一种无痕修复组织损伤的罗非鱼胶原海绵及其制备方法与流程

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种无痕修复组织损伤的罗非鱼胶原海绵及其制备方法。

背景技术：

胶原蛋白是一种新型组织工程材料，具有促进细胞粘附和生长、胶原合成、肉芽生长以及上调各种生长因子的作用，能够加快伤口的愈合，在伤口愈合过程中可以起到暂时性屏障作用，避免伤口感染，为创面愈合提供有利的环境从而加快伤口愈合，在临床上得到广泛应用。胶原蛋白与传统敷料相比，胶原蛋白膜机械强度好，质地柔软，能与伤口紧密贴合，促进血管新生和肉芽组织生长，加速胶原沉积，同时因其良好的低免疫原性、生物相容性和可生物降解性，可明显提高伤口愈合率，并减少伤口色素沉积和疤痕的产生。

技术实现要素：

本发明的第一目的是，提供一种罗非鱼皮胶原蛋白。

本发明的第二目的是，提供一种罗非鱼胶原海绵。

本发明的第三目的是，提供上述罗非鱼胶原海绵的制备方法。

本发明的第四目的是，提供上述罗非鱼皮胶原蛋白或者罗非鱼胶原海绵在无痕修复组织损伤方面的应用。

为实现上述第一目的，本发明采用如下技术方案：一种罗非鱼皮胶原蛋白，为i型胶原蛋白，含两条α链(130kd)和一条β链(116kd)。

为实现上述第二目的，本发明采用如下技术方案：一种罗非鱼胶原海绵呈纤维网状结构，且横截面具有相互连接的网孔，经上述罗非鱼皮胶原蛋白冷冻干燥得到。

为实现上述第三目的，本发明采用如下技术方案：上述罗非鱼胶原海绵通过酶法提取和酸法提取制备得到，所述酶法提取过程包括将罗非鱼皮经过酸和酶混合浸提、透析和冷冻干燥的步骤，所述酸法提取过程包括将罗非鱼皮经过匀浆、碱溶酸沉浸提、透析和冷冻干燥的步骤。

根据本发明的一实施例，所述罗非鱼胶原海绵的酶法提取过程包括：罗非鱼的鱼皮在0.5mol/l乙酸和胃蛋白酶中浸提72h，提取物在4℃和10000r/min条件下离心30min，透析48h，冷冻干燥。

根据本发明的一实施例，所述罗非鱼胶原海绵的酸法提取过程包括：罗非鱼的鱼皮匀浆，在0.1mol/l的naoh中浸泡48h，饮用水浸泡24h；在0.5mol/l的乙酸中浸提72h后，在4℃和10000r/min的条件下离心30min，然后添加nacl后沉淀物重新溶解在0.5mol/l乙酸中之后透析24h，冷冻干燥。

根据本发明的一实施例，所述冷冻干燥的过程包括-80至-50℃的冰箱冷冻8h以上，然后在真空度接近0的条件下冷冻干燥。

为实现上述第四目的，本发明采用如下技术方案：上述罗非鱼皮胶原蛋白或者罗非鱼胶原海绵在无痕修复组织损伤方面的应用。

根据本发明的一实施例，所述罗非鱼皮胶原蛋白或者罗非鱼胶原海绵用作促进伤口愈合的医学敷料。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次以酶法或酸法从罗非鱼皮中提取胶原蛋白，其冷冻干燥后得到罗非鱼胶原海绵，通过伤口的愈合率、愈合时间、总蛋白含量、羟脯氨酸含量、病理组织切片和免疫组化分析为指标评价罗非鱼胶原海绵的促愈合作用，填补罗非鱼皮胶原蛋白或者罗非鱼胶原海绵的研究空白。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为罗非鱼皮胶原蛋白样品的sds-page图。

图2为罗非鱼皮胶原蛋白样品的扫描电镜图。

图3为罗非鱼皮胶原蛋白对大鼠伤口愈合率的影响。

图4为罗非鱼皮胶原蛋白和罗非鱼胶原海绵对sd大鼠皮肤伤口组织常规病理变化的影响。

图5为罗非鱼皮胶原蛋白和罗非鱼胶原海绵对sd大鼠皮肤伤口组织中fgf表达的影响。

具体实施方式

下面通过具体实例和附图，对本发明的技术方案做进一步的菌体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本发明，并不用于限定本发明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员咋没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实例中所用罗非鱼为芦潮港购入鲜罗非鱼。

