便携式核酸检测系统的制作方法

1.本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种便携式核酸检测系统。


背景技术：

2.新冠肺炎covid-19是由一种新型的冠状病毒sars-cov-2感染所致。
3.冠状病毒(coronavirus,cov)是一种包膜的单链rna病毒，在人类、及其它哺乳动物和鸟类中广泛传播，能引起呼吸系统、肠、肝及神经系统疾病。已知有7种冠状病毒使人类致病，其中4种如cov-229e,cov-oc43,cov-nl63和cov-hku1在人群中流行，常引起普通感冒症状。另外3种冠状病毒sars-cov,mers-cov和sars-cov-2具有高度的危险性，会导致严重的肺炎甚至死亡。
4.新冠病毒的防控措施中，早诊断、早隔离、早治疗是关键。病毒核酸检测是快速诊断 covid-19的重要手段，也是防控新冠疫情蔓延的重要技术保障。病毒核酸检测，从患者采集样本到完成检测报告，要经历许多步骤，包括样本采集、样本保存、样本传送至检测实验室、病毒灭活、细胞溶解、核酸提取、检测并出具检测报告。其中任何步骤出现一点问题都可能导致假阴性结果。而且，为了核酸检测，人们需赶往医院完成口鼻咽拭子的采样，在人员众多的医院核酸采样点，又会增加病毒传染的风险。因此，急需开发出家用的病原核酸检测系统。


技术实现要素：

5.本发明要解决目前包括病毒在内的病原体核酸检测不方便的技术问题，提供一种便携式核酸检测系统，该系统使人们在家里即可完成病原体核酸检测，操作步骤简单，且快速准确，使新型病毒等感染性疾病的疫情得到更有效的防控。
6.为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
7.一种便携式核酸检测系统，包括反应管、检测仪、离心装置、反应体系，
8.所述反应管包括管体、管盖、和穿刺部件，该穿刺部件设置于管体入口处内侧或设置于管盖的顶端；
9.所述检测仪包括壳体、壳盖，该壳盖上设有滤光屏，在所述壳体中设有凹槽，该凹槽内侧面上设置有蓝光灯，所述壳体内还设有与蓝光灯电连接的供电装置；
10.所述离心装置包括外壳、动力手柄、转盘、传动机构，所述转盘通过转轴安装于外壳的头部，该转盘上设有多个圆孔，所述传动机构分别与转轴和动力手柄连接，该动力手柄带动传动机构转动，所述传动机构通过转轴带动转盘转动；
11.所述反应体系包括混合酶、引物对、探针、缓冲液、及镁离子溶液。
12.在本发明的一种实施方式中，所述反应管设置于管体入口处内侧的穿刺部件为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔洞。
13.在本发明的另一种实施方式中，所述反应管设置于管盖顶端的穿刺部件为穿透管盖顶端的钉子形部件，可于管盖顶端外侧推动该穿刺部件。
14.所述管盖的顶端可开设有加样口。
15.所述管盖在其底部预先密封可刺破封口膜的前提下，管盖内部可通过管盖顶端的加样口加入反应液体。
16.所述检测仪的壳体盖上壳盖后，壳盖上的滤光屏位于凹槽对应的上方。
17.所述蓝光灯的波长为450-490nm。
18.所述离心装置的传动机构包括传动轴承或齿轮传动机构。
19.在本发明的一种实施方式中，所述离心装置的传动机构为齿轮传动机构，所述动力手柄在外力作用下带动齿轮传动机构转动，该齿轮传动机构通过转轴带动转盘转动。
20.在本发明的另一种实施方式中，所述离心装置的外壳内部还设有电机和供电装置，该电机分别与供电装置、传动机构连接，所述动力手柄上设有与供电装置连接的开关，通过该开关启动电机，所述传动机构在电机驱动下带动转盘转动。
21.优选的，所述反应体系为巢式rpa反应体系，包括第一次rpa反应体系和第二次rpa 反应体系。
22.所述第一次rpa反应体系的混合酶包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶，所述第二次rpa反应体系的混合酶包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶。
23.所述第一次rpa反应体系的引物对为外引物对，所述第二次rpa反应体系的引物对为内引物对。
24.所述核酸检测的rpa反应温度为37-42℃，优选rpa反应温度为39℃。
25.本发明的便携式核酸检测系统，使人们在家里即可完成病原体核酸检测，操作步骤简单，快速准确，使新型病毒等感染性疾病的疫情得到更有效的防控，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
26.图1是本发明便携式核酸检测系统反应管的立体结构示意图；
27.图2是本发明便携式核酸检测系统反应管的外观示意图；
28.图3是本发明便携式核酸检测系统反应管另一种实施方式的立体结构示意图；
29.图4是本发明便携式核酸检测系统检测仪的立体结构示意图；
