一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用与流程

一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及重组腺病毒技术领域，具体为一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用。


背景技术：

2.klotho基因是主要在肾脏和脑表达的基因,其表达产物有膜结合型和分泌型两种蛋白异构体形式,二者可能分别是膜结合受体和体液调节信号蛋白。klotho基因敲除后小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变,如寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松、免疫功能降低等。持续血液循环应激和慢性肾衰时肾klotho基因的表达下调。klotho基因是抑制衰老的基因,其分泌性蛋白是抗衰老激素。分泌型klotho蛋白有望成为防治老年病的有效药物。klotho基因敲除鼠是目前研究人类衰老及多种老年病发生、预防和治疗的最合适的动物模型；
3.肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素d3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行；
4.腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链dna分子，约含4.7kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条dna链的5'端同相对分子质量为55x103da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链dna的环状结构；
5.腺病毒的基因组为约36kb的线性化双链基因组，其两端各有一个长约100～150bp的末端反向重复序列(invertedterminalrepeatssequence,itrs)，itrs与启动和增强早期基因的转录有关。在itrs3’端为长约300bp的包装信号(ψ)，它们是腺病毒复制包装所必需的顺式作用元件。基因组由非结构基因e1(e1a、e1b)、e2a、e2b、e3、e4组成，和编码结构蛋白的基因ll
‑
l5等组成。目前对腺病毒的分子生物学特性研究的最为详细的是人腺病毒2型(ad2)和人腺病毒5型(ad5)。绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用ad5构建的。腺病毒载体的发展经历了三个阶段：第一代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的e1和/或e3两个区而获得的；第二代腺病毒载体将病毒基因组中的e2或e4区剪切或使其失活；第三代腺病毒载体只保留了腺病毒必要的顺式作用元件及基因组两端的itrs和包装信号序列，总长不到lkb。由于第三代腺病毒载体具有载体包装能力强、细胞毒性反应低等优点，而备受研究者关注，为此，我们提出一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种携带klotho启动基因的重组腺病毒，通过将klotho启动基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp中获得；
8.构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为padtrack
‑
cmv；
9.构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为padeasy
‑
1；
10.构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293a细胞。
11.本发明还提供了一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，包括以下步骤：
12.s1、目的基因klotho启动基因的获取：提取klotho启动基因的总mrna，逆转录合成cdna模板，使用primer5.0软件设计针对klotho启动基因全长的特异性引物，在上游引物加入bamhi酶切位点及kozak序列，在下游引物加入hindiii酶切位点，上游引物和下游引物分别符合seqid2&seqid3的核苷酸序列；
13.seqid2agaggatccaccaccatggccaccaataaggag，
14.seqid3atcaagctttcaggggccctggtcaggttgg；
15.s1.1、用2
×
pfupcrmastermix进行体外touch
‑
downpcr扩增获得目的基因rarγ，符合seqid1的核苷酸序列；
16.s2、klotho启动基因片段的获得与重组穿梭质粒的构建；
17.s2.1、采用无缝克隆技术将klotho启动基因插入穿梭质粒载体载体padtrace
‑
tox中，得到克隆载体puc57
‑
plcγ2；
18.s2.2、以克隆载体puc57
‑
plcγ2为模板，以forwardprimerrewardprimer为引物，pcr扩增，凝胶回收扩增产物plcγ2，并利用smai将扩增产物plcγ2酶切，凝胶回收得到plcγ2酶切产物；
19.s2.3、以smai酶切腺病毒穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到mcmv酶切产物；
20.s2.4、利用dnat4连接酶将plcγ2酶切产物和mcmv酶切产物连接，得到重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2。
21.优选的，根据步骤s1.2所述：
22.forwardprimer的序列为：
[0023]5’‑
ctgcaggtcggatccagacccgggatgaccaccatggtcaacgtgga
‑3’
；
[0024]
rewardprimer的序列为：
[0025]5’‑
tctgtagaattcggtcccgggggagtagaacctgctgttactca
‑3’
。
[0026]
优选的，根据权利要求2所述的细胞构建方法还包括以下步骤：
[0027]
s3重组klotho启动基因的构建；
[0028]
s3.1、将hek293细胞接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，于5％co2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70
‑
80％时，将重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2和腺病毒骨架载体phbad
‑
bhg经转染试剂lipofitertm介导，共转染hek293细胞，得到细胞混合物；
[0029]
s3.2、将所述细胞混合物接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，按“8”字形晃动，5％co2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的dmem完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种p1；
[0030]
s3.3、用第一代毒种p1感染密度为90％的hek293细胞，收集第二代毒种p2；
[0031]
s3.4、用第二代毒种p2感染密度为90％的hek293细胞，收集第三代毒种p3，所述第三代毒种p3即为携带klotho启动基因重组腺病毒。
[0032]
优选的，根据步骤s2.1中，所述穿梭质粒载体载体padtrace
‑
tox含有红色荧光(rfp)标签及多克隆区域前含有cmv真核启动子。
[0033]
优选的，所述携带klotho启动基因重组腺病毒在抗细胞衰老中的应用。
[0034]
优选的，所述携带klotho启动基因重组腺病毒在众多老年病中的应用。
[0035]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0036]
一、本发明针对构建klotho启动基因重组腺病毒以代替基因的模式，可以针对性对细胞生长情况进行调控，本发明的携带klotho启动基因重组腺病毒，对抗衰老细胞衰老中有着显著促进作用，为众多老年病的预防和治疗提供新的治疗思路。
