1.本发明涉及生物
技术领域：
：，涉及一种用于检测端粒酶的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种利用生物素标记的无需pcr且无放射性的直接检测端粒酶的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：：2.端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的特殊结构。人端粒是由6个碱基重复序列(ttaggg)和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体的功能，防止染色体dna降解、末端融合，保护染色体的稳定性，调节细胞生长。由于正常细胞线性dna复制时5'末端消失，随着体细胞不断增殖，端粒逐渐缩短。当细胞端粒缩至一定程度，细胞停止分裂，处于衰老状态。故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(mistosisclock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。端粒酶(telomerase)具有端粒延伸功能，是由rna和蛋白质组成的核糖核酸‑蛋白复合物，其rna组分为模板，蛋白组分具有催化活性，在端粒5'末端合成端粒重复序列。3.癌症已逐渐成为导致人类死亡的最主要原因，全球每年癌症新发病例逐渐上升，死于癌症的患者也呈上升趋势。据统计，我国癌症的新发病例和死亡病例的数量在全球中占比最高，分别为24％和30％。预计癌症将成为本世纪预期寿命增加的最大障碍。因此癌症的诊断及治疗仍然是人类急需解决的重大问题。随着医学技术的发展，癌症的诊断手段也不断增多。端粒酶为端粒的末端不断增加(ttaggg)的重复序列，使得端粒不会因为细胞分裂缩短，从而细胞获得永生化。研究表明，90％的肿瘤细胞端粒酶高表达，而正常细胞和良性组织的细胞不表达端粒酶，因此，端粒酶可以作为肿瘤诊断的标记物来协助肿瘤的早期诊断、判断患者的预后及检测是否复发。并且，端粒酶在肿瘤的发生发展过程中起到关键作用，随着对端粒酶的不断深入研究，靶向端粒酶的相关药物在肿瘤治疗中也发挥一定作用。4.近几十年来，呈现出了许多端粒酶活性检测的改进方法，都是围绕如何提高敏感性和特异性、减少检测时间、降低检测成本。5.基于pcr的trap是目前应用最广泛的检测方法，自从它问世以来，就受到了广大实验工作者的欢迎，是目前检测端粒酶活性的主要方法之一。trap有极高的敏感性，通过pcr扩增产物后能放大几亿倍的强度。但是trap也存在一些缺点：细胞裂解液中的其它分子会对端粒酶有抑制作用，细胞内的生物分子(比如胆汁盐、血红蛋白、肝素和乳铁传递蛋白等)会抑制pcr反应中的taq聚合酶，从而出现假阴性；pcr过程中可能会出现扩增错误、耗时较长，循环数不好控制等问题，低浓度的差异明显，高浓度的差异不明显，不能反应端粒酶的持续结合能力，对于端粒酶活性定量欠佳；使用放射性标记物可能有放射性污染，因此应用受到局限；容易出现假阳性；对于疾病的诊断带来不利影响。6.近年来出现的免pcr的直接端粒酶活性检测方法(dta)，在实验室也逐步受到重视，该方法能够准确定量，对于细胞生物及体外生物化学的端粒酶研究有一定的优势。不过该方法使用同位素标记，实验过程中，存在同位素污染，并且32p的半衰期短，2周左右，如果订购试剂的话，到国内需要一定时间，容易衰减，影响实验的结果。每次用量大，要消耗100‑200uciα‑32p，费用大。7.许多研究团队不断探索端粒酶的检测方法，大多是基于新型材料(石墨烯、二氧化硅、纳米材料)，比如基于纳米金的比色分析方法、指数等温扩增端粒重复序列(expiatr)分析方法，电化学分析方法，电化学发光、荧光法、表面增强拉曼光谱法，活细胞内端粒酶检测方法。尽管这些方法都比较新颖，没有使用pcr，并且灵敏度很高，但是仍然是使用全细胞裂解液来做反应，端粒酶活性仍然会受到标本中的生物因子的抑制，不能准确的反应端粒酶的活性，并且有些实验方法操作起来有一定困难，有些需要特殊材料，花费比较昂贵，还有些需要构建所用的荧光探针或者实验设备，操作繁琐，不利于实验室的推广。技术实现要素：8.本发明的目的是提供一种用于检测端粒酶的方法及其专用试剂盒，具体提供一种利用生物素标记的无需pcr且无放射性的直接检测端粒酶的方法及其专用试剂盒。9.本发明提供了一种检测端粒酶活性的方法(biotin‑dta)，依次包括如下步骤：10.(1)取供试生物样本，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；11.(2)取所述细胞裂解液，通过免疫沉淀进行端粒酶的纯化，得到含有纯化后端粒酶的溶液，称为纯化端粒酶溶液；12.(3)制备反应体系，进行延伸反应；所述反应体系中含有5’端具有生物素标记的引物、dntp、kcl和所述纯化端粒酶溶液；13.(4)收集延伸反应产物；14.(5)依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测，以特征条带的多少和/或信号强弱来反应供试生物样本的端粒酶活性。15.所述特征条带为6个碱基递增的条带。16.所述生物样本为细胞样本。17.所述细胞样本进行细胞裂解前先进行如下预处理：32℃培养1‑3天。18.所述细胞样本进行细胞裂解前先进行如下预处理：32℃培养2‑3天。19.步骤(3)中的反应体系中，kcl浓度为200mm‑250mm。20.所述免疫沉淀采用htert抗体。[0021]5’端具有生物素标记的引物为bio‑l‑18ggg。[0022]收集延伸反应产物采用链霉亲和素标记的磁珠。[0023]所述步骤(1)具体可为：取供试生物样本，用pbs缓冲液洗涤，然后加入chaps裂解液和rnaseinhibitor，吹匀，反应；然后加入2mkcl水溶液，离心收集上清液，即为细胞裂解液。每1mlchaps裂解液配比5μlrnaseinhibitor。