枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂及其制备方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂及其制备方法。

背景技术：

喷雾干燥是将物料经喷嘴雾化成小液滴，在干燥塔内经过热交换和质交换，使物料快速干燥的一种方法。喷雾干燥技术制备微生态制剂，将益生菌进行微胶囊化，不仅可使菌体与外界的不良环境分开，掩蔽气味，形成近似于球状的固体微颗粒，便于添加使用，也有利于储存和运输。因此喷雾干燥技术制备益生菌胶囊能够提高益生菌在生产、运输和贮存过程中的稳定性。

利用喷雾干燥制备高质量的益生菌胶囊，选择合适的壁材尤为重要。壁材作为保护剂能大大提高喷雾干燥过程中益生菌的存活率，目前食品工业中最常用的壁材大体分为三类：碳水化合物类，植物亲水性胶类，蛋白质类。各壁材各具优缺点，如胶体类在水溶液中会形成具有一定机械强度的凝胶粒子，对益生菌形成保护作用；蛋白质具有良好的乳化特性和粘度，有利于微胶囊形成致密网络结构，保护内部的益生菌。然而单一保护剂不足以帮助菌体抵抗外界恶劣的环境，复合保护剂效果更好，复配保护剂中各类壁材在喷雾干燥中能够发挥各自作用，在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率，达到最佳保护效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂及其制备方法，该配方制备的枯草芽孢杆菌微生态制剂活菌数和芽孢率较高，稳定性好。

为实现上述技术目的，采用以下技术方案：

枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂，所述保护剂包含明胶、阿拉伯胶及海藻糖，三者质量比为5：4：4。

枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌悬液制备：通过常规方法制备获得枯草芽孢杆菌发酵液，将枯草芽孢杆菌发酵液5000r/min离心约20min，弃上清液，沉淀用等量生理盐水洗涤两次并用等质量生理盐水重新悬浮制得菌悬液；

（2）微胶囊壁材的添加：将称量好的壁材按比例和顺序溶解在去离子水中，配制成壁材溶液，经过均质机均质15min，90℃水浴加热5min。将壁材溶液充分溶解均匀。将菌悬液和壁材溶液等体积混合，磁力搅拌器上放置混合液，以500r/min一直搅拌直到其混合均匀；

（3）喷雾干燥制备微生态制剂：将添加有壁材的菌悬液进料到喷雾干燥机，设定喷雾干燥工艺参数：进料速度500ml/h，入口温度150℃，出口温度84℃，雾化压力0.1mpa。喷雾干燥后收集菌粉。

所述壁材溶液中明胶、阿拉伯胶、海藻糖的终质量分数为25%、20%、20%。

步骤（2）中的壁材添加顺序依次为明胶、阿拉伯胶、海藻糖。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明选用了三类壁材，分别是蛋白质类、碳水化合物类、胶体类壁材联用作为枯草芽孢杆菌喷雾干燥壁材，蛋白质壁材选用明胶，碳水化合物类壁材选用海藻糖，胶体类壁材选用阿拉伯胶，选用的保护剂使用广泛且价格低廉，联用后有效提高了菌体的耐受力。

（2）本发明确定了保护剂的添加浓度（质量分数）和保护剂的添加顺序，该浓度及顺序下制备的枯草芽孢杆菌微生态制剂，活菌数以及菌的存活率得到有效提高。

附图说明

图1为实施例1壁材喷雾干燥菌粉扫描电镜图。

图2为实施例2壁材喷雾干燥菌粉扫描电镜图。

图3为实施例3壁材喷雾干燥菌粉扫描电镜图。

图4为实施例4壁材喷雾干燥菌粉扫描电镜图。

具体实施方式

本发明的枯草芽孢杆菌喷雾干燥复合保护剂及其制备方法，包括如下步骤：

（1）高密度菌悬液制备：按常规方法，斜面接枯草芽孢杆菌于种子培养基，于37ºc、150r/min培养24h得到种子液，将种子液以5%接种量接种至发酵培养基，三角瓶装液量为100ml，37℃、150r/min培养48h，获得发酵菌液（活菌数约为1×10¹¹cfu/ml，芽孢数量达到5×10¹⁰cfu/ml），将发酵菌液分装在50ml离心管中，5000r/min离心约20min，弃上清液，沉淀用等量生理盐水洗涤两次并用等质量生理盐水重新悬浮制得菌悬液；

