技术领域：
本发明涉及微生物菌剂的应用技术领域，具体涉及一种拮抗烟草疫霉菌的生防菌菌株及其菌剂的田间扩繁方法和应用。
背景技术：
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木霉属(trichoderma)真菌的许多种类为菌寄生菌，可寄生至少18个属29种病原真菌，是防治植物真菌病害常用的生防菌，在生物农药、微生物菌剂产品开发中广泛应用。木霉菌拮抗病原真菌的主要机制包括：竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导宿主抗性等(胡娴等，2019)。此外，木霉菌还具有适应性强、增殖力强、养分利用率高、改良根际能力强、促进植物生长效果好等特点，在土壤修复、病害防治、促进植物生长等方面均得到广泛应用。
木霉菌在多种植物病害防控方面已表现良好的应用前景。张丽荣等(2018)从不同作物根际土壤分离得到22株木霉，出6株对西瓜枯萎病菌(fusarium)具有较强拮抗能力，抑菌率在76.92％以上。彭阁等(2018)从植烟土壤中筛选的里氏木霉(t.reesei)zp2-1菌株对烟草黑胫病对烟草黑胫病田间防治效果达59.50％。徐沛东等(2017)报道用棘孢木霉菌(t.asperellum)做成的可湿性粉剂对辣椒疫病防效高于化学农药50％烯酰吗啉。常媛等(2017)在园林植物八宝景天根际土壤中分离得到一株长枝木霉(t.longibrachiatum)t1-70，对核盘菌的抑菌率最高为77.71％。刘佳等(2020)报道长枝木霉t6菌株对美洲南瓜枯萎病的室内盆栽防效为69.06％。然而，“防效不高、防效不稳、使用成本高”仍然是制约木霉菌剂产业化推广应用亟待解决的难题。究其原因，主要包括：(1)目前市场上的木霉菌剂的主效成分为分生孢子，尽管分生孢子容易通过液体发酵大量生产，但贮存时间短，产孢活性不高(李秀明等，2013)。(2)目前木霉菌剂的常规田间使用量1-3公斤/亩，稀释到20厘米左右的耕作层土壤中可谓沧海一粟，加之受土壤理化性质、土壤微生物的营养竞争与空间竞争等因素的影响，木霉菌很难在土壤中占优势种群，其防效可想而知。(3)木霉菌剂孢子含量在5亿/克的产品平均价格在70元/公斤左右，在不能保证防效的情况下此成本目前很难被用户接受。
烟草黑胫病是由烟草疫霉菌(phytophthoranicotianae)侵染引起，是烤烟种植中的头号病害。本发明人在研究烟草黑胫病的生物防治中，筛选到一株长枝木霉pe02菌株，该菌株能高效拮抗烟草疫霉菌的生防菌，极具应用价值。本发明针对木霉菌剂“防效不高、防效不稳、使用成本高”的现有技术难题，提供一种长枝木霉田间简易扩繁方法及防控烟草黑胫病的技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有木霉菌剂技术之不足，而提供一种对人畜安全的拮抗烟草疫霉菌的生防菌菌株及其菌剂的田间扩繁方法和应用。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的以烟草疫霉菌为靶标，采用生防真菌传统分离筛选方法，从采自云南省普洱市宁洱县的植烟土壤中获得了一株长枝木霉t.longibrachiatumpe02菌株，该菌株对烟草疫霉菌的菌丝生长有较强的拮抗性。该菌株为拮抗烟草疫霉菌的生防菌；保藏名称为长枝木霉pe02(trichodermalongibrachiatumpe02)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2020年12月12日；保藏编号:cctccno.m2020784。
进一步地，该t.longibrachiatumpe02菌株在培养真菌的常规培养基pda上28℃培养5d时菌落边缘整齐，直径6.5-7.2cm，初为白色，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状；2-3d后形成产生分生孢子的绿色同心环，生长新区的产孢簇为白色，靠近老区的产孢簇一部分由白色渐变为绿色，接种点周围全部被绿色孢子覆盖，整个菌落表明成毛毡状，菌丝分隔，分枝，直径2.8-3.5μm，厚垣孢子顶生或间生，圆形或椭圆形，大小为3.8-5.5μm×4.5-11.5μm，分生孢子单细胞、椭圆形、绿色，大小为1.8-3.2μm×2.1-5.8μm。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌的生防菌菌株制备的拮抗烟草疫霉菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的拮抗烟草疫霉菌的发酵培养物；