[0024]所述步骤(1)具体可为：取供试细胞样本，用pbs缓冲液洗涤；然后取约1.0×107个细胞，加入1mlchaps裂解液和5μlrnaseinhibitor，吹匀，反应；然后加入150μl2mkcl水溶液，离心收集上清液，即为细胞裂解液。[0025]所述步骤(1)具体可为：取供试细胞样本，用pbs缓冲液洗涤；然后取约1.0×107个细胞，加入1mlchaps裂解液和5μlrnaseinhibitor，吹匀，4℃反应1h；然后加入150μl2mkcl水溶液，4℃、13000g离心30min，收集上清液，即为细胞裂解液。[0026]所述步骤(2)具体可为：取细胞裂解液，加入至装有proteing琼脂糖珠和htert抗体的离心管中，混匀并孵育，然后离心弃上清；取沉淀，用含300mmkcl的chaps裂解液洗涤；取沉淀，加入含300mmkcl的chaps裂解液和洗脱液，孵育，然后离心收集上清液，即为含有纯化后的端粒酶的溶液，简称纯化端粒酶溶液。所述抗体为anti‑htert。所述洗脱液中含有5mm洗脱肽，余量为depch2o。洗脱肽的氨基酸序列为：arpaeeatslegalsgtrh。[0027]所述步骤(2)具体可为：取1ml细胞裂解液，加入至装有60μl平衡好的proteing琼脂糖珠和20μlhtert抗体的离心管中，混匀，4℃孵育3h，然后4℃、2000g离心1min，弃上清；取沉淀，用含300mmkcl的chaps裂解液洗3次(每次500μl，然后4℃、2000g离心1min，弃除上清液)；取沉淀，加入100μl含300mmkcl的chaps裂解液和3μl洗脱液，4℃孵育30min，然后4℃、2000g离心10s，收集上清液，即为含有纯化后的端粒酶的溶液，简称纯化端粒酶溶液。所述抗体为anti‑htert。所述洗脱液中含有5mm洗脱肽，余量为depch2o。洗脱肽的氨基酸序列为：arpaeeatslegalsgtrh。[0028]所述步骤(3)的反应体系具体可为如下：[0029]反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为1～30μl(具体可为10‑30μl、10‑20μl或20‑30μlμl)、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为123‑350mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm(四种dntp的总浓度，四种dntp等摩尔配比)、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。[0030]制备反应体系时，纯化端粒酶溶液最后加入。[0031]10×telomerasereactionbuffer：含200mmtris‑hcl(ph8.3)、15mmmgcl2、630mmkcl、0.5％(体积比)tween20、10mmegta，余量为depch2o。[0032]延伸反应的反应条件具体可为：37℃水浴箱中2小时以上(例如2小时)。[0033]步骤(4)具体可为：采用磁珠收集延伸反应产物。[0034]步骤(4)具体可包括如下步骤：[0035]①完成步骤(3)后，加入25μlstopmix，震荡混匀；[0036]②完成步骤①后，加入平衡好的100μl磁珠，室温旋转孵育1h；[0037]③完成步骤②后，2000g离心15s，然后置于磁力架上进行磁吸附，弃除上清；[0038]④取步骤③得到的沉淀，用bind/washbuffer洗3次，然后用0.5mlte溶液洗1次，然后用10μlelutionmix重悬，然后置于90℃金属浴中孵育10min，然后2000g离心15s，然后置于磁力架上进行磁吸附，收集上清液。[0039]所述磁珠具体可为dynabeadsm‑280streptavidin。[0040]stopmix：20mmedta水溶液。[0041]bind/washbuffer(ph7.5)：含10mmtris‑hcl、1mmedta、2mnacl，余量为水。[0042]elutionmix：90％(体积百分含量)loadingbuffer和10％(体积百分含量)d‑biotin溶液。loadingbuffer：含90％(体积百分含量)formamide、90mmtrisbase、90mmboricacid、10mmedta、0.01g/100mlxylenecyanol、0.01g/100mbromophenolblue，余量为水。d‑biotin溶液：含5mmd‑biotin的te溶液。[0043]所述电泳的参数具体可为：采用含8％尿素和10％聚丙烯酰胺的凝胶作为电泳胶，采用1×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，400v预电泳1～1.5h，使得电泳温度上升至50℃以上；然后，取样5μl步骤(4)得到的上清液进行电泳，200v恒压40min。[0044]所述转膜的参数具体可为：用1×tbe缓冲液浸泡尼龙膜、薄滤纸10分钟。然后进行真空转膜，从下到上的顺序依次为薄滤纸、尼龙膜、电泳胶、薄滤纸，转膜负压为0.8bar，时间为50min。[0045]所述紫外交联的参数具体可为：程序c3，到150mj。[0046]信号检测可采用市售试剂盒。例如，可采用chemiluminescentnucleicaciddetectionmodulekit。[0047]本发明还保护一种用于检测端粒酶活性的试剂盒，包括如下组件：[0048]组件甲，用于进行细胞裂解；[0049]组件乙，用于进行端粒酶的纯化；[0050]组件丙，用于进行端粒酶催化的延伸反应；[0051]组件丁，用于收集延伸反应的产物。[0052]所述组件甲具体包括：pbs缓冲液、chaps裂解液和rnaseinhibitor。[0053]所述组件乙具体包括：proteing琼脂糖珠、htert抗体(即anti‑htert)、含300mmkcl的chaps裂解液、洗脱液。所述洗脱液中含有5mm洗脱肽，余量为depch2o。洗脱肽的氨基酸序列为：arpaeeatslegalsgtrh。