一株对柑橘木虱具强致病力的枝状枝孢霉菌株及其应用

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株对柑橘木虱具强致病力的枝状枝孢霉菌株及其应用。

背景技术：

柑橘木風(diaphorinacitrikuwayama)属同翅目(homoptera)、木風科(chermidae),是柑橘、柠檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，也是传播柑橘黄龙病的唯一自然虫媒。柑橘黄龙病是柑橘种植业的首要难题，给果农造成了严重的经济损失，极大的阻碍了我国乃至世界柑橘产业的发展。

目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，虽然通过大量使用化学农药起到灭杀害虫的目的，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱产生抗药性等诸多问题。为此，目前国家开始提倡农田减肥减药的“两减”措施，因此行业中正在寻求更为安全、无污染的柑橘木虱防治方法。

生物防治方法以其高效、无毒、无残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学防治的理想替代方案。因此，利用生物方法防治柑橘木虱也逐渐引起了人们的重视。其中，通过昆虫病原菌来防控柑橘木虱不仅可以避免化学药剂易产生抗药性的难题，而且可有效解决大量使用化学药剂带来的环境问题，是最具应用前景的生物防治手段之一。目前，已经发现较多种类的昆虫病原菌，主要为病原真菌、细菌和病毒。其中，白僵菌和核多角体病毒在害虫防治方面的应用较多，且生产技术已经相当成熟。但对柑橘木虱有杀虫活性的菌株相对比较少，杀虫活性也比较低，已报道的主要有淡紫拟青霉菌，宛氏拟青霉菌，玫烟色棒束孢菌，蜡蚧菌，刀孢轮枝菌等。但目前生产上可有效利用的仍旧较少，因此，开发更多的柑橘木虱虫生生防菌资源对有效防控柑橘木虱和柑橘黄龙病尤为重要。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一株枝状枝孢霉菌株，该菌株在常温、常湿下对柑橘木虱具有较强的致病力，具有被开发为生防菌的可能，将为柑橘木虱的绿色生物防治提供更多选择。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一株枝状枝孢霉菌株，所述菌株为枝状枝孢霉(cladosporiumcladosporioides)clad，对柑橘木虱具有强致病力，已于2020年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:61248，所述clad菌株的rdna-its2具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

上述菌株是从广东省广州市天河区广东省农业科学院果树研究所试验基地种植的柑橘植株上采集的非正常死亡的柑橘木虱虫体上分离获得的，经鉴定为cladosporium(枝孢属)，cladosporiumcladosporioides(枝状枝孢霉)。

本发明还提供了上述的枝状枝孢霉菌株在防治柑橘木虱中的应用。

本发明还提供了上述的枝状枝孢霉菌株在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用。

本发明还提供了上述的枝状枝孢霉菌株在防治由柑橘木虱引起的植物病害中的应用。

本发明还提供了上述的枝状枝孢霉菌株在制备用于防治由柑橘木虱引起的植物病害的生物农药中的应用。

经试验发现，该枝状枝孢霉clad菌株产孢量大，孢子液在常温、常湿下对柑橘木虱若虫和成虫均具有较强的致病力，对柑橘木虱具有灭杀作用，在第7天各龄期柑橘木虱若虫的校正死亡率分别为：1龄100％；2龄，100％；3龄，100％；4龄，60％，5龄30％；在第10天，柑橘木虱成虫的校正死亡率为83.3％。可见，该菌株有望被开发为柑橘木虱的生防菌，为柑橘木虱的绿色生物防治提供更多选择。