30.图5是本发明便携式核酸检测系统检测仪打开壳盖的立体结构示意图；
31.图6是本发明便携式核酸检测系统离心装置的立体结构示意图；
32.图7是本发明便携式核酸检测系统离心装置的侧视图；
33.图8是本发明便携式核酸检测系统检测仪的检测结果示意图；
34.图9是使用本发明便携式核酸检测系统进行新冠病毒n基因nestrpa检测的结果图；
35.其中，在图1-7中：
36.1-反应管，11-管体，12-管盖，13-穿刺部件，14-穿刺部件圆锥侧面上的孔洞；
37.2-检测仪，21-壳体，22-壳盖，23-滤光屏，24-凹槽，25-蓝光灯；
38.3-离心装置，31-外壳，32-动力手柄，33-转盘，34-转轴，35-圆孔。
具体实施方式
39.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
40.本发明的便携式核酸检测系统，包括反应管1、检测仪2、离心装置3、反应体系，其中，
41.反应管1包括管体11、管盖12、和穿刺部件13，在本发明的一种实施方式中，穿刺部件13设置于管体11入口处内侧，该穿刺部件13为空心圆锥体形状，在其圆锥侧面上设有多个孔洞14(图1-2)；在本发明的另一种实施方式中，穿刺部件13设置于管盖12顶端，该穿刺部件13为穿透管盖12顶端的钉子形部件，可于管盖12顶端外侧推动该穿刺部件13(图3)。
42.如图4-5所示，检测仪2包括壳体21、壳盖22，壳盖22上设有滤光屏23，在壳体21 中设有凹槽24，该凹槽24内侧面上设置有蓝光灯25，壳体(21)内还设有与蓝光灯25电连接的供电装置。
43.如图6-7所示，离心装置3包括外壳31、动力手柄32、转盘33、传动机构，所述转盘 33通过转轴34安装于外壳31的头部，该转盘33上设有多个圆孔35，用于放入反应管1，所述传动机构分别与转轴34和动力手柄32连接，该动力手柄32带动传动机构转动，所述传动机构通过转轴34带动转盘33转动。在本发明的一种实施方式中，离心装置3的传动机构为齿轮传动机构，所述动力手柄32在外力作用下带动齿轮传动机构转动，该齿轮传动机构通过转轴34带动转盘33转动。在本发明的另一种实施方式中，离心装置3的外壳31内部还设有电机和供电装置，该电机分别与供电装置、传动机构连接，动力手柄32上设有与供电装置连接的开关，通过该开关启动电机，所述传动机构在电机驱动下带动转盘33转动。
44.本发明的反应体系包括混合酶、引物对、探针、缓冲液、及镁离子溶液，优选的，所述反应体系为巢式rpa反应体系，包括第一次rpa反应体系和第二次rpa反应体系。
45.所述第一次rpa反应体系的混合酶包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶，所述第二次rpa反应体系的混合酶包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶。
46.所述第一次rpa反应体系的引物对为外引物对，所述第二次rpa反应体系的引物对为内引物对。
47.所述核酸检测的rpa反应温度为37-42℃，优选rpa反应温度为39℃。
48.利用本发明的便携式核酸检测系统，以巢式rpa检测病毒的方法，包括以下步骤：
49.步骤一：使用病毒目的基因的一对外引物，对病毒dna进行第一次rpa反应，预扩增目的基因的第一片段；
50.步骤二：使用病毒目的基因的一对内引物，以步骤一扩增出的目的基因第一片段为模板，并在加入目的基因特异性信号探针的条件下进行第二次rpa反应，扩增目的基因的第二片段；
51.用检测仪检测带标记的探针信号，获得病毒核酸检测结果。
52.信号探针为带有信号标记的探针，通常为带有荧光素标记的探针，本发明具体实施例中使用的荧光素标记的探针为fam荧光素标记探针。
53.步骤一中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)， 25ul缓冲液v，2.1ul正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)，5ul待测样品，2.5ul 乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。
54.步骤二中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及
核酸外切酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物(10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul 探针(10um),全部预反应产物(约37ul)，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。