(b)所述的拮抗烟草疫霉菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的拮抗烟草疫霉菌细胞的超声裂解沉淀。
进一步地，经田间液态扩繁或固态扩繁后使用。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌菌剂田间液态扩繁方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养基配方及配制：蔗糖15％、糖蜜30％、酵母粉35％、甘油10％、磷酸二氢钾8％和硫酸镁2％，按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀；
(2)培养基的灭菌方法：在田间以蓄水池或塑料桶为发酵容器，将培养基与自来水按质量比为1:500的比例混合，搅拌时间为10-20min，让培养基成分充分溶解；将消毒剂二氯异氰尿酸钠(纯度99％)与培养基按质量比为1:1000的比例加入，搅拌10min后用塑料薄膜覆盖和密闭容器，静置时间为48-72h；
(3)长枝木霉pe02菌剂的液体扩繁：按培养基:菌剂(v:v)＝1000:1的比例加入本发明制备的长枝木霉pe02菌剂，搅拌均匀后静置，静置时间为7-10d，期间每24h搅拌一次。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌菌剂田间固体扩繁方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养基配方及配制：麸皮35％、稻壳粉25％、玉米粉25％、糖蜜10％、硫酸铵1％、黄豆饼粉2.5％和碳酸钙1.5％，按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀；
(2)培养基的灭菌方法：在田间的塑料大棚或空地中，将发酵培养基倒如塑料袋中，将消毒剂碳酸氢铵(纯度99％)与培养基按质量比为1:250的比例加入，混合均匀后用自来水将发酵基质的水分含量调节到40-55％之间，系紧塑料袋口以防止氨气大量泄漏，放置时间为2-3d后，培养基中的绝大部分微生物已被碳酸氢铵产生的氨气所杀灭；
(3)长枝木霉pe02菌剂的固态扩繁：将灭菌后的基质倒在塑料薄膜上，翻动2-3次后静置30-60min，待基质中的氨气充分挥发殆尽后，按培养基:菌剂(v:v)＝300:1的比例，加入本发明制备的长枝木霉pe02菌剂，搅拌均匀后静置，静置时间为15-20d，从第5d起，每2d翻动基质一次。
本发明所述的长枝木霉trichodermalongibrachiatumpe02菌株在制备防治烟草黑胫病的制剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、利用pe02菌株制备的菌剂按照本发明的田间扩繁方法能大量提高pe02菌株的生物量，对烟草黑胫病的防效在65％以上，且具有无残留、对人畜安全的特点。
2、利用pe02菌株制备的菌剂按照本发明的田间扩繁方法培养后，与常规使用方法相比，使用成本能降低30％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
本发明的一株拮抗烟草疫霉菌的生防菌菌株，该菌株为拮抗烟草疫霉菌的生防菌；保藏名称为长枝木霉pe02(trichodermalongibrachiatumpe02)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2020年12月12日；保藏编号:cctccno.m2020784。
该t.longibrachiatumpe02菌株在培养真菌的常规培养基pda上28℃培养5d时菌落边缘整齐，直径6.5-7.2cm，初为白色，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状；2-3d后形成产生分生孢子的绿色同心环，生长新区的产孢簇为白色，靠近老区的产孢簇一部分由白色渐变为绿色，接种点周围全部被绿色孢子覆盖，整个菌落表明成毛毡状，菌丝分隔，分枝，直径2.8-3.5μm，厚垣孢子顶生或间生，圆形或椭圆形，大小为3.8-5.5μm×4.5-11.5μm，分生孢子单细胞、椭圆形、绿色，大小为1.8-3.2μm×2.1-5.8μm。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌的生防菌菌株制备的拮抗烟草疫霉菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的拮抗烟草疫霉菌的发酵培养物；
(b)所述的拮抗烟草疫霉菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的拮抗烟草疫霉菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌菌剂田间液态扩繁方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养基配方及配制：蔗糖15％、糖蜜30％、酵母粉35％、甘油10％、磷酸二氢钾8％和硫酸镁2％，按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀；
(2)培养基的灭菌方法：在田间以蓄水池或塑料桶为发酵容器，将培养基与自来水按质量比为1:500的比例混合，搅拌时间为10-20min，让培养基成分充分溶解；将消毒剂二氯异氰尿酸钠(纯度99％)与培养基按质量比为1:1000的比例加入，搅拌10min后用塑料薄膜覆盖和密闭容器，静置时间为48-72h；
(3)长枝木霉pe02菌剂的液体扩繁：按培养基:菌剂(v:v)＝1000:1的比例加入本发明制备的长枝木霉pe02菌剂，搅拌均匀后静置，静置时间为7-10d，期间每24h搅拌一次。
本发明所述的拮抗烟草疫霉菌菌剂田间固体扩繁方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养基配方及配制：麸皮35％、稻壳粉25％、玉米粉25％、糖蜜10％、硫酸铵1％、黄豆饼粉2.5％和碳酸钙1.5％，按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀；
(2)培养基的灭菌方法：在田间的塑料大棚或空地中，将发酵培养基倒如塑料袋中，将消毒剂碳酸氢铵(纯度99％)与培养基按质量比为1:250的比例加入，混合均匀后用自来水将发酵基质的水分含量调节到40-55％之间，系紧塑料袋口以防止氨气大量泄漏，放置时间为2-3d后，培养基中的绝大部分微生物已被碳酸氢铵产生的氨气所杀灭；
(3)长枝木霉pe02菌剂的固态扩繁：将灭菌后的基质倒在塑料薄膜上，翻动2-3次后静置30-60min，待基质中的氨气充分挥发殆尽后，按培养基:菌剂(v:v)＝300:1的比例，加入本发明制备的长枝木霉pe02菌剂，搅拌均匀后静置，静置时间为15-20d，从第5d起，每2d翻动基质一次。
本发明所述的长枝木霉trichodermalongibrachiatumpe02菌株在制备防治烟草黑胫病的制剂中的应用。
试验例1
1.本发明中pe02菌株的培养及菌剂制备
pe02菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到pda培养基斜面上，20-30℃下培养3-5d后获得斜面种子，适宜的培养条件是28℃下培养4d。
pe02菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的pda液体培养基中，在20-30℃、100-180rpm条件下摇床培养3-5d。最适培养条件为28℃，150rpm条件下培养4d。
pe02菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％-5％(v/v)的比例接入发酵罐中的pda液体培养基中，在50-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度26-28℃，搅拌速度150-200rpm，发酵时间4-5d。
pe02菌株的菌剂制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的玉米淀粉混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。菌剂中pe02菌株分生孢子活菌数含量在2.5×109个/克以上。
2.本发明菌剂的田间液态扩繁方法
发酵培养基配方及配制：蔗糖15％，糖蜜30％，酵母粉35％，甘油10％，磷酸二氢钾8％，硫酸镁2％。按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀即可。
培养基的灭菌方法：在田间以蓄水池或塑料桶为发酵容器，将培养基与自来水按质量比为1:500的比例混合，搅拌10-20min，让培养基成分充分溶解；将消毒剂二氯异氰尿酸钠(纯度99％)与培养基按质量比为1:1000的比例加入，搅拌10min后用塑料薄膜覆盖和密闭容器，静置48-72h即可。
