一种用于线粒体定位荧光探针及其制备方法及应用

本发明涉及分子荧光探针技术领域，具体涉及一种用于线粒体定位荧光探针的制备方法及应用。

背景技术：

线粒体是细胞中重要的细胞器，在细胞的新陈代谢以及向细胞提供atp的过程中，都起着关键作用。线粒体的功能紊乱会影响细胞的正常生命活动。因此，监测线粒体自身及内部环境的微小变化以及对线粒体在异常条件下的及时治疗具有重要价值。对于化学研究人员来讲，设计合成新颖的荧光探针实现监控线粒体以及线粒体内部微环境变化是非常关键的问题。其中内部微环境重要因子——粘度是控制物质传递、信号传导以及生物大分子之间相互作用的关键影响因素。据文献报道，正常细胞的细胞质粘度约为1-2cp，而受到损伤的细胞质粘度会显著增加，可以达到140cp，甚至更高。细胞内粘度水平的异常变化已被证实与许多疾病相关，例如动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病和细胞恶性肿瘤。因此，维持正常的细胞内粘度水平对于正常的生理过程至关重要。细胞内各区域粘度高度不均匀，为了更好地监测细胞内粘度的局部变化，监测不同细胞器内粘度显得尤为重要。特别是，线粒体在维持人体的许多生理功能中起着重要作用。如果线粒体粘度异于正常水平，将会导致线粒体网络组织的变化和代谢物扩散速率，严重的甚至导致细胞损伤和凋亡。因此，开发具有膜透性的粘度传感器来监测活细胞线粒体内粘度的变化具有重要意义。

迄今为止，已有一些常见的粘度测量仪器和分析方法，包括毛细管粘度计、旋转粘度计和电化学分析，但它们都不适合用于测量活细胞内粘度。近年来，荧光探针技术由于其高灵敏度、高时间和空间分辨率、实时原位和非侵入性检测的优点而被广泛用于粘度敏感探针的开发。因此发展一种简单有效地荧光探针可定位线粒体并实现对其粘度的检测具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种荧光探针，该探针可定位线粒体，并且对粘度具有高选择性和高灵敏性。

本发明的第二个目的是提供一种上述荧光探针，具有大于120nm的斯托克斯位移，可有效降低信噪比。

本发明的第三个目的是提供一种上述荧光探针在检测细胞粘度中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单及产率高。

为实现上述目的，本申请采取的解决方案如下：

一种用于线粒体定位荧光探针，化学名称为3-甲基-2-(2-芘-4-乙烯基)-喹嗪氯盐，简称为pyqz，其结构式如下：

所述的一种用于线粒体定位荧光探针的制备方法，具体合成路线如下：

所述的一种用于线粒体定位荧光探针的制备方法，具体步骤如下：

1)将芘甲醛和2,3-二甲基喹嗪氯盐溶于乙腈溶液，加入哌啶；避光油浴加热，在温度为80-90℃下反应48-72小时，然后冷却至室温，沉淀析出；

2)析出的沉淀抽滤，并用乙腈溶剂进行重结晶，得到目标探针pyqz。

优选的，步骤1)中所述芘甲醛、2,3-二甲基喹嗪氯盐与哌啶的摩尔比为1:1：1。

优选的，步骤1)中芘甲醛、2,3-二甲基喹嗪氯盐的总量与步骤2)中乙腈溶剂重量比为1:10-12。

本发明所述的一种用于线粒体定位荧光探针的制备方法及应用，其中结构特征：探针由芘与2,3-二甲基喹嗪通过烯键连接，构成典型的供体(donor)-π-受体(acceptor)体系；由于芘是一种较好的大共轭平面框架结构，探针具有较大的斯托克斯位移和长的发射波长，有效降低信噪比；并且由于芘的引入，有效地降低了不同极性溶剂对探针吸收光谱和发射光谱的影响，这对于粘度探针是非常有意义的。

本发明所述的一种用于线粒体定位荧光探针的制备方法及应用中对粘度检测机理是：当探针处于非粘性或低粘度溶液中时，旋转速度相对较快，激发态能量通过非辐射途径衰减，使得探针呈现较弱的荧光。而处于粘性溶液中时，其旋转速度受到限制，降低了激发态能量通过非辐射途径的衰减，使探针荧光恢复。该荧光探针对粘度响应快、选择性高，并且可实现线粒体中粘度的检测。

本发明的优点和有益效果是：

本发明所提供的一种用于线粒体定位荧光探针，能够靶向标记线粒体；并且对粘度具有特异性响应，高的灵敏度，良好的光学稳定性以及快速响应性；而且探针具有好的生物膜透性，大的斯托克斯位移，信噪比低；可以实现在细胞内线粒体粘度的检测。同时本发明提供的该探针的制备方法简单易行、成本低，经济技术效果明显。