55.步骤一的rpa反应可在37-42℃进行，反应时间为5-20min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。
56.步骤二的rpa反应可在在37-42℃进行，反应时间为1-30min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。
57.通过检测仪实时观察检测结果。
58.实施例1
59.使用本发明的便携式核酸检测系统，以巢式rpa(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增技术)检测病毒，rpa反应采用图1-2所示的反应管。第一次rpa反应体系包含：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液v，2.1ul 正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)。第二次rpa反应体系包含：酶的冻干粉 (包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物(10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul探针(10um)，2.5ul乙酸镁(280mm)。
60.进行巢式rpa检测时，先将第一次rpa反应体系、采集的待测样本、2.5ul乙酸镁(280mm)加在管盖12内，并用封口膜(parafilm)封住管盖12开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体11中预先加入第二次rpa反应体系，再将封有封口膜的管盖12盖入管体11中，此时设置于管体11入口处内侧的穿刺部件13会刺破管盖12开口处的封口膜，使管盖12内的第一次rpa反应产物通过穿刺部件13圆锥侧面上的孔洞14全部流入管体11中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合，将反应管1放入离心装置3的圆孔35中，通过手握动力手柄32使转盘33快速转动，实现对反应管中混合物的离心，再在恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应。
61.最后用检测仪2检测巢式rpa反应结果，将含有rpa反应物的反应管1放置于检测仪2 壳体21的凹槽24中，再盖上壳盖22，打开检测仪2开关开起蓝光灯25，即可透过棕色滤光屏23清晰地观察到放置于凹槽24中的rpa反应物在蓝光灯25照射下显示出的绿色荧光结果(见图8)，rpa反应物在蓝光灯下显示浑浊即含大量荧光的样本为含有病毒核酸的阳性样本，rpa反应物在蓝光灯下显示澄清无荧光的样本为不含有病毒核酸的阴性样本，检测判断十分方便，且判断结果准确可靠。
62.实施例2
63.使用本发明的便携式核酸检测系统，以巢式rpa(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增技术)检测病毒，rpa反应采用图1-2所示的反应管，其管盖2的顶端开设有加样口。第一次rpa反应体系包含：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液v，2.1ul正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)。第二次 rpa反应体系包含：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶)， 25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物(10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul探针(10um)， 2.5ul乙酸镁(280mm)。
64.使用管盖2顶端开设有加样口的反应管1进行巢式rpa检测时，先将管盖12下面开口用封口膜密封，再从管盖12顶端的加样口加入第一次rpa反应体系、以及采集的待测样本
和2.5ul乙酸镁(280mm)，封上加样口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体11中预先加入第二次rpa反应体系，再将封有封口膜的管盖12盖入管体11中，此时设置于管体11入口处内侧的穿刺部件13会刺破管盖12开口处的封口膜，使管盖12内的第一次rpa反应产物通过穿刺部件13圆锥侧面上的孔洞14全部流入管体11中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合，将反应管1放入离心装置3的圆孔35中，通过手握动力手柄32使转盘33快速转动，实现对反应管中混合物的离心，再在恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应。最后用检测仪2检测巢式rpa 反应结果，操作同实施例1。
