用于筛选高产麦角甾醇食用菌的引物组合及其应用

1.本发明涉及生物技术领域中，用于筛选高产麦角甾醇食用菌的引物组合及其应用。


背景技术：

2.食用菌是一类具有多种营养和功能的真菌类群，既能直接作为食物，也可以作为某些营养品加工的原材料，具有重要的应用前景和经济价值。食用菌中具有丰富的活性成分及营养物质，如蛋白质、多糖、多酚、氨基酸、萜类、维生素及甾醇类物质等，从而赋予其具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗心血管疾病及抗糖尿病等多种重要的功能。近年来，随着食用菌产业的不断发展，人们对食用菌的需求也在不断加大，因此如何评估食用菌中的功能分子从而开发功能多样性的食用菌产品以满足人们的需求，成为了当前急需解决的问题。
3.麦角甾醇是食用菌中特征性的甾醇类物质，主要存在于真菌的细胞膜中，常以游离态或酯化的形式存在，是真菌生物量的重要标志之一。有研究表明，麦角甾醇对人体健康具有重要功能，包括抗肿瘤、抗炎、抗衰老及预防心血管疾病的发生等。另外麦角甾醇也是维生素d2的重要前体，在大多数食用菌中，麦角甾醇经紫外线照射可转化为维生素d2，进而调节机体的钙磷代谢及细胞增殖分化。因此对富含麦角甾醇的食用真菌进行筛选对开发功能多样性的食用菌产品及食品工业具有重要意义。
4.目前对食用菌中麦角甾醇的筛选多采用物理或化学的方法来进行，如uv法、tlc法、hplc法及gc法，这些方法虽然能够在一定程度上对食用菌中的麦角甾醇进行定量，但同时也存在着很大的缺陷。首先是操作过程十分繁琐，如在进行提取时需要进行一定的保护措施才能避免麦角甾醇的分解；其次是所使用的的化学试剂会对环境产生严重的污染，如氯仿、甲醇的使用；并且这些方法在测定时十分耗时，不适用于高通量的分析大批的食用菌产品。因此有必要寻找一种便捷高效的方法用于筛选富含麦角甾醇的食用菌产品，从而更好的为人类服务。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何快速筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合，该引物组合由引物对1和引物对2组成，所述引物对1由序列表中序列1和2所示的两条单链dna组成，所述引物对2由序列表中序列3和4所示的两条单链dna组成。
7.所述引物对1中的两条单链dna均可独立包装，也可包装在一起，这两条单链dna的摩尔比可为1:1。所述引物对2中的两条单链dna均可独立包装，也可包装在一起，这两条单链dna的摩尔比可为1:1。
8.所述引物组合具有如下任一用途：
9.x1、检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量；
10.x2、制备检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量的产品；
11.x3、筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌；
12.x4、制备筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌的产品。
13.本发明还提供了所述引物组合的下述任一应用：
14.x1、检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量；
15.x2、制备检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量的产品；
16.x3、筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌；
17.x4、制备筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌的产品。
18.本发明还提供了一种试剂盒，其包括所述引物组合。
19.所述试剂盒可仅由所述引物组合组成，还可由所述引物组合与进行pcr扩增所需的试剂组成。
20.在本发明的一个实施例中，所述进行pcr扩增所需的试剂为2
×
santaq pcr mix(生工生物工程(上海)股份有限公司产品)。
21.所述试剂盒可用于检测或辅助检测食用菌或药用菌的麦角甾醇产量，或筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌。
22.本发明还提供了所述试剂盒的下述任一应用：
23.x1、检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量；
24.x2、制备检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量的产品；
25.x3、筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌；
26.x4、制备筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌的产品。
27.本发明还提供了下述y1或y2或y3的方法：