附图说明

图1是探针在不同粘度体系中荧光发射光谱(横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度)。

图2是探针对粘度选择性荧光光谱(横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度)。

图3是探针的细胞成像应用。

图4是探针在线粒体中的定位实验。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例作进一步详细叙述：

1)探针pyqz的合成

将芘甲醛(350mg,1.5mol)和2,3-二甲基喹嗪氯盐(300mg,1.5mol)以及20μl哌啶加入装有10ml的圆底烧瓶中，放入90℃油浴锅中避光搅拌72h。反应完成后体系冷却至室温，析出橘红色沉淀，抽滤后用乙腈进行重结晶，得到目标产物pyqz。其产量为447mg，产率为71％。熔点大于300℃；高分辨质谱(hrms):理论m/z[m-cl^-]⁺＝370.1612；计算得到[m-cl^-]⁺:370.1590；探针的核磁结果如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz,ppm)δ9.03(d,2h,j＝8.0hz),8.98(d,1h,j＝8.0hz),8.87(s,1h),8.83(d,1h,j＝8.0hz),8.72(d,1h,j＝8.0hz),8.37(d,2h,j＝8.0hz),8.32(d,2h,j＝8.0hz),8.27(d,1h,j＝8.0hz),8.19(dd,3h,j＝12.0,8.0hz),8.10(t,1h,j＝8.0hz),7.89(t,1h,j＝8.0hz)7.69(d,1h,j＝16.0hz),2.62(s,3h)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz,ppm)δ146.19,141.82,136.34,135.96,135.49,135.33,133.38,132.95,131.86,131.35,130.59,130.17,129.67,129.51,128.48,127.95,127.43,127.34,126.99,126.68,125.58,125.10,124.72,124.02,123.88,123.72,121.16,17.92.

2)探针pyqz在不同粘度体系中的荧光光谱

将上述制得的pyqz在二甲基亚砜(dmso)中制成5×10^-3m的母液待用；

测试液中分别取3ml不同比例甘油与水的溶剂(甘油与水质量比分别为0：100；10：90；20：80；30：70；40：60；50：50；60：40；70：30；80：20；85:15；90：10；95：5)，加入探针母液(探针最终浓度为5μm)，进行荧光测试(激发波长450nm，狭缝宽度5nm)。测得各体系中荧光强度，如图1所示，由图1可知，随着粘度的增加，荧光强度逐渐增强。

3)探针对粘度选择性荧光光谱

选择常见的金属离子，反应性氮原子，ros和硫醇作为研究探针对粘度的敏感性的干扰离子，包括mg²⁺，ca²⁺，cu²⁺，fe²⁺，zn²⁺，ag⁺，ni²⁺，hg²⁺，onoo^-，no2^-，hclo，h2o2，tbhp，gsh，hcy和cys。测试液取3ml探针的水溶液，向溶液中分别加入上述物质(探针最终浓度为5μm，上述物质最终浓度为50μm)，进行荧光光谱扫描(激发波长450nm，狭缝宽度5nm)。如图2所示，在探针pyqz水溶液中加入上述的物质，荧光强度没有明显的变化；然而探针在95％的甘油中荧光强度显著增强。实验结果表明本发明的探针对粘度具有专一响应性。

4)探针pyqz在细胞中的成像

将适当密度的hela细胞接种到6孔的培养皿中，在37℃含5％co2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，第一组加入荧光探针pyqz(浓度为0.5μm)孵育半小时后进行荧光成像(激发波长559nm，收集波段575-675nm)；第二组先加入粘度刺激物莫能菌素(monensin，浓度为10μm)培养半小时，然后加入探针pyqz(浓度为0.5μm)，再孵育半小时后进行荧光成像。成像结果如图3所示，通过分析比较发现，在没有外界刺激的情况下，只含有探针的细胞荧光强度很弱；但是在莫能菌素刺激下，含有探针的细胞发出很强的荧光；因此说明本发明的荧光探针实现细胞内粘度变化的检测。

5)探针与商品化试剂盒对线粒体进行共定位

将适当密度的hela细胞接种到35mm的培养皿中，在37℃含5％co2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，向培养皿中同时加入荧光探针pyqz和商品化线粒体试剂盒mito-trackergreen，使探针和线粒体试剂盒最终浓度均为0.2μm。培养半小时后，弃掉培养基，用10mmpbs(ph＝7.4)缓冲液淋洗细胞3次，随后进行荧光成像(探针为红色通道，激发波长559nm，收集波段575-675nm；线粒体试剂盒为红色通道，激发波长488nm,收集波段500-545nm)，结果如图4所示。其中a)为线粒体试剂盒mito-trackergreen在绿色通道的荧光；b)为探针pyqz在红色通道的荧光；c)为a)和b)的叠加图；d)为c)和明场的叠加图；e)为探针与线粒体试剂盒mito-trackergreen荧光强度散点图；f)为探针与线粒体试剂盒mito-trackergreen感兴趣区域荧光强度线状图。从图4可知，探针与mito-trackergreen的发光位置高度一致，共定位系数为0.98。说明探针pyqz主要集中在线粒体内，因而本发明的探针可以用来检测细胞中线粒体的粘度。