65.实施例3
66.使用本发明的便携式核酸检测系统，以巢式rpa(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增技术)检测病毒，rpa反应采用图3所示的反应管。第一次rpa反应体系包含：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液v，2.1ul正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)。第二次rpa反应体系包含：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物 (10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul探针(10um)，2.5ul乙酸镁(280mm)。
67.进行巢式rpa检测时，先将第一次rpa反应体系、采集的待测样本、2.5ul乙酸镁 (280mm)加在管盖12内，并用封口膜(parafilm)封住管盖12开口，然后将其置于恒温扩增仪中39℃条件下进行第一次rpa反应。当第一次rpa反应结束，在管体11中预先加入第二次rpa反应体系，再将封有封口膜的管盖12盖入管体11中，然后推动管盖12顶端外侧的穿刺部件13尾端，使穿刺部件13的尖锐头部往前运动，刺破管盖12开口处的封口膜，使管盖12内的第一次rpa反应产物全部流入管体11中，作为第二次rpa反应的模板，然后，混合，将反应管1放入离心装置3的圆孔35中，通过打开动力手柄32上的开关按钮，启动电机，使转盘33快速转动，实现对反应管中混合物的离心，再在恒温扩增仪中39℃条件下进行第二次rpa反应。最后用检测仪2检测巢式rpa反应结果，操作同实施例1。
68.实施例4
69.1.方法
70.使用本发明便携式核酸检测系统进行nestrpa反应，检测新冠病毒核酸片段(含新冠病毒n基因片段的阳性质粒)，包括两个步骤：
71.步骤一：
72.巢式rpa(nestrpa)反应混合液i：5ul 10
×
ria反应缓冲液，10ul ria酶混合物(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶),13.5ul ria reaction core mix，2.4ul正向外引物 (10um)，2.4ul反向外引物(10um)，1ul dntp(25mm)。
73.将上述反应混合液i和5ul待测样品、2.5ul乙酸镁(280mm)加入反应管管盖内，封膜(parafilm封口膜)，平放，39℃恒温室孵育10min。
74.步骤二：
75.巢式rpa(nestrpa)反应混合液ii：5ul 10
×
ria反应缓冲液，10ul ria酶混合物(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，13.5ul ria reaction core mix，2.4ul正向内引物(10um)，2.4ul反向内引物(10um)，0.6ul probe n，1ul exonuclease iii，1ul dntp(25mm)。
76.将上述反应混合液ii，预先加入反应管管体内，待步骤一孵育完成后，将封膜的管盖扣于管体，用力向下按压，穿刺部件刺破封膜，然后震荡混匀2000转/分离心1分钟，第一次 rpa反应液即可在不打开盖子的前提下，顺利进入第二次rpa反应体系中，开始第二次核酸扩增反应。将反应管置于恒温检测仪中，设置39℃，反应时间30min，即可获得结果。
77.表1检测新冠n基因使用的特异性引物对与探针序列
[0078][0079]
2.结果
[0080]
使用本发明便携式核酸检测系统进行新冠病毒n基因nestrpa检测，阳性质粒样品检测结果为阳性，阴性对照(其他无关序列)及空白对照(水)样品检测结果为阴性(见图5)。
[0081]
本发明的便携式核酸检测系统，由于采用设有穿刺部件的反应管，使巢式rpa检测在第一次rpa反应结束之后，无需打开反应管盖子即可进行第二次rpa反应，有效避免了因开盖操作可能引起的气溶胶污染，显著增加了检测结果的精准性。本发明核酸检测系统的离心装置，操作简便高效。用于检测结果的检测仪，不仅使用和携带方便，而且能快速直观准确地给出rpa的检测结果。因此，本发明的核酸检测系统，非常适用于病毒等感染疾病相关核酸的居家检测，使人们在家即可早期发现疾病，尽早治疗或采取隔离措施。
[0082]
以上所述的实施方式较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。