（2）微胶囊壁材的添加：将称量好的壁材按比例和顺序溶解在去离子水中，配制成壁材溶液。经过均质机均质15min，90ºc水浴加热5min。将壁材溶液充分溶解均匀。将枯草芽孢杆菌菌悬液和壁材溶液等体积混合，磁力搅拌器上以500r/min搅拌直至混合均匀；

上述步骤中壁材包括明胶、海藻糖、阿拉伯胶。

（3）喷雾干燥制备微生态制剂：将添加有壁材的菌悬液过蠕动泵进料到喷雾干燥机，设定喷雾干燥工艺参数：进料速度500ml/h，入口温度150℃，出口温度84℃，雾化压力0.1mpa。喷雾干燥后收集菌粉。

（4）将喷雾干燥后的菌粉分别低温和常温贮藏一年。通过平板菌落计数贮藏前后菌粉中的活菌数，考察喷雾干燥菌粉的稳定性。

（5）在试验中，活菌计数以平板涂布法进行计数，培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。芽孢计数方法为将样品在80℃水浴中处理15min后进行平板涂布计数。芽孢率=（芽孢数/活菌数）*100%。

实施例1

本实施例的枯草芽孢杆菌喷雾干燥保护剂成分及添加顺序如下：

按上述步骤（1）（2）（3）（4）（5）方法制备菌粉，计算菌粉活菌数和芽孢数。

实施例2

本实施例的枯草芽孢杆菌喷雾干燥保护剂成分及添加顺序如下：

按上述步骤（1）（2）（3）（4）（5）方法制备菌粉，计算菌粉活菌数和芽孢数。

实施例3

本实施例的枯草芽孢杆菌喷雾干燥保护剂成分及添加顺序如下：

按上述步骤（1）（2）（3）（4）（5）方法制备菌粉，计算菌粉活菌数和芽孢数。

实施例4

本实施例的枯草芽孢杆菌喷雾干燥保护剂成分及添加顺序如下：

按上述步骤（1）（2）（3）（4）（5）方法制备菌粉，计算菌粉活菌数和芽孢数。

通过在单因素测试确定明胶、阿拉伯胶、海藻糖质量分数比分别为25%、20%、20%时，壁材起到了更好的保护作用。

具体实施例1、2、3、4喷雾干燥菌粉活菌数和芽孢数结果如表1所示，加速贮藏实验中，实施例1-4菌粉在不同存放温度下存放120h后的活菌数如表2所示，喷雾干燥菌粉低温（4℃）和常温（25℃）放置一年后菌粉活菌数如表3所示。

由表2可知，实施例3，即明胶-阿拉伯胶-海藻糖顺序添加，活菌数高，同时芽孢数量也显著高。由表3可知，三种保护剂联用效果比两种保护剂联用效果显著；其次，明胶-阿拉伯胶-海藻糖添加顺序包埋菌粉稳定性最佳。

鉴于此，确定最佳的壁材添加顺序为明胶-阿拉伯胶-海藻糖。该添加顺序下的菌粉，可得到(1.42±0.29)×10¹⁴cfu/g的活菌及(9.65±0.77)×10¹³cfu/g的芽孢，在4℃存放1年后的活菌数为10¹³cfu/g，仅下降一个数量级；常温下存放一年后活菌数仍有10⁸cfu/g。

表1壁材按不同顺序添加后的喷雾干燥活菌数（cfu/g）

表2不同存放温度下菌粉的稳定性

表3菌粉储藏一年活菌数（cfu/g）

具体实施例1-4喷雾干燥菌粉扫描电镜图结果如图1-4所示，当仅采用阿拉伯胶与明胶两种壁材溶液进行复配时，得到的菌粉颗粒变形严重，出现凹陷或皱缩的形貌特征，当将阿拉伯胶、明胶与海藻糖三种壁材溶液进行复配时，菌粉颗粒外观平滑完整，仅少量菌粉颗粒因为高温出现孔洞导致内容物流出的现象，大部分保持良好完整的形貌特征。可见，三者混用保护效果显著，海藻糖的加入提高微胶囊膜的致密性，从而更有效的保护胶囊中的物质不被高温高压所破坏。而明胶是一种优良的保护性胶体，也是一种良好的乳化剂和稳定剂，它的先混合可以使得热稳定性增强，芽孢更多，且贮藏稳定性显著增加。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。