3小时后，80℃灭活5分钟，使内切酶彻底失去活性；（5）切胶回收dna：分别跑凝胶电泳，进行切胶回收hd-9和质粒骨架片段；（6）载体连接：将回收后的载体骨架和酶切后的hd-9进行连接；连接反应体系：1μl载体骨架；3μlhd-9；1μlt4连接酶；1μl10×t4连接酶buffer；4μl水；总体积为10μl；16℃连接过夜；（7）筛选：热激转化db3.1菌株，并用kan抗性的lb平板进行筛选，x选择阳性克隆提取重组载体，命名为35s-hd-9，置于-20℃备用。2.35s-hd-9载体转入gv3101农杆菌（1）将5μl质粒（约500ng）与gv3101农杆菌感受态细胞在冰上静置30min后，转入液氮中冻8min，再转入37℃水浴锅中热激5min；（2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上3～5min后，在28℃摇床中160rmp/min活化2h；（3）将转化后的菌液涂布kan抗性平板中筛选，获得阳性gv3101菌株。3.转基因植株的获得采用叶盘转化法进行农杆菌侵染普通烟草栽培品种k326。利用载体上携带的卡纳抗性基因在含有30mg/lkan的ms抗性培养基上进行转基因植株的筛选。获得t3纯系后利用sourthern杂交检测目标基因在的转化植株中的拷贝数。以514bp的35s启动子序列作探针进行sourthern杂交，结果如图3所示：获得的3个hd-9过表达株系t1，t2，t3均为阳性植株，其中t1中转入2个hd-9拷贝，t2和t3转入1个拷贝；其中t2作为k326-t用于下一步的腺毛观察和分泌物测定。实施例三：hd-9基因敲除植株的获得1.敲除载体的构建根据测序得到的hd-9的基因组序列，首先设计并合成grna靶点序列（见seqidno.7）：ggcccaatgtgcggccattg，下划线标注的pam区，由杭州百格生物技术有限公司完成)。oligo二聚体与crispr/cas9载体进行连接：crispr/cas9载体2.0μl，oligo二聚体1.0μl，enzymemix1.0μl，无菌水h2o补充至10.0μl。连接产物转化大肠杆菌，提取质粒进行测序筛选hd-9-knockout基因编辑载体。2.hd-9-knockout载体转入gv3101农杆菌方法过程同实施例2。3.基因敲除植株的获得采用叶盘转化法进行农杆菌侵染普通烟草栽培品种k326。利用载体上携带的卡纳抗性基因在含有30mg/lkan的ms抗性培养基上进行转基因植株的筛选。4.hd-9突变纯系的筛选为了检测靶标位点的突变情况，在靶标位点两侧设计检测引物（见seqidno.8～9）：f:cgttggagagcaggcaggtgaagtt，r:ccaggcggcattgtaccaggaaaag；对阳性转基因植株基因组dna分别进行扩增。将扩增出的目的条带进行纯化测序，筛选hd-9突变纯系，得k326-m。结果如图4所示：普通烟草k326中存在两种hd-9序列类型，k326-m突变体中两种序列均在sg序列的tgg前插入一个a/t。实施例四：各株系表型和生理特征的鉴定与检测以普通栽培烟草品种k326为对照，以实施例一所构建重组的烟草转基因株系为试验组k326-t，以实施例二所构建重组的烟草hd-9突变纯系为试验组，分别进行腺毛形态观察和叶面化学成分分析。1.腺毛形态观察选择长势一致的7叶龄烟苗，选取15天叶龄的叶片进行腺毛形态观察。将叶片在0.2%(w/v)罗丹明b水溶液中浸染30min，用蒸馏水漂洗三次去除多余染液，使用滤纸吸干表面水分。用剪刀在叶片主脉右侧的第3～4支脉之间随机剪切较为平整的1×1cm叶片方块（数量为15个），叶面朝上置于超景深显微镜（vhx-5000;keyencecorporation,osaka,japan）下进行叶片表面腺毛的形态观察和腺毛密度的统计。结果如图5所示：hd-9过表达株系（k326-t）腺毛的腺毛头体积明显增大，而基因敲除株系（k326-m）中长柄腺毛的腺毛头显著变小，保护毛的密度显著增加。5.叶面化学成分分析选择长势一致的7叶龄烟苗，选取15天叶龄的叶片，避开主脉位置，取直径为10cm的叶圆片20片，采用有机溶剂萃取的方法提取烟叶的叶面化学物质。利用gc/ms进行化学成分的定性和定量分析。表1为腺毛分泌物的测定西柏烷类二萜烷烃糖酯总量k326（ck）28.27±0.81b5.34±0.34b2.53±0.38b36.14±1.53bk326-t40.43±1.05a9.75±0.83a5.45±0.41a55.63±2.29ak326-m0.48±0.06c3.60±0.06c0.01±0.02c4.09±0.14c结果如表1所示：k326、过表达和敲除株系中均含有西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烃；其中过表达株系的三种成分含量最高，与对照相比，k326-t的分泌物总量可以提高50%；敲除株系中仅有微量的西柏烷二萜、蔗糖酯和烷烃。以上结果证明，hd-9在腺毛头分泌细胞的发育中具有关键作用，对于腺毛类型的调控及腺毛分泌物含量的提高具有重要的应用价值。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是，所属
技术领域：
的技术人员能够理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明构思的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>河南农业大学<120>植物腺毛特异表达基因hd-zipiv-9、其表达产物、表达载体及应用<130>/<160>13<170>patentinversion3.2<210>1<211>2472<212>dna<213>烟草<400>1atgagttttggaggcttcattgggagtagtagtagtggtggaaacggcggcggggacggt60ggttctggggtttcaagagtggtggctgatagtccatacaacaacaccatgccccctgct120gctaccattgctcatcaatcacaacaacttgtcacatcacctttaactcagcctatgttt180aactcttctccactctctcttgctcttaaacctaagatggaaggtataggtgacatgggt240ttgataggggaaaattttgatgctgttgcaatgggaaggtcctctagagaggatgaatac300gagagcaggtccggcagtgataacttagatggtggtgcatcgggcgatgaccaggacact360cctcttggtaaatcatccagaaaaaagaaataccataggcacaccccataccaaatccaa420caacttgaagctgcttttaaagagaatccacatcctgatgaaaaagcaagactagaactt480ggtaagagactgacgttggagagcaggcaggtgaagttttggttccaaaatagaagaacc540caaatgaagacccaattggaacgccacgaaaatgcaatcttgaagcaagaaaatgataag600cttcggatagagaacatagcaatgaaggaagccatgagaagcccaatgtgcggccattgt660ggtggtcaggcaattcttggtgagatacacattgaagagcatcatttaaggattgagaat720gctcggctgagagatgaacttaataggatctgtgtcctggcgaataagtttttgggaagg780cctttgggatcttttcctggtacaatgccgcctggaatggctaattctggtttggaactt840gcagtgggaagaaatggctttggtgctatgaactctgttgacactgcattgccaatgggg900cttgattttggcaatggtctctcaagtcctctaacaatgatgtcccctaggcccacccca960agcatgagtaatacagatgtatcctttgataagtccatgttaatggagcttgcgtttgct1020gcgatgaatgagctgcttaagctggccgagattggtgatcctctgtggtttagaaacttt1080gacggaagtggggaagcattgaaccttgaggactatgctaggtcctttcctccatgtatt1140ggcatgaaaccgtccaatttcacgacagaagcaacaaaggcaactggtacagtgatgatc1200aactgtctggccttggtggagactctgatggatacaagtcgatgggtggagatgttctca1260agcattgttggaagaacctcaacaattgatgtgatttccagcagcagcacaagtggaagc1320aggaatggcaatctgcaattgattcaagccgagttccaagttctttctgctttagttcct1380gtccgtcaagtaaagtttctccgcttctgcaagcaacacgctgaaggcgtctgggctgtg1440gtggatgtgtctattgacgcaatccaagaaggttcacaaccacgtgaagctggaaattgc1500aggaggctcccttctggatgtattgtgcaagacttgcctaatggttactccaaggttatt1560tggattgagcacatggaatatgatgagaataccatccacaatttctaccgccctttcatc1620aggtctggccggggctttggtgcccaacggtggattgccaccctgcaaagacaatgcgag1680tgcctggcagtcatcacgtcttctgctgtacccagtggcgatagcgcagttgttagtccc1740agtggtcggagaagtattgcaatgctggctcgacgcattactcgcaacttctgtggtggg1800gtttgtgcaactttttacaagtgggaaccgatccaaacagggaccgcagaagatactaag1860ttgatgatgaggaagagcattggtgaacccggtgagcctcctggtatcgtgttgagtgcc1920accaggaccatctggctgccggtgacacatcaacgtttgtttgacttcctgcgaaatgaa1980caaaccaggagtcaatgggatgtcttgtcccatggtggtcccatgcaccaaatagtacac2040attgccaagggtcaggatcttggcaatagcatctctctctttcgcgctaatgcggctgcc2100agcgatgctaatcaaaatagtatgttgatcttgcaagactcttgcacggatgtatctggt2160tcaattgtagcatatgcagcagttgatactgcagaaatgaatgtcgtgatgagtggtgga2220gattcttcctgcgtggctttcctgccatctggatttgcaatagttccagattgttttcaa2280aattctaacaacggaatgcttgaaaaagaggacaatgggggtagcagtaacgggtctttg2340ttgacgttgggattccaaatattggtgaatagcttgccagcagcaaagctcactatggag2400tcggtcgacaccgttaatgcactcatctcacgtacacttcagggtataaaaactgctttc2460cagtgcaattaa2472<210>2<211>823<212>prt<213>烟草<400>2metserpheglyglypheileglyserserserserglyglyasngly151015glyglyaspglyglyserglyvalserargvalvalalaaspserpro202530tyrasnasnthrmetproproalaalathrilealahisglnsergln354045glnleuvalthrserproleuthrglnprometpheasnserserpro505560leuserleualaleulysprolysmetgluglyileglyaspmetgly65707580leuileglygluasnpheaspalavalalametglyargserserarg859095gluaspglutyrgluserargserglyseraspasnleuaspglygly100105110alaserglyaspaspglnaspthrproleuglylysserserarglys115120125lyslystyrhisarghisthrprotyrglnileglnglnleugluala130135140alaphelysgluasnprohisproaspglulysalaargleugluleu145150155160glylysargleuthrleugluserargglnvallysphetrpphegln165170175asnargargthrglnmetlysthrglnleugluarghisgluasnala180185190ileleulysglngluasnasplysleuargilegluasnilealamet