[0054]所述组件丙具体包括：10×telomerasereactionbuffer、kcl、bio‑l‑18ggg、dntps、dtt、glycerol。[0055]所述组件丁具体包括：磁珠、stopmix、bind/washbuffer、elutionmix。[0056]所述磁珠具体可为dynabeadsm‑280streptavidin。[0057]stopmix：20mmedta水溶液。[0058]bind/washbuffer(ph7.5)：含10mmtris‑hcl、1mmedta、2mnacl，余量为水。[0059]elutionmix：90％(体积百分含量)loadingbuffer和10％(体积百分含量)d‑biotin溶液。loadingbuffer：含90％(体积百分含量)formamide、90mmtrisbase、90mmboricacid、10mmedta、0.01g/100mlxylenecyanol、0.01g/100mbromophenolblue，余量为水。d‑biotin溶液：含5mmd‑biotin的te溶液。[0060]所述试剂盒还包括记载有以上任一任一所述方法的载体。[0061]本发明还保护所述试剂盒在检测检测端粒酶活性中的应用。[0062]bio‑l‑18ggg：5’‑biotin‑ctagacctgtcatcattagggttagggttaggg‑3’。[0063]本发明建立了一种定量准确且无需pcr且无放射性的直接检测端粒酶的方法，具有优异的稳定性、可行性及敏感性，为后期的基础及临床实验提供新思路。[0064]不同于传统的trap方法，本发明建立的方法没有pcr的放大效应，以端粒酶能够为端粒末端不断增加6个碱基的重复序列(aatggg)的基本原理为，设计了一个带有生物素标记的引物(biotin‑l‑18ggg)，在端粒酶存在的情况下，在引物后面就会不断增加6个碱基的序列，通过电泳分离dna的产物，在转膜后利用带有hrp的亲和素抗体与膜上dna产物的生物素牢固的结合，最后使用鲁米诺的化学发光来显示信号。旧的直接端粒酶活性检测方法以放射性α‑32p作为标记，每次做端粒酶延伸反应的使用量比较大，会造影放射性的污染，对人体有一定的危害。再者有放射性同位素的存在，需要采取一些防护措施，实验操作时不方便。并且最后显示结果的时候胶的曝光时间过长，使得检测便利性大大降低。本发明建立的方法利用的都是实验室中常规的仪器、材料，所需要的试剂、溶液也是平时容易购买的，不需要那些昂贵、制作困难的材料。实验操作比较简单，都是实验室常规的一些技术。最后结果是以6个碱基递增的条带来显示，能够直观的判断端粒酶活性的强弱。[0065]本发明的发明人进行了如下工作：应用本发明建立的方法检测稳定表达flag‑htert的hepg2细胞的端粒酶活性；以稳定表达flag‑htert的hepg2细胞为对象，通过敲低pes1、dkc1等基因，应用本发明建立的方法检测端粒酶活性；以293t为对象，应用本发明建立的方法检测内源性端粒酶的活性；应用不同浓度的端粒酶来实验，并与传统的trap方法比较。通过不断地改进及完善各实验步骤，建立了免pcr、无放射性的直接端粒酶检测方法；该方法能够敏感地检测出稳定表达flag‑htert的hepg2细胞的端粒酶活性，并且有剂量、活性强度的线性正相关关系，能够准确定量；该方法检测改变pes1、dkc1等基因表达的稳定表达flag‑htert的hepg2细胞的端粒酶活性，有相应的改变，并与其它报道一致。这表明，免pcr及无放射性的直接端粒酶检测方法是一种敏感性高、简单易行、花费少、定量准确的检测方法，为端粒酶基础实验研究提供了新方法，值得在实验室推广。附图说明[0066]图1为方法的原理示意图。[0067]图2为实施例2的步骤三的结果。[0068]图3为实施例2的步骤四的结果。[0069]图4为实施例3和对比例1的结果。[0070]图5为实施例4的结果。[0071]图6为实施例5的结果。[0072]图7为实施例6的结果。[0073]图8为实施例7的步骤六的结果。[0074]图9为实施例7的步骤七的结果。[0075]图10为实施例8的结果。[0076]图11为实施例9的结果。具体实施方式[0077]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。[0078]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中，使用细胞计数器进行细胞计数以及细胞密度测定。如无特殊说明，细胞培养每48小时更换一次培养基，采用37℃、5％co2的培养条件。如无特殊说明，实施例中的pbs缓冲液均为ph7.4的磷酸盐缓冲液。数据使用spss22.0进行统计分析，计量数据使用平均数±标准差表示，t检验来进行比较两者差异，p<0.05为显著性差异。灰度值使用imagej2x软件分析。端粒酶催化下的延伸反应的反应体系中，kcl浓度为总浓度，由10×telomerasereactionbuffer和补加的kcl提供。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0079]chaps：3‑[(3‑cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate。pmsf：phenylmethanesulfonylfluoride。dtt：dl‑dithiothreitol。d‑biotin：sigma，货号#b4639。anti‑dkc1：abcam。dntps、gelelectrophoresisloadingbuffer和ladderdna：sangonbiotech。dynabeadsm‑280streptavidin：invitrogen。anti‑flagm2agarose：sigma‑aldrich，货号a2220。3x肽：sigma‑aldrich，货号f4799。rnaseinhibitor：takara，货号2313a。c‑flagpcdna3载体：addgene，货号是#20011。