实施例1

采用酶法提取罗非鱼皮胶原蛋白，具体提取步骤如下：

(1)罗非鱼鱼皮4℃条件在0.5mol/l乙酸和胃蛋白酶中浸提72h；

(2)提取物在4℃下10000r/min离心30min；

(3)透析48h；

(4)获得罗非鱼皮酶溶性胶原蛋白(pepsinsolublecollagenpeptidefromtilapiaskin,psct)。

实施例2

采用酸法提取罗非鱼皮胶原蛋白，具体提取步骤如下：

(1)罗非鱼皮匀浆后在0.1mol/lnaoh中浸泡48h；

(2)饮用水浸泡24h；

(3)0.5mol/l乙酸中浸提72h；

(4)4℃下10000r/min离心30min；

(5)添加nacl后沉淀物重新溶解在0.5mol/l乙酸中；

(6)透析24h；

(7)获得罗非鱼皮酸溶性胶原蛋白(acidsolublecollagenpeptidefromtilapiaskin,asct)。

实施例3

采用实施例1中psct或者实施例2中asct制备罗非鱼皮胶原海绵，具体步骤如下：

(1)配置1.2-3.1％的psct或者asct的罗非鱼皮胶原蛋白水溶液；

(2)罗非鱼皮胶原蛋白水溶液倾倒入长宽为5-6cm×9-10cm的玻璃容器，液体高度为0.5-1cm；

(3)-80至-50℃的冰箱冷冻8h以上；

(4)采用真空冷冻干燥机真空度接近0的条件冷冻干燥，获得psct海绵或者asct海绵。

效果例1：sds-page分析

运用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测罗非鱼皮胶原蛋白的分子质量，如图1所示，其中，m为高分子质量marker，1为1.11mg/ml罗非鱼皮胶原蛋白，2为3.33mg/ml罗非鱼皮胶原蛋白。由图可以看出，罗非鱼皮胶原蛋白含两条α链(130kd)和一条β链(116kd)，证明其为i型胶原蛋白。

效果例2：罗非鱼胶原海绵扫描电镜观察分析

扫描电镜分析罗非鱼胶原海绵的形貌：用d-hank’s液小心洗涤样品，以2％戊二醛和1％锇酸4℃固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，以确保样品中不存在水，并将其放置在用于碳溅射镀膜的碳抽头样品架中后离子溅射仪喷金，通过扫描电镜观察罗非鱼胶原海绵的表面及纤维结构，分别观察横纵切面，放大倍数为10k和20k。如图2所示，在10.00k放大倍数下，罗非鱼i型胶原蛋白sem结果显示胶原纤维排列紧密有序，胶原蛋白形成的胶原纤维也较有序，呈现出原纤维为主的网络，具有完整的结构。胶原蛋白的微观结构变化与功能特性有关。sem图像显示罗非鱼i型胶原蛋白的横截面具有相互连接的网络孔构型，胶原蛋白的纤维网状结构保留较完整，适合作为生物医学材料。

效果例3：创面愈合时间和愈合率测定

观察伤口愈合情况，将致伤当天记为0天，记录创面愈合时间。测量第3、7、10、14天创面的面积，将创面描记在半透明纸上，再描绘到网格纸上进行分析，计算愈合率，愈合率(％)＝(原始创面面积一愈合创面面积)/原始创面面积×100％，如表1所示，给药后各时间点，实验组创面愈合率明显高于纱布组(p<0.05，p<0.05)。伤后3d，psct和asct组伤口愈合率显著高于邦迪组和纱布组；伤后7d，psct和asct组愈合率较高，asct组显著高于其他各组，愈合率高达85.37％±2.82％；伤后10d，各实验组愈合率显著高于纱布组，各组之间无显著性差异；伤后14d，各组创面全部愈合。

表1：胶原蛋白对大鼠伤口愈合率的影响(n＝5)

伤口愈合的目的是快速恢复组织的正常功能，包括细胞的分化与迁移、组织的再生和血管的形成等。伤口愈合情况如图3所示，随着时间的延长，各处理组中sd大鼠皮肤创伤面积均逐渐缩小，伤口愈合率呈升高趋势，14d时全部愈合。致伤后第3d，各组伤口均略有收缩，肉眼观察psct和asct组的大鼠胶原蛋白略有吸收，伤口面积明显小于对照组和邦迪组；术后7d，各组伤口进一步缩小，伤口结痂；术后10d，各实验组伤口逐渐缩小，纱布组伤口略大，伤口周围毛发开始生长；术后14d，创面上的血痂脱落，伤口完全愈合，psct和asct组的大鼠伤口表面光滑且无色素沉着。

