本发明涉及医药化合物技术领域，具体而言，涉及一种山胡椒提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
炎症是具有血管系统的活体组织在致炎因子的作用下，机体采取的自我组织修复，排除损伤细胞和外来抗原的一种以防御为主的复杂防御反应。炎症反应分为急性和慢性两种，急性炎症以所说的“红、肿、热、痛”为主要症候，表现为淋巴细胞浸润和激活，具有免疫和防御功能，可以防控病原体的侵入和损害。但是如果致炎因子持续存在并且损伤组织，则可引起慢性炎症，进而产生各种如类风湿性关节炎，糖尿病，矽肺，甚至癌症等疾病。目前临床常用的抗炎药物主要有非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。他们在一定程度上具有良好的抗炎效果，但身体长期或者大剂量使用会产生一系列不良反应和耐受性，如严重的胃肠道损伤、肝脏损伤、心血管毒性风险、肾脏损害等。为解决药物的不良反应及耐受性，寻找新的抗炎药物类型以及相关新颖骨架类型的药物一直以来是抗炎药物研究领域的热点。
天然产物是新药发现的重要来源，由于其具有结构多样性和广泛的生物活性，是人类预防和治疗疾病的重要药物前体分子。全世界现有药物中大约有62％药物来源于天然产物或者来源于天然产物的结构修饰物。植物是天然药物的重要组成部分，地球上植物资源丰富，代谢产物种类繁多，从植物中发现先导化合物是获得新药候选化合物和新药的重要途径。其次植物的代谢产物具有广泛的生理活性，如抗炎，抗菌，抗肿瘤，免疫调节，酶抑制等多种活性。从植物中寻找新的药源分子一直是药物研究领域的热点。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种山胡椒提取物及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种山胡椒提取物，其结构式如式i所示：
第二方面，本发明提供一种如前述实施方式所述的山胡椒提取物的制备方法，其包括：
将山胡椒根粉末经甲醇提取，提取液浓缩得到浓缩浸膏，将所述浓缩浸膏加水混悬并用石油醚萃取，得到石油醚萃取物；
将所述石油醚萃取物用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，流动相为体积比为100-25:1的石油醚和丙酮，收集石油醚：丙酮体积比为35-25:1时的洗脱液，浓缩后，以凝胶sephadexlh-20层析，用甲醇-氯仿为洗脱剂进行凝胶色谱分离即得到结构式为式i的山胡椒提取物。
在可选的实施方式中，甲醇提取所述山胡椒根粉末包括：用甲醇冷浸渗滤提取所述山胡椒根粉末2-4次，每次浸泡45-55h。
在可选的实施方式中，所述凝胶sephadexlh-20层析中选用sephadexlh-20羟丙基葡聚糖凝胶。
在可选的实施方式中，所述甲醇-氯仿的体积比为1-2:1。
在可选的实施方式中，所述山胡椒根粉末是将山胡椒根粉碎至10-30目所得。
第三方面，本发明提供一种抗炎组合物，其包括如前述实施方式所述的山胡椒提取产生的新化合物。
在可选的实施方式中，其还包括医学上可接受的药用辅料。
第四方面，本发明提供前述实施方式所述的山胡椒提取物在制备抗炎药物中的应用。
第五方面，本发明提供前述实施方式所述的山胡椒提取物在制备能够抑制lps诱导no产生的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明从山胡椒(linderaglauca)植物中分离得到一个长链secobutanolide衍生物secosubamolidef(即本申请中具有式i结构式的山胡椒提取物)，该新化合物具有显著抑制lps诱导的no的产生，其ic50为：1.73±0.18μm，具有抗炎治疗的临床应用潜力，可用于制备抗炎药物，应用前景好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种山胡椒提取物，其结构式如式i所示：
本申请中，将式i所示的化合物命名为secosubamolidef，其为长链secobutanolide衍生物。经过实验证实，山胡椒(linderaglauca)植物来源的长链secobutanolide衍生物secosubamolidef具有显著抑制lps诱导的no的产生，具有抗炎治疗的临床应用潜力，可用于制备抗炎药物。
因此，本申请中还提供了一种抗炎组合物，其包括如上述山胡椒提取产生的新化合物。在可选的实施方式中，抗炎组合物还包括医学上可接受的药用辅料。
进一步地，本发明提供前述实施方式所述的山胡椒提取物在制备抗炎药物中的应用。
进一步地，本发明提供前述实施方式所述的山胡椒提取物在制备能够抑制lps诱导no产生的药物中的应用。
此外，本申请还提供了一种仅作为示例性的上述山胡椒提取物的制备方法，其包括：
s1、山胡椒根药材来源：
采自湖北省巴东县野三关镇黄连坪村(小地名)林边(东经110.4470°；北纬30.7057°；海拔1203m)，经广州中医药大学彭光天博士鉴定为樟科山胡椒属植物山胡椒(linderaglauca)的根。将山胡椒(linderaglauca)植物的根晒干，粉碎至10-30目。
s2、粗提：
将山胡椒根粉末经甲醇冷浸渗滤提取2-4次，每次浸泡45-55h，提取液浓缩得到浓缩浸膏，将浓缩浸膏加水混悬并用石油醚萃取，具体来说，将浓缩浸膏用蒸馏水混悬分散均匀，加石油醚萃取至无色，浓缩石油醚馏分即得石油醚萃取物。
s3、分离纯化：
将石油醚萃取物用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，流动相为体积比为100-25:1的石油醚和丙酮，收集石油醚：丙酮体积比为35-25:1时的洗脱液，浓缩后，以凝胶sephadexlh-20层析，用甲醇-氯仿(体积比为1-2:1)为洗脱剂进行凝胶色谱分离即得到结构式为式i的山胡椒提取物。