pe02菌剂的液体扩繁：按培养基:菌剂(v:v)＝1000:1的比例加入本发明制备的pe02菌剂，搅拌均匀后静置7-10d，期间每24h搅拌一次。按此扩繁方法获得的发酵液中pe02菌株的分生孢子含量可达1×107个/克以上。
3.本发明菌剂的田间固态扩繁方法
发酵培养基配方及配制：麸皮35％，稻壳粉25％，玉米粉25％，糖蜜10％，硫酸铵1％，黄豆饼粉2.5％、碳酸钙1.5％。按各组分在培养基配方中的质量百分比称取，混合均匀即可。
培养基的灭菌方法：在田间的塑料大棚或空地中，将发酵培养基倒如塑料袋中，将消毒剂碳酸氢铵(纯度99％)与培养基按质量比为1:250的比例加入，混合均匀后用自来水将发酵基质的水分含量调节到40-55％之间，系紧塑料袋口以防止氨气大量泄漏，放置2-3d后，培养基中的绝大部分微生物已被碳酸氢铵产生的氨气所杀灭。
pe02菌剂的固态扩繁：将灭菌后的基质倒在塑料薄膜上，翻动2-3次后静置30-60min，待基质中的氨气充分挥发殆尽后，按培养基:菌剂(v:v)＝300:1的比例加入本发明制备的pe02菌剂，搅拌均匀后静置15-20d，从第5d起，每2d翻动基质一次。按此扩繁方法获得的发酵基质中pe02菌株的分生孢子含量可达1×107个/克以上。
4.本发明的pe02菌剂及田间扩繁技术对烟草黑胫病的防效及使用成本
供试药剂：pe02菌剂，活菌数含量为2.5×109个/克，按本发明上述方法制备；对照化学农药为58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂，用量500克/亩，西安鼎盛生物化工有限公司生产。
烤烟品种：云烟87。
试验地点：普洱市宁洱县烟草黑胫病重病烟田。
试验处理设置如下：
处理ⅰ：pe02菌剂2公斤/亩，按常规使用方法兑水后灌根均匀灌根到到该处理的烟根土壤中。
处理ⅱ：pe02菌剂0.25公斤/亩，按本发明的田间液态扩繁方法扩繁，具体操作为：在容量为300升的塑料桶中加入250升水和0.5公斤发酵培养基，搅拌10min后加入0.5公斤二氯异氰尿酸钠(纯度50％)，搅拌10min后用塑料薄膜覆盖和密闭容器，静置48h后加入0.25公斤pe02菌剂，搅拌均匀后静置7d，期间每24h搅拌一次。获得的发酵物均匀灌根到该处理的烟根土壤中。
处理ⅲ：pe02菌剂0.25公斤/亩，按本发明的田间固态扩繁方法扩繁，具体操作为：在塑料大棚空地中铺上一块面积约20m2的塑料薄膜，并将75公斤培养基倒在中央；然后取0.5公斤碳酸氢铵(纯度99.8％)溶解于35升水中并均匀喷洒在培养基上，混合均匀后拢起边缘的塑料膜将培养基包裹其中，并用绳子扎紧，放置2d后摊开培养基，翻动2次后静置30min，接入0.25公斤pe02菌剂，搅拌均匀后静置15d，发酵期间从第5d起，每2d翻动基质一次。获得的发酵物均匀穴施到该处理的烟根土壤中。
处理ⅳ：58％甲霜灵锰锌，按产品说明书上的稀释倍数兑水稀释后均匀灌根到到该处理的烟根土壤中。
处理ⅴ：清水对照。
每处理3个重复，总面积为1亩，种植1200株烤烟，各处理中移栽烟苗时施药，肥水管理按常规方法进行。
防效计算：用药后60d，拔出烟株，统计各处理的烟草黑胫病发病率，按gb/t23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》介绍的方法进行病级分类、计算病情指数和防效。
试验结果：在田间扩繁结束时，测定了处理处理ⅱ、处理ⅲ的发酵物中pe02菌株孢子含量，分别为1.5×107个/克和8.3×107个/克。表1显示，pe02菌剂按常规方法使用(处理ⅰ)，田间液体扩繁后使用(处理ⅱ)和田间固体扩繁后使用(处理ⅲ)时，每棵烟株的pe02孢子量分别为2.08×106，3.13×106，8.65×106；防效分别为57.45％，86.51％，90.82％；成本分别为120元/亩，70元/亩，93元/亩。说明pe02菌剂采用本发明的田间扩繁技术后，在降低使用成本的同时显著提高了防效。pe02菌剂采用本发明的田间扩繁技术后防效显著高于对照化学农药，尽管成本仍高于对照农药，但若考虑烟叶质量及环境生态效益等因素，本发明的菌剂及田间扩繁技术在市场上有很强的竞争力。pe02菌剂及58％甲霜灵锰锌对烟草黑胫病的防效和成本比较如表1所示：
表1
注：同一栏中数值后的字母相同则表示差异不显著；反之则差异显著。成本核算依据：58％甲霜灵锰锌可湿性粉剂80元/公斤；pe02菌剂60元/公斤；液态扩繁培养基70元/公斤，固态扩繁培养基1元/公斤；50％二氯异氰尿酸钠40元/公斤；碳酸氢铵6元/公斤。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。