195200205lysglualametargserprometcysglyhiscysglyglyglnala210215220ileleuglygluilehisileglugluhishisleuargilegluasn225230235240alaargleuargaspgluleuasnargilecysvalleualaasnlys245250255pheleuglyargproleuglyserpheproglythrmetproprogly260265270metalaasnserglyleugluleualavalglyargasnglyphegly275280285alametasnservalaspthralaleuprometglyleuaspphegly290295300asnglyleuserserproleuthrmetmetserproargprothrpro305310315320sermetserasnthraspvalserpheasplyssermetleumetglu325330335leualaphealaalametasngluleuleulysleualagluilegly340345350aspproleutrppheargasnpheaspglyserglyglualaleuasn355360365leugluasptyralaargserpheproprocysileglymetlyspro370375380serasnphethrthrglualathrlysalathrglythrvalmetile385390395400asncysleualaleuvalgluthrleumetaspthrserargtrpval405410415glumetpheserserilevalglyargthrserthrileaspvalile420425430serserserserthrserglyserargasnglyasnleuglnleuile435440445glnalaglupheglnvalleuseralaleuvalprovalargglnval450455460lyspheleuargphecyslysglnhisalagluglyvaltrpalaval465470475480valaspvalserileaspalaileglngluglyserglnproargglu485490495alaglyasncysargargleuproserglycysilevalglnaspleu500505510proasnglytyrserlysvaliletrpilegluhismetglutyrasp515520525gluasnthrilehisasnphetyrargpropheileargserglyarg530535540glypheglyalaglnargtrpilealathrleuglnargglncysglu545550555560cysleualavalilethrserseralavalproserglyaspserala565570575valvalserproserglyargargserilealametleualaargarg580585590ilethrargasnphecysglyglyvalcysalathrphetyrlystrp595600605gluproileglnthrglythralagluaspthrlysleumetmetarg610615620lysserileglygluproglygluproproglyilevalleuserala625630635640thrargthriletrpleuprovalthrhisglnargleupheaspphe645650655leuargasngluglnthrargserglntrpaspvalleuserhisgly660665670glypromethisglnilevalhisilealalysglyglnaspleugly675680685asnserileserleupheargalaasnalaalaalaseraspalaasn690695700glnasnsermetleuileleuglnaspsercysthraspvalsergly705710715720serilevalalatyralaalavalaspthralaglumetasnvalval725730735metserglyglyaspsersercysvalalapheleuproserglyphe740745750alailevalproaspcyspheglnasnserasnasnglymetleuglu755760765lysgluaspasnglyglyserserasnglyserleuleuthrleugly770775780pheglnileleuvalasnserleuproalaalalysleuthrmetglu785790795800servalaspthrvalasnalaleuileserargthrleuglnglyile805810815lysthralapheglncysasn820<210>3<211>26<212>dna<213>人工引物<400>3gaccatttagatagaaaagagtgacc26<210>4<211>21<212>dna<213>人工引物<400>4gttgcacgttaattctcggac21<210>5<211>35<212>dna<213>人工引物<400>5aggactagtcaccatttagatagaaaagagtgacc35<210>6<211>31<212>dna<213>人工引物<400>6gagatcgcgaaaccttggaatgcaactaacc31<210>7<211>20<212>dna<213>人工引物<400>7ggcccaatgtgcggccattg20<210>8<211>25<212>dna<213>人工引物<400>8cgttggagagcaggcaggtgaagtt25<210>9<211>25<212>dna<213>人工引物<400>9ccaggcggcattgtaccaggaaaag25<210>10<211>23<212>dna<213>人工引物<400>10tggtggctgatagtccatacaac23<210>11<211>25<212>dna<213>人工引物<400>11tggtatttcttttttctggatgatt25<210>12<211>20<212>dna<213>人工引物<400>12cccctcaccacagagtctgc20<210>13<211>24<212>dna<213>人工引物<400>13ttctaactcctgttgttgtgggaa24当前第1页12