优选地，在进行梯度洗脱时，流动相石油醚和丙酮的体积比从100:1→55-45:1→35-25:1。
在可选的实施方式中，凝胶sephadexlh-20层析中选用sephadexlh-20羟丙基葡聚糖凝胶。
本发明从山胡椒(linderaglauca)植物中分离得到一个长链secobutanolide衍生物secosubamolidef，该新化合物具有显著抑制lps诱导的no的产生，其ic50为：1.73±0.18μm，具有抗炎治疗的临床应用潜力，可用于制备抗炎药物，应用前景好。
经申请人分析可以知道，本申请提供的结构式如式i的山胡椒提取物因其母核结构通式如式ii所示，其具有上述抗炎功效，应理解，对本申请的山胡椒提取物的常规取代物也具有相同或相似的功效，山胡椒提取物的取代物包括但不限于：secoisolancifolide(式iii)、secosubamolide(式iv)、secokotomolidea(式v)。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种山胡椒提取物，其结构式如式i所示：
其制备方法包括如下步骤：
(1)山胡椒根药材来源：
从湖北省巴东县野三关镇黄连坪村(小地名)林边(东经110.4470°；北纬30.7057°；海拔1203m)获得山胡椒根药材，经广州中医药大学彭光天博士鉴定为樟科山胡椒属植物山胡椒(linderaglauca)的根。将山胡椒植物根晒干，粉碎至20目；
(2)粗提：
将山胡椒根粉末经甲醇冷浸渗滤提取3次，每次浸泡48h，提取液浓缩得到浓缩浸膏，将浓缩浸膏用蒸馏水混悬分散均匀，加石油醚萃取至无色，浓缩石油醚馏分即得石油醚萃取物。
(3)分离纯化：
将石油醚萃取物用硅胶柱层析进行梯度洗脱，采用石油醚/丙酮溶剂按照体积比从100:1→50:1→30:1进行洗脱，收集石油醚/丙酮(30:1)洗脱液，浓缩后，以sephadexlh-20羟丙基葡聚糖凝胶进行层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行凝胶色谱分离即得到如式i所示的化合物secosubamolidef。
实验例1
对新化合物secosubamolidef进行结构测试解析，得到以下实验数据：
新化合物secosubamolidef：c19h30o4，(+)-hresimsm/z323.2220[m+h]+(计算值323.2222)。
化合物secosubamolidef的nmr数据见表1。
表1.化合物secosubamolidef的nmr数据(cdcl3，400mhz/100mhz,ppm)
实验例2：化合物secosubamolidef的抗炎细胞筛选模型
1.细胞的培养与处理
体外培养raw264.7细胞，使用含10％fbs的dmem高糖培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
2.化合物干预
(1)实验方法
将新化合物secosubamolidef或吲哚美辛溶解于dmso中，用培养基配成不同的药物浓度，每个浓度设3个平行复孔，并设置模型对照孔(只加lps)，空白对照孔(细胞和培养基)。
选择处于对数生长期的raw264.7细胞，以2×104cells/孔的密度种板，共培养12h后，将不同浓度的药物加入相应的96孔板中，2h后加入终浓度为1μg/ml的lps，诱导巨噬细胞分化成炎症状态。培养48h后，取细胞上清液50μl，加入一氧化氮检测试剂盒的griess试剂i和griess试剂ii各50μl，利用griess法测定no的含量。
抑制率＝[1-(notreat-nocontrol)/(nomodel-nocontrol)]×100％
实验例3：化合物对细胞活力的影响
mtt可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝色结晶，并沉积在活细胞中，而死细胞并无此功能。
实验方法
将化合物secosubamolidef或吲哚美辛溶解于dmso中，用培养基配成不同的药物浓度为100μm,50μm,25μm,12.5μm,6.25μm,3.125μm,1.563μm，每个浓度设3个平行复孔，并设置空白对照孔(细胞和培养基)。
选择处于对数生长期的raw264.7细胞，以2×104cells/孔的密度种板，共培养12h后，将不同浓度的药物加入相应的96孔板中，培养48小时后，每孔加入5mg/ml的mtt溶液10μl，培养4小时后，吸出培养基，再向每孔加入150μl的dmso。震荡摇匀。用酶标仪测定在570nm波长处的吸光度值(a)。药物对细胞生长的抑制作用以存活率表示，存活率越高，表示药物毒性越低。
存活率(％)＝[(a1–a0)/(a2–a0)]×100％，其中a0空白对照的吸光度值，a1为样品的吸光度值，a2为阳性对照孔的吸光度值。
测定200μm,100μm,50μm,25μm,12.5μm五个浓度的样品，绘制剂量–抑制率曲线，得出其cc50值。每个样品重复测定三次。
实验例2和实验例3的结果如表2所示：
表2化合物secosubamolidef对炎症因子no抑制率
结果表明：化合物secosubamolidef显示了较强的抗no产生的活性，其ic50为1.73±0.18μm其活性强于阳性对照吲哚美辛(ic50＝24.0±0.36)。化合物secosubamolidef在100μm浓度下，不显示有细胞毒活性，说明其具有很好的潜力进一步临床前研究。
综上所述，本发明从山胡椒(linderaglauca)植物中分离得到一个长链secobutanolide衍生物secosubamolidef(即本申请中具有式i结构式的山胡椒提取物)，该新化合物具有显著抑制lps诱导的no的产生，其ic50为：1.73±0.18μm，具有抗炎治疗的临床应用潜力，可用于制备抗炎药物，应用前景好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。