优选地，所述植物包括但不限于九里香。也包括常见的柑橘木虱危害植物，比如柑橘、柠檬、黄皮、九里香等芸香科植物。

优选地，所述病害为柑橘黄龙病。

本发明还提供了一种用于防治柑橘木虱的药剂，其特征在于，包括上述的枝状枝孢霉菌株。

本发明还提供了一种用于防治柑橘黄龙病的药剂，其特征在于，包括上述的枝状枝孢霉菌株。

优选地，上述提及的药剂的制备方法为：将上述的枝状枝孢霉菌接种于pda平板上培养不少于10d，然后收集菌丝及孢子配制成孢子悬浮液，所述孢子悬浮液的浓度为(1.0×10⁵-1.0×10⁹)孢子/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从柑橘植株的非正常死亡柑橘木虱虫体上分离得到一株clad菌株，该菌株经鉴定为枝状枝孢霉(cladosporiumcladosporioides)，命名为枝状枝孢霉clad，该菌株产孢量大，孢子液在常温、常湿下对柑橘木虱若虫和成虫均具有较强的致病力，有望被开发为柑橘木虱的生防菌，为柑橘木虱的绿色生物防治提供更多选择。

附图说明

图1为枝状枝孢霉clad菌株在pda培养基上的生长情况图；

图2为枝状枝孢霉clad菌株的菌丝、分生孢子梗及分生孢子的电镜图；

图3为枝状枝孢霉clad菌株的分生孢子的电镜图；

图4为因感染枝状枝孢霉clad菌株致死的柑橘木虱成虫。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1菌株clad的分离、纯化

从广东省广州市天河区广东省农业科学院果树研究所试验基地种植的柑橘植株上采集非正常死亡的柑橘木虱虫体。将采集得到的柑橘木虱尸体用75％的酒精溶液进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中冲洗三次，并放入pda平板中，倒置于25℃恒温箱中培养，待菌落形成后，挑取单菌落进行分离纯化，经多次转移培养后得到一株纯的菌株，将其命名为菌株clad，并转入4℃冰箱贮存。

实施例2菌株clad的鉴定和保藏

通过ezup试剂盒提取菌株clad的总dna，并利用真菌通用引物进行pcr扩增，测序。利用ncbiblast进行比对分析发现，所测序列(its1-5.8srdna-its2序列)与genbank中枝状枝孢霉(cladosporiumcladosporioides)的多个菌株(dcf1、daef25、gx36、fjat-30992等)的序列相似性高达99％至100％。证明菌株clad属于cladosporium(枝孢属)，cladosporiumcladosporioides(枝状枝孢霉)，并将其命名为枝状枝孢霉(cladosporiumcladosporioides)clad。其中，所述枝状枝孢霉clad菌株的rdna-its2序列大小为525bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

随后，于2020年11月17日将枝状枝孢霉clad菌株拿到广东省微生物菌种保藏中心进行登记保藏，保藏信息如下：

保藏时间：2020年11月17日；

保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；

保藏编号：gdmccno:61248；

保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；

分类命名：cladosporiumcladosporioides。

实施例3枝状枝孢霉clad菌株的形态特征

枝状枝孢霉clad菌株在马铃薯葡萄糖培养基(pda)上生长良好，如图1所示，27℃下培养10d其菌落直径可达6.5cm，菌落呈圆形，菌落起初呈深绿色，丝绒状。培养10d的菌落正面为深绿色棉絮状，中间部位颜色浅黄色、隆起，菌落背面呈深绿色。菌丝枝状有横隔和分枝见附图2。分生孢子呈卵圆形，大小为14.7-20.0μm×23.3-63.3μm，如图3所示。

实施例4枝状枝孢霉clad菌株对柑橘木虱的致死中浓度和致死中时间

将枝状枝孢霉clad菌株接种于pda平板上培养10d后，然后用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子，用0.03％的吐温-80无菌水冲刷、收集分生孢子。将菌液倒入烧杯中，随后用磁力搅拌器搅拌，将孢子完全打散后用纱布过滤，得到较纯的孢子悬浮液，并在40倍物镜下以血球计数板计数母液的孢子浓度，再分别稀释成1.0×10⁹，1×10⁸，1×10⁷，1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴孢子/ml备用。