实验结果显示，psct、asct能够较快的促进伤口的愈合，缩短愈合时间，且伤口组织中蛋白质和羟脯氨酸的含量明显高于纱布组，并略高于邦迪组。

效果例4：he染色结果分析

分别于创伤后第3、7、14天，各组处死3只大鼠。取创面皮肤约1/2置于福尔马林溶液中固定24h，将固定后的皮肤组织在浓度梯度酒精脱水，经70％酒精→80％酒精→90％酒精→95％酒精a→95％酒精b→100％酒精a→100％酒精b，皮肤组织在酒精中脱水时间均为1h，脱水后用二甲苯透明2次，皮肤组织浸蜡两次后包埋，包埋的蜡块于4℃冰箱保存过夜后切片机切片，片厚5um。用二甲苯和酒精梯度脱蜡后，用苏木素染色5min，之后用水冲洗，用1％氨水返蓝后再水洗，伊红染色3min后水洗，再经80％酒精→95％酒精→100％酒精a→100％酒精b→二甲苯：无水乙醇1：1→二甲苯a→二甲苯b的顺序脱水后，用中性树脂胶进行封片后在显微镜下观察。

如图4所示，伤后3d，纱布组伤口组织中有大量炎性细胞浸润，没有观察到胶原纤维和成纤维细胞生长；邦迪组伤口组织中有大量炎性细胞浸润，有少量胶原纤维和成纤维细胞生长，少量血管形成；psct和asct组有大量炎性细胞浸润，有大量胶原纤维和成纤维细胞生长，有少量血管形成。伤后7d，纱布组伤口组织中有大量炎性细胞浸润，有大量胶原纤维和成纤维细胞生成，表皮组织逐渐形成；邦迪组有少量炎性细胞浸润，有大量成纤维细胞和胶原纤维生长，有少量皮肤附属器产生少量，表皮组织生成；psct和asct组有少量炎症浸润，且成纤维细胞排列整齐，胶原纤维生长，有大量皮肤附属器产生，表皮组织逐渐形成。伤后14d，纱布组仍有炎性细胞浸润，有大量胶原纤维和成纤维细胞生成，并有大量皮肤附属器和表皮组织生成；邦迪组仍有少量炎性细胞浸润，有大量有序密集的胶原纤维和成纤维细胞生成，有大量皮肤附属器产生，表皮组织逐渐形成；psct和asct组只有极少量的炎症细胞，有大量有序密集的胶原纤维和成纤维细胞生成，并有大量的皮肤附属器产生，表皮组织基本形成。

he染色结果表明，psct、asct能够较好的减少伤口中的炎症反应，促进成纤维细胞增值，加速胶原纤维形成和胶原沉积，促进肉芽组织生成和再上皮化，从而加速皮肤伤口愈合。

效果例5：免疫组化染色结果分析

分别于创伤后第3、7、14天，各组处死3只大鼠，取创面皮肤约1/2置于中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，包埋的蜡块于4℃冰箱保存过夜后切片机切片，片厚5um，按下面步骤进行操作：烤片→二甲苯脱蜡→酒精梯度脱水→3％h2o237℃孵育10min→pbs冲洗→0.01m枸橼酸缓冲液煮沸→pbs冲洗→滴加山羊血清→一抗→二抗→染色→封片观察。

fgf是纤维母细胞生长因子,可以加速成纤维细胞的迁移和增殖血管化。efgf在伤口愈合过程中起着非常重要的作用。如图5所示，随着治疗时间的延长,对照组fgf的表达均呈增长趋势,邦迪组fgf的表达呈出先增加后减少的趋势,psct和asct组fgf的表达显示下降的趋势。第3天和第7天，psct和asct组fgf的表达高于纱布组和邦迪组。综合病理切片分析，罗非鱼胶原海绵填充后，能够促进伤口愈合，有效地止血并防止淤血、血肿情况发生，具有良好的组织相容性，体内可自行降解，不会引起机体炎性反应。

免疫组化染色表明，psct和asct通过在愈合过程中上调egf、fgf、cd31的水平，从而提高sd大鼠皮肤伤口的愈合速度和愈合质量。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。