[0080]flag肽洗脱液：含5mm3x肽，余量为depch2o。chaps裂解液(ph7.5)：含10mmtris‑hcl、1mmmgcl2、1mmegta、0.5g/100mlchaps、10％(体积比)glycerol、1mmpmsf、1mmdtt，余量为水。[0081]bio‑l‑18ggg，即5’端带有生物素标记的引物，单链dna分子。bio‑l‑18ggg：5’‑biotin‑ctagacctgtcatcattagggttagggttaggg‑3’。[0082]pcdna3.0‑flag‑htert质粒：在c‑flagpcdna3载体的bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间插入序列表的序列1所示的双链dna分子得到的重组质粒，已进行测序验证。序列表的序列1所示的双链dna分子表达flag‑htert(n端具有flag标签的人端粒酶htert)。[0083]pcdna3.0‑flag‑htr质粒：在c‑flagpcdna3载体的bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间插入序列表的序列2所示的双链dna分子得到的重组质粒，已进行测序验证。[0084]实施例1、方法的建立[0085]本发明的发明人以293t细胞为对象，通过瞬时转染htert及htr，免疫沉淀获得高浓度的端粒酶，进行端粒延伸反应，不断摸索改进实验条件，建立了稳定、敏感的无需pcr且无放射性的直接检测端粒酶的方法。[0086]本发明的方法流程：进行细胞裂解，得到细胞裂解液→采用免疫沉淀的方法从细胞裂解液中纯化端粒酶(纯化时去除了抑制端粒酶活性的因子)→延伸反应(反应体系中含有5’端带有生物素标记的引物和dntp，加入纯化的端粒酶，端粒酶持续的把ttaggg的dna重复序列不断的加到所述引物的3’端)→利用带有亲和素的磁珠纯化富集延伸反应产物→将延伸反应产物进行尿素变性胶电泳，然后转移至尼龙膜并进行紫外交联，然后加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，最后通过鲁米诺化学发光的方法来放大信号并进行检测，以6个碱基递增的条带多少及信号强弱来反应端粒酶活性的强弱。[0087]一、进行细胞裂解[0088]取供试细胞，用pbs缓冲液洗涤2遍；然后取约1.0×107个细胞，加入1mlchaps裂解液和5μlrnaseinhibitor，吹匀，4℃反应1h；然后加入150μl2mkcl水溶液，4℃、13000g离心30min，收集上清液，即为细胞裂解液。[0089]取细胞裂解液，转移至rna‑free离心管中，液氮冰冻，‑80℃保存。[0090]在结果图中，细胞裂解液用input表示。[0091]二、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0092]取步骤一得到的细胞裂解液，通过免疫沉淀进行端粒酶的纯化，得到含有纯化后端粒酶的溶液，简称纯化端粒酶溶液。[0093]取纯化端粒酶溶液，分装，‑80℃保存。[0094]在结果图中，纯化端粒酶溶液用ipeluate表示。[0095]三、端粒酶催化下的延伸反应[0096]10×telomerasereactionbuffer：含200mmtris‑hcl(ph8.3)、15mmmgcl2、630mmkcl、0.5％(体积比)tween20、10mmegta，余量为depch2o。[0097]反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为1～30μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为123‑350mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm(四种dntp的总浓度，四种dntp等摩尔配比)、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。制备反应体系时，纯化端粒酶溶液最后加入。[0098]反应条件：37℃水浴箱中2小时(实际应用中，2小时以上均可)。[0099]四、收集延伸反应产物[0100]采用的磁珠为dynabeadsm‑280streptavidin。[0101]stopmix：20mmedta水溶液。[0102]bind/washbuffer(ph7.5)：含10mmtris‑hcl、1mmedta、2mnacl，余量为水。[0103]elutionmix：90％(体积百分含量)loadingbuffer和10％(体积百分含量)d‑biotin溶液。loadingbuffer：含90％(体积百分含量)formamide、90mmtrisbase、90mmboricacid、10mmedta、0.01g/100mlxylenecyanol、0.01g/100mbromophenolblue，余量为水。d‑biotin溶液：含5mmd‑biotin的te溶液。[0104]1、完成步骤三后，加入25μlstopmix，震荡混匀。[0105]2、完成步骤1后，加入平衡好的100μl磁珠，室温旋转孵育1h。[0106]3、完成步骤2后，2000g离心15s，然后置于磁力架上进行磁吸附，弃除上清。[0107]4、取步骤3得到的沉淀，用bind/washbuffer洗3次(每次0.5ml)，然后用0.5mlte溶液洗1次，然后用10μlelutionmix重悬，然后置于90℃金属浴中孵育10min，然后2000g离心15s，然后置于磁力架上进行磁吸附，收集上清液。[0108]五、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0109]1、电泳[0110]采用含8％尿素和10％聚丙烯酰胺的凝胶作为电泳胶，采用1×tbe缓冲液作为电泳缓冲液，400v预电泳1～1.5h，使得电泳温度上升至50℃以上。