[0037]
二、本发明是利用缺陷型腺病毒将klotho启动基因基因引入抗衰老药物中，使病毒能在宿主细胞中自主表达磷脂酶cγ2，提高细胞中该酶的水平，抑制细胞衰老，促进细胞繁殖，从而达到预防和治疗老年病的目的；
[0038]
三、获得腺病毒载体宿主范围广，能感染大多数的哺乳动物细胞，感染效率高；同时，纯化后的腺病毒可用于活体动物的研究，具有良好的生物安全性，且本发明构建过程中获得的重组腺病毒穿梭质粒padtrace
‑
rarγ能作为一般的真核表达质粒，通过脂质体转染介导真核细胞内rarγ基因的表达。
附图说明
[0039]
图1为本发明的构建方法流程示意图。
具体实施方式
[0040]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0041]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种携带klotho启动基因的重组腺病毒，其特征在于：通过将klotho启动基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp中获得；
[0042]
构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为padtrack
‑
cmv；
[0043]
构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为padeasy
‑
1；
[0044]
构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293a细胞。
[0045]
本发明还包括了一种携带klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，包括以下步骤：
[0046]
s1、目的基因klotho启动基因的获取：提取klotho启动基因的总mrna，逆转录合成cdna模板，使用primer5.0软件设计针对klotho启动基因全长的特异性引物，在上游引物加入bamhi酶切位点及kozak序列，在下游引物加入hindiii酶切位点，上游引物和下游引物分别符合seqid2&seqid3的核苷酸序列；
[0047]
seqid2agaggatccaccaccatggccaccaataaggag，
[0048]
seqid3atcaagctttcaggggccctggtcaggttgg；
[0049]
s1.1、用2
×
pfupcrmastermix进行体外touch
‑
downpcr扩增获得目的基因rarγ，符合seqid1的核苷酸序列；
[0050]
s2、klotho启动基因片段的获得与重组穿梭质粒的构建；
[0051]
s2.1、采用无缝克隆技术将klotho启动基因插入穿梭质粒载体载体padtrace
‑
tox中，得到克隆载体puc57
‑
plcγ2；
[0052]
s2.2、以克隆载体puc57
‑
plcγ2为模板，以forwardprimerrewardprimer为引物，pcr扩增，凝胶回收扩增产物plcγ2，并利用smai将扩增产物plcγ2酶切，凝胶回收得到plcγ2酶切产物；
[0053]
s2.3、以smai酶切腺病毒穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到mcmv酶切产物；
[0054]
s2.4、利用dnat4连接酶将plcγ2酶切产物和mcmv酶切产物连接，得到重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2。
[0055]
请参阅图1，根据步骤s1.2所述：
[0056]
forwardprimer的序列为：
[0057]5’‑
ctgcaggtcggatccagacccgggatgaccaccatggtcaacgtgga
‑3’
；
[0058]
rewardprimer的序列为：
[0059]5’‑
tctgtagaattcggtcccgggggagtagaacctgctgttactca
‑3’
。
[0060]
请参阅图1，根据权利要求2所述的细胞构建方法还包括以下步骤：
[0061]
s3重组klotho启动基因的构建；
[0062]
s3.1、将hek293细胞接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，于5％co2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70
‑
80％时，将重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2和腺病毒骨架载体phbad
‑
bhg经转染试剂lipofitertm介导，共转染hek293细胞，得到细胞混合物；
[0063]
s3.2、将所述细胞混合物接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，按“8”字形晃动，5％co2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的dmem完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种p1；
[0064]
s3.3、用第一代毒种p1感染密度为90％的hek293细胞，收集第二代毒种p2；
[0065]
s3.4、用第二代毒种p2感染密度为90％的hek293细胞，收集第三代毒种p3，所述第三代毒种p3即为携带klotho启动基因重组腺病毒；
[0066]
请参阅图1，根据步骤s2.1中，所述穿梭质粒载体载体padtrace
‑
tox含有红色荧光(rfp)标签及多克隆区域前含有cmv真核启动子；
[0067]
请参阅图1，所述携带klotho启动基因重组腺病毒在抗细胞衰老中的应用；
[0068]
请参阅图1，所述携带klotho启动基因重组腺病毒在众多老年病中的应用；
[0069]
工作原理：提取klotho启动基因的总mrna，逆转录合成cdna模板，使用primer5.0软件设计针对klotho启动基因全长的特异性引物，在上游引物加入bamhi酶切位点及kozak序列，在下游引物加入hindiii酶切位点，用2
×
pfupcrmastermix进行体外touch
‑
downpcr扩增获得目的基因rarγ，符合seqid1的核苷酸序列，再采用无缝克隆技术将klotho启动基因插入穿梭质粒载体载体padtrace
‑
tox中，得到克隆载体puc57
‑
plcγ2，以克隆载体puc57
‑
plcγ2为模板，以forwardprimerrewardprimer为引物，pcr扩增，凝胶回收扩增产物plcγ2，并利用smai将扩增产物plcγ2酶切，凝胶回收得到plcγ2酶切产物，再以smai酶切腺病毒穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到mcmv酶切产物，利用dnat4连接酶将plcγ2酶切产物和mcmv酶切产物连接，得到重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2，最后，将hek293细胞接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，于5％co2、37℃环境中培养，当细胞密度达到70
‑
80％时，将重组穿梭质粒phbad
‑
mcmv
‑
gfp
‑
plcγ2和腺病毒骨架载体phbad
‑
bhg经转染试剂lipofitertm介导，共转染hek293细胞，得到细胞混合物，再将将所述细胞混合物接种于含10％fbs的dmem完全培养液中，按“8”字形晃动，5％co2、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的dmem完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下进行冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到第一代毒种p1，用第一代毒种p1感染密度为90％的hek293细胞，收集第二代毒种p2，再用第二代毒种p2感染密度为90％的hek293细胞，收集第三代毒种p3，所述第三代毒种p3即为携带klotho启动基因重组腺病毒。
[0070]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。