选择健康的九里香植株并检查确保植株上无柑橘木虱(包括若虫、成虫)，然后将九里香植株放入60cm×60cm×60cm的饲养笼中。随机抓取饲养的柑橘木虱成虫30只，放入冰箱-20℃冷冻30秒，将其冻晕后放入上述各浓度孢子悬浮液中浸润10秒钟，随后将恢复站立后的成虫放入上述的装有九里香植株的饲养笼中。每天观察记录柑橘木虱成虫的死亡数量，连续观察10天。实验所得数据通过dps软件进行回归分析，得到回归方程和相关系数r，计算致死中浓度(ld50)和致死中时间(lt50)。

实验结果显示，随着孢子悬浮液浓度的增加，其对柑橘木虱成虫的致死率越高。接种后第3天，枝状枝孢霉clad对柑橘木虱的ld50为4.6×10⁸孢子/ml，第10天ld50为3.2×10⁴孢子/ml。当孢子悬浮液浓度为1.0×10⁵孢子/ml时，其对柑橘木虱的lt50为8.32天，而当浓度为1.0×10⁹时，其lt50仅为2.43天。

实施例5枝状枝孢霉clad菌株对不同龄期柑橘木虱若虫的致病力测定

(1)实验所用的柑橘木虱来自广东省广州市天河区广东省农业科学院果树研究所种植九里香的网室内。

(2)选择生长健壮的九里香植株，对其顶部进行修剪，并分别放入60cm×60cm×60cm养虫笼中，待九里香抽梢至3cm时，放入20对柑橘木虱成虫，成虫产卵24h后，将全部成虫转移，待柑橘木虱若虫发展至各不同龄期时进行试验。用0.03％的吐温-80无菌水冲刷、收集菌株的分生孢子，经打散、过滤后稀释成1×10⁷孢子/ml备用。选取、标记带有柑橘木虱低龄若虫的九里香嫩芽，并统计每个嫩芽上各龄期柑橘木虱若虫的数量，将用0.03％的吐温-80配制好菌株孢子悬浮液均匀的喷雾在标记好的九里香嫩芽上，对照用0.03％的吐温-80无菌水溶液代替，每个处理设置3个重复。每天观察记录各龄期柑橘木虱若虫的死亡数量，连续观察7天。

实验结果发现，在第3天各龄期柑橘木虱若虫的校正死亡率分别为：1龄100％；2龄，100％；3龄，100％；4龄，50％，5龄20％；在第7天各龄期柑橘木虱若虫的校正死亡率分别为：1龄100％；2龄，100％；3龄，100％；4龄，60％，5龄30％。

实施例6枝状枝孢霉clad菌株对柑橘木虱成虫的致病力

选择健康的九里香植株并检查确保植株上无柑橘木虱(包括若虫、成虫)，然后将九里香植株放入60cm×60cm×60cm的饲养笼中。随机抓取饲养的柑橘木虱成虫30只，放入冰箱-20℃冷冻30秒，将其冻晕后放入1×10⁸孢子/ml的菌株孢子悬浮液中浸润10秒钟，随后将恢复站立后的成虫放入上述的装有九里香植株的饲养笼中。每天观察记录柑橘木虱成虫的死亡数量，连续观察10天。

实验结果显示，在第3天，柑橘木虱成虫的校正死亡率为33.3％，在第7天，柑橘木虱成虫的校正死亡率为70％，第10天，柑橘木虱成虫的校正死亡率为83.3％。因感染枝状枝孢霉clad菌株致死的柑橘木虱成虫如图4所示。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>广东省农业科学院果树研究所

<120>一株对柑橘木虱具强致病力的枝状枝孢霉菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>525

<212>dna

<213>rdna-its2序列(cladosporiumcladosporioides)

<400>1

tgcggagggatcattacaagtgaccccggtctaaccaccgggatgttcataaccctttgt60

tgtccgactctgttgcctccggggcgaccctgccttcgggcgggggctccgggtggacac120

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