然后，取样5μl步骤四得到的上清液进行电泳(左右两边加bm2000+做标记)，200v恒压40min。[0111]2、转膜[0112]用1×tbe缓冲液浸泡尼龙膜、薄滤纸10分钟。然后进行真空转膜，从下到上的顺序依次为薄滤纸、尼龙膜、电泳胶、薄滤纸，转膜负压为0.8bar，时间为50min。[0113]3、紫外交联[0114]转膜结束后，进行紫外交联(紫外交联参数：程序c3，到150mj)。[0115]4、信号检测[0116]完成步骤3后，进行信号检测。[0117]信号检测使用试剂盒并按照说明书进行。试剂盒：chemiluminescentnucleicaciddetectionmodulekit(89880,thermofisherscientific)。具体步骤(均采用试剂盒的组分)：首先用blockingbuffer封闭膜15min；然后孵育抗体(带有辣根过氧化物酶)15min，抗体使用blockingbuffer以300:1稀释；然后用1×washingbuffer洗膜4次，每次5min；然后用equilibrationbuffer洗膜1次，5min；然后1:1混合luminell和stablebuffer，把混合液滴在膜的正面，放入化学发光仪中显影。[0118]实施例2、hepg2ft细胞的制备和鉴定[0119]一、构建hepg2ft细胞[0120]plp1质粒、plp2质粒和vsvg质粒为慢病毒包装质粒，均为ppackh1hivlentivectorpackagingkit(systembioscience,货号为lv500a‑1)的组分。[0121]1、293t细胞接种于6孔板，采用含10％胎牛血清且无双抗的dmem培养基培养至细胞密度为50％～60％(每孔约106个细胞)。[0122]2、取0.84μgplp1质粒、0.4μgplp2质粒、0.56μgvsvg质粒和1μgpcdna3.0‑flag‑htert质粒，加至200μl无血清无双抗的dmem培养基中，充分混匀；然后，加入8.4μlpei转染试剂，吹吸混匀，室温静置20min。此为一个孔的转染量。[0123]3、完成步骤1后，加入步骤2得到的混合物，培养4小时，然后更换为含10％胎牛血清的dmem培养基，继续培养44小时。[0124]4、完成步骤3后，收集上清液，采用孔径为0.45μm的滤膜过滤，收集滤液，即为病毒液。[0125]5、hepg2细胞接种于6孔板，采用含10％胎牛血清且无双抗的dmem培养基培养至细胞密度为50％～60％(每孔约106个细胞)。[0126]6、完成步骤5后，每孔加入500μl步骤4得到的病毒液，培养12小时，然后更换为含10％胎牛血清的dmem培养基，继续培养48小时(实际应用中，培养36‑60小时均可)。[0127]7、完成步骤6后，更换为含1μg/ml嘌呤霉素和10％胎牛血清的dmem培养基培养5天(实际应用中，培养3‑7天均可)。[0128]8、完成步骤7后，存活的细胞即为稳定表达flag‑htert的hepg2细胞，命名为hepg2ft细胞。[0129]二、转空载体hepg2细胞的制备[0130]用c‑flagpcdna3载体代替pcdna3.0‑flag‑htert质粒，按照步骤一操作，得到重组细胞，命名为hepg2v细胞。[0131]三、hepg2ft细胞的westernblot鉴定[0132]供试细胞：步骤一得到的hepg2ft细胞或步骤二得到的hepg2v细胞。[0133]取供试细胞，按照实施例1的步骤一进行操作，得到细胞裂解液，然后进行westernblot。westernblot采用的抗体为flag抗体(sigma,a8592)。采用actin为内参蛋白。[0134]结果见图2。flag对应hepg2v细胞，flag‑tert对应hepg2ft细胞。hepg2ft细胞高表达flag‑htert蛋白，hepg2v细胞不表达flag‑htert蛋白。[0135]四、hepg2ft细胞的免疫荧光定位[0136]供试细胞：步骤一得到的hepg2ft细胞或步骤二得到的hepg2v细胞。[0137]取供试细胞，进行免疫荧光定位。免疫荧光定位采用的抗体为flag抗体(proteintech,20543‑1‑ap)。[0138]结果见图3。flag对应hepg2v细胞，flag‑tert对应hepg2ft细胞。hepg2ft细胞中，flag‑htert蛋白信号位于细胞核内。hepg2v细胞中，无flag‑htert蛋白信号。[0139]实施例3、用biotin‑dta检测端粒酶活性[0140]方法的原理示意图见图1。[0141]一、进行细胞裂解[0142]实施例2制备的hepg2ft细胞进行胰酶消化后作为供试细胞，按照实施例1的步骤一操作。实施例2制备的hepg2v细胞进行胰酶消化后作为供试细胞，按照实施例1的步骤一操作。[0143]二、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0144]取1ml细胞裂解液，加入至装有60μl平衡好的anti‑flagm2agarose的离心管中，混匀，4℃孵育3h，然后4℃、2000g离心1min，弃上清；取沉淀，用含300mmkcl的chaps裂解液洗3次(每次500μl，然后4℃、2000g离心1min，弃除上清液)；取沉淀，加入100μl含300mmkcl的chaps裂解液和3μlflag肽洗脱液，4℃孵育30min，然后4℃、2000g离心10s，收集上清液，即为含有纯化后端粒酶的溶液，简称纯化端粒酶溶液。[0145]取纯化端粒酶溶液，分装，‑80℃保存。[0146]三、端粒酶催化下的延伸反应[0147]同实施例1的步骤三。[0148]具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为10μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为250mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。[0149]用等体积chaps裂解液代替纯化端粒酶溶液制备反应体系，作为空白对照。[0150]四、收集延伸反应产物[0151]同实施例1的步骤四。[0152]五、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0153]同实施例1的步骤五。[0154]结果见图4的b。图4的b中，buffer对应空白对照,flag对应hepg2v细胞，flag‑htert对应hepg2ft细胞。只有hepg2ft细胞进行上述步骤后显示存在6个碱基递增的条带信号。[0155]对比例1、现有技术中的方法‑trap方法(trapassay)[0156]实施例2制备的hepg2ft细胞进行胰酶消化后作为供试细胞。[0157]实施例2制备的hepg2v细胞进行胰酶消化后作为供试细胞。[0158]收集细胞后使用chaps裂解液冰上裂解30分钟。然后4℃、12000rpm离心20分钟，留取上清液。检测上清液的蛋白浓度，调整蛋白浓度为50ng/μl，即为供试样品。[0159]取1μl供试样品与2μltrapbuffer、0.4μltsprimer、0.4μlprimermix、0.4μldntps、0.2μlrnainhibitor、0.2μltaqdnapolymerase、15.4μldepch2o混合成总体积为20μl的体系进行pcr反应。设置用chaps裂解液代替供试样品的空白对照。pcr反应程序：30℃30min,94℃30s；94℃30s,59℃30s，72℃1min，25‑30循环；72℃5min。[0160]trapbuffer、tsprimer、primermix均为试剂盒组分。试剂盒：telomerasedetectionkit，millipore，s7700。[0161]pcr产物加入5μl5×dnaloadingbuffe(santacruz)，然后取10μl进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳液为0.5×tris‑borate‑edta(tbe)，电泳条件为200v、50分钟。最后把胶放入凝胶成像仪器显影。[0162]结果见图4的a。图4的a中，chaps对应空白对照,flag对应hepg2v细胞，flag‑htert对应hepg2ft细胞。[0163]实施例4、细胞预培养温度对于端粒酶活性的影响[0164]取实施例2制备的hepg2ft细胞，分两组培养。第一组：37℃培养箱培养3天，然后进行胰酶消化，然后作为供试细胞。第二组：32℃培养箱培养3天，然后进行胰酶消化，然后作为供试细胞。[0165]一、进行细胞裂解[0166]同实施例1的步骤一。[0167]二、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0168]同实施例3的步骤二。[0169]三、端粒酶催化下的延伸反应[0170]同实施例3的步骤三。[0171]四、收集延伸反应产物[0172]同实施例1的步骤四。[0173]五、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0174]同实施例1的步骤五。[0175]结果见图5的a。[0176]六、westernblot鉴定[0177]上述步骤得到的细胞裂解液(input)、纯化端粒酶溶液(ipeluate)和免疫沉淀中收集纯化端粒酶溶液后剩余的沉淀(post‑immune)，分别进行westernblot。westernblot采用的抗体为flag抗体(sigma,a8592)。采用actin为内参蛋白。[0178]结果见图5的b。ipeluate的信号明显高于input，差异具有统计学意义(*p<0.05)，说明免疫沉淀的效率较高。[0179]结果表明，32℃培养能够明显增加外源性htert的表达，htert表达增加后，端粒酶的量也会随之增加，32℃组端粒酶的活性高于37℃组，两者差异有统计学意义(*p<0.05)，说明32℃培养促进了flag‑htert的表达。所以，在收集细胞裂解之前，将细胞32℃培养2‑3天，可以得到更多的端粒酶，提高检测的灵敏度。[0180]实施例5、kcl浓度对于端粒酶活性的影响[0181]取实施例2制备的hepg2ft细胞，32℃培养箱培养2天，然后进行胰酶消化，然后作为供试细胞。[0182]一、进行细胞裂解[0183]同实施例1的步骤一。[0184]二、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0185]同实施例3的步骤二。[0186]三、端粒酶催化下的延伸反应[0187]同实施例1的步骤三。[0188]具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为10μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为123‑350mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。[0189]四、收集延伸反应产物[0190]同实施例1的步骤四。[0191]五、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0192]同实施例1的步骤五。[0193]结果见图6的a。[0194]进行灰度扫描，结果见图6的b。[0195]kcl浓度对于端粒活性很重要，在低浓度时会随着浓度的增加而活性增强，但是超过250mm后无增强，反而有下降趋势。ipeluate用量一样时，kcl浓度为200mm或250mm时端粒酶的活性最强，该两个浓度之间无显著差异，但和其他组存在显著差异(*p<0.05)，因此延伸反应时kcl浓度设为200mm或者250mm，以得到更强的信号。[0196]实施例6、端粒酶活性的定量分析[0197]取实施例2制备的hepg2ft细胞，32℃培养箱培养2天，然后进行胰酶消化，然后作为供试细胞。[0198]一、进行细胞裂解[0199]同实施例1的步骤一。[0200]二、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0201]同实施例3的步骤二。[0202]三、端粒酶催化下的延伸反应[0203]同实施例1的步骤三。[0204]具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为1‑20μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为200mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。[0205]四、收集延伸反应产物[0206]同实施例1的步骤四。[0207]五、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0208]同实施例1的步骤五。[0209]结果见图7的a。[0210]进行灰度扫描，以灰度值最低的处理组(即纯化端粒酶溶液的用量为1μl的处理组)的灰度值为1，换算各个处理组的相对值，作为相对端粒酶活，结果见图7的b。[0211]随ipeluate的用量增加，信号逐渐增强。因此认为该方法的端粒酶活性强弱会随着ipeluate的用量改变而产生变化，并且呈线性关系。该方法的最终显示信号没有pcr的放大效应，所以能够更准确的对端粒酶活性进行定量分析。[0212]实施例7、[0213]在前面的实施例中发明人验证了本发明建立的方法可以成功检测到了hepg2ft细胞的端粒酶活性，为了验证方法的稳定性，本实施例中用已知能够调节端粒酶活性的因子(pes1)来验证。[0214]一、转染与细胞培养[0215]sipes1组：sirna采用sipes1。sinc组：sirna采用sinc。设置不进行任何转染的对照组，即mock组。sipes1：5'‑ccagaggacctaagtgtga‑3'。sinc：5'‑ttctccgaacgtgtcacgt‑3'。[0216]1、取实施例2制备的hepg2ft细胞，胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清且无双抗的dmem培养基，然后接种至直径为10cm的培养皿，培养至密度为50％(细胞数量约为5×106个细胞)。[0217]2、取1ml无血清无双抗的dmem培养基，加入25μlsirna，混匀后加入25μlrnaimax试剂，轻微混匀10s，然后室温静置20min。此为1个培养皿的转染量。[0218]3、完成步骤1后，加入步骤2得到的混合液，摇晃混匀，sirna在体系的浓度为50pm，培养8小时，更换为含10％胎牛血清的dmem培养基，继续培养40小时。[0219]4、完成步骤3后，转移至32℃、5％co2环境中培养24h。[0220]二、进行细胞裂解[0221]收集完成步骤一的细胞，作为供试细胞。[0222]同实施例1的步骤一。[0223]三、通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0224]同实施例3的步骤二。[0225]四、端粒酶催化下的延伸反应[0226]同实施例1的步骤三。[0227]具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为20μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为200mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。[0228]五、收集延伸反应产物[0229]同实施例1的步骤四。[0230]六、依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0231]同实施例1的步骤五。[0232]结果见图8的a。[0233]进行灰度扫描，以mock组的灰度值为1，计算各组的相对值，作为相对端粒酶活，结果见图8的b。[0234]七、westernblot鉴定[0235]收集完成步骤一的细胞，作为供试细胞。[0236]取供试细胞，按照实施例1的步骤一进行操作，得到细胞裂解液，然后进行westernblot。westernblot采用的抗体为pes1抗体(santacruz,sc‑166300)。采用actin为内参蛋白。[0237]结果见图9的a。[0238]进行灰度扫描，以mock组的灰度值为1，计算各组的相对值，作为pei相对表达量，结果见图9的b。[0239]结果显示sipes1组的端粒酶活性比mock组和nc组的有所降低。sipes1组的pes1表达明显下降，与nc组相比有明显差异(*p<0.05)。证明biotin‑dta方法有很好的稳定性。[0240]实施例8、内源性端粒酶活性检测[0241]发明人已经通过外源性端粒酶活性的检测，建立了稳定的、敏感的免pcr无放射性的直接端粒酶活性检查方法。为了使得新方法有更大的应用前景，发明人进一步尝试来检测内源性端粒酶。[0242]取hepg2细胞，胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清的dmem培养基，然后接种至直径为10cm的培养皿，培养至密度为50％(细胞数量约为1×107个细胞)。收集细胞，作为供试细胞。[0243]基本按照实施例1进行操作。[0244]差异步骤为步骤二。步骤二：取1ml细胞裂解液，加入至装有60μl平衡好的proteing琼脂糖珠(santacruz)和20μl抗体的离心管中，混匀，4℃孵育3h，然后4℃、2000g离心1min，弃上清；取沉淀，用含300mmkcl的chaps裂解液洗3次(每次500μl，然后4℃、2000g离心1min，弃除上清液)；取沉淀，加入100μl含300mmkcl的chaps裂解液和3μl洗脱液，4℃孵育30min，然后4℃、2000g离心10s，收集上清液，即为含有纯化后的端粒酶的溶液，简称纯化端粒酶溶液。抗体为anti‑htert(abx120550,abbexa)。洗脱液中含有5mm洗脱肽(洗脱肽的氨基酸序列为：arpaeeatslegalsgtrh)，余量为depch2o。抗体由anti‑htert替换为兔igg，作为阴性对照。[0245]步骤三中的具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液的用量为20μl、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为200mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。用等体积chaps裂解液代替纯化端粒酶溶液制备反应体系，作为空白对照。[0246]westernblot鉴定：取hepg2细胞，按照实施例1的步骤一进行操作，得到细胞裂解液，然后进行westernblot。westernblot采用的抗体为anti‑htert(abx120550,abbexa)或兔igg。采用actin为内参蛋白。[0247]本发明提供方法的结果见图10a。图10a中，igg对应阴性对照，buffer对应空白对照，tert对应试验组。图10a结果表明，阴性对照和空白对照组无信号，而试验组有6个碱基的条带信号。[0248]westernblot鉴定的结果见图10b。图10b中，igg对应兔igg，tert对应anti‑htert。图10b结果表明，ipeluate中有htert表达，说明经过免疫沉淀后得到纯化的端粒酶[0249]使用anti‑htert抗体来做免疫沉淀纯化端粒酶组的ipeluata中含有端粒酶，虽然含量很少，但是可以检测到端粒酶活性，而对照组组没有检测到端粒酶活性。wb检测到纯化端粒酶溶液中htert的表达。结果表明，本发明的方法能检测到细胞的内源性端粒酶。[0250]实施例9、本发明的方法(biotin‑dta)与现有技术中的方法(trap)的比较[0251]sidkc1组：sirna采用sidkc1。sinc组：sirna采用sinc。sidkc1：5'‑gctgcacaatgctattgaa‑3'。sinc：5'‑ttctccgaacgtgtcacgt‑3'。[0252]一、trap方法(trapassay)[0253]1、制备供试细胞[0254](1)取293t细胞，胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清且无双抗的dmem培养基，然后接种至直径为10cm的培养皿，培养至密度为50％(细胞数量约为5×106个细胞)。[0255](2)取1ml无血清无双抗的dmem培养基，加入25μlsirna，混匀后加入25μlrnaimax试剂，轻微混匀10s，然后室温静置20min。此为1个培养皿的转染量。[0256](3)完成步骤(1)后，加入步骤(2)得到的混合液，摇晃混匀，sirna在体系的浓度为50pm，培养8小时，更换为含10％胎牛血清的dmem培养基，继续培养40小时。[0257]2、trap方法[0258]基本同对比例1。设置不同的蛋白浓度(蛋白量分别为5ng、10ng、15ng)。[0259]结果见图11的a。[0260]二、biotin‑dta方法[0261]1、制备供试细胞[0262](1)取293t细胞，胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清且无双抗的dmem培养基，然后接种至直径为10cm的培养皿，培养至密度为50％(细胞数量约为5×106个细胞)。[0263](2)取1ml无血清无双抗的dmem培养基，加入25μlsirna，混匀后加入25μlrnaimax试剂，轻微混匀10s，然后室温静置20min。此为1个培养皿的转染量。[0264](3)完成步骤(1)后，加入步骤(2)得到的混合液，摇晃混匀，sirna在体系的浓度为50pm，培养24小时，然后转染pcdna3.0‑flag‑htert质粒(每个培养皿10μg)和pcdna3.0‑flag‑htr质粒(每个培养皿10μg)，培养6小时，然后转移至32℃、5％co2环境中培养1.5天。[0265]2、biotin‑dta方法[0266]收集完成步骤1的细胞，作为供试细胞。[0267](1)进行细胞裂解[0268]同实施例1的步骤一。[0269](2)通过免疫沉淀(immunopurification，ip)纯化端粒酶[0270]同实施例3的步骤二。[0271](3)端粒酶催化下的延伸反应[0272]同实施例1的步骤三。[0273]具体反应体系(50μl)：纯化端粒酶溶液、10×telomerasereactionbuffer的用量为5μl、kcl的浓度为200mm、bio‑l‑18ggg的浓度为0.5μm、dntps的浓度为1mm、dtt的浓度为10mm、glycerol的浓度为10％(体积比)，余量为depch2o。纯化端粒酶溶液的用量为10、20或30μl。[0274](4)收集延伸反应产物[0275]同实施例1的步骤四。[0276](5)依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测[0277]同实施例1的步骤五。[0278]结果见图11的b。[0279]结果显示如下，使用trap检测sidkc1组供试细胞与sinc组供试细胞相比，端粒酶活性有差异，但是不同梯度样品之间差异不稳定，低浓度的样品差异比较大，而高浓度样品的差异较小。比如蛋白浓度为5ng时，两者差异为82％，而10ng为57％、15ng为50％。本发明提供的方法检测的端粒酶活性差异与使用不同纯化端粒酶溶液量变化不大，各浓度之间的差异比较稳定，比如10μl为69％、20μl为62％、30μl为66％。所以本发明提供的方法在筛选端粒酶调节因子较传统的trap有一定的优势。[0280]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。当前第1页1 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