28.y1、检测或辅助检测食用菌或药用菌麦角甾醇产量性状的方法，包括：以待测食用菌或药用菌的基因组dna为模板，利用所述引物对1和所述引物对2分别进行pcr扩增，检测pcr产物，所述引物对1和所述引物对2中至少有一个引物对能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌的麦角甾醇含量大于或候选大于0.05％(质量百分比)，所述引物对1和所述引物对2均不能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌的麦角甾醇含量小于等于或候选小于等于0.05％(质量百分比)；
29.y2、筛选或辅助筛选高产麦角甾醇食用菌或药用菌的方法，包括：以待测食用菌或药用菌的基因组dna为模板，利用所述引物对1和所述引物对2分别进行pcr扩增，检测pcr产物，所述引物对1和所述引物对2中至少有一个引物对能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌为或候选为高产麦角甾醇的菌株，所述引物对1和所述引物对2均不能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌为或候选为低产麦角甾醇的菌株；
30.y3、鉴定或辅助鉴定食用菌或药用菌的麦角甾醇产量性状的方法，包括：以待测食用菌或药用菌的基因组dna为模板，利用所述引物对1和所述引物对2分别进行pcr扩增，检测pcr产物，所述引物对1和所述引物对2中至少有一个引物对能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌的麦角甾醇产量高于或候选高于所述引物对1和所述引物对2均不能扩增得到目的片段的待测食用菌或药用菌。
31.上述方法中，所述检测pcr产物可为检测所得pcr产物的大小或序列。
32.所述引物对1能扩增到的的目的片段的大小为450-1500bp，所述引物对2能扩增到
的目的片段的大小为600-800bp。
33.检测所得pcr产物的大小可通过电泳检测，也可通过测序完成。所述引物对1可显示为在400-1600bp之间有一条带。所述引物对2可显示为在500-1000bp之间有一条带。
34.所述引物对1的pcr扩增体系可为：待测菌株基因组dna 0.5μl，序列1所示的单链dna(10μmol/l)0.4μl，序列2所示的单链dna(10μmol/l)0.4μl，2
×
santaq pcr mix 5μl，ddh2o 3.7μl。
35.所述引物对2的pcr扩增体系可为：待测菌株基因组dna 0.5μl，序列3所示的单链dna(10μmol/l)0.4μl，序列4所示的单链dna(10μmol/l)0.4μl，2
×
santaq pcr mix 5μl，ddh2o 3.7μl。
36.所述引物对1和所述引物对2的pcr扩增条件均可为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃补延伸10min，4℃保存。
37.y1或y2的方法在生产麦角甾醇中的应用，也属于本发明的保护范围。
38.本发明中，所述食用菌可为伞菌目菌株。所述伞菌目菌株可为口蘑科(tricholomataceae)，泡头菌科(physalacriaceae)，伞菌科(agaricaceae)，丝膜菌科(cortinariaceae)，光茸菌科(cortinariaceae)，离褶伞科(lyophyllaceae)，小脆柄菇科(psathyrellaceae)，粪伞科(bolbitiaceae)，侧耳科(pleurotaceae)，鹅膏科(amanitaceae)或鸟巢菌科(nidulariaceae)菌株。
39.进一步，所述口蘑科菌株可为lepista sordida菌株。
40.所述泡头菌科菌株可为flammulina velutipes或oudemansiella raphanipes菌株。
41.所述伞菌科菌株可为coprinus comatus、agaricus sp.、agaricus bisporus、agaricus bitorquis、agaricus subrufescens或agaricus xanthodermus菌株。
42.所述丝膜菌科菌株可为hebeloma sp.菌株。
43.所述光茸菌科菌株可为lentinula edodes菌株。
44.所述离褶伞科菌株可为hypsizygus marmoreus菌株。
45.所述小脆柄菇科菌株可为psathyrella bivelata、psathyrella sulcatotuberculosa、psathyrella candolleana、coprinellus radians或coprinopsis atramentaria菌株。
46.所述粪伞科菌株可为agrocybe pediades、agrocybe aegirit或panaeolus retirugis菌株。
47.所述侧耳科菌株可为pleurotus geesteranus、pleurotus sajor-caju、pleurotus eryngii或pleurotus ostreatus菌株。
48.所述鹅膏科菌株可为amanita sp.菌株。
49.所述鸟巢菌科菌株可为cyathus sp.菌株。
50.本发明的引物组合可用于筛选食用菌中高产麦角甾醇的菌株，准确性可达86.7％。虽然已有研究方法能够对食用菌中的甾醇类化合物进行检测，如uv法、tlc法、hplc法、gc法等，但这些操作方法十分繁琐耗时，且对环境并不友好；而利用本发明的引物组合能够简便高效的对大量的食用菌进行筛选，在工业生产中具有十分突出的优势。本发明的方法不仅可用于伞菌目食用菌的筛选也可用于其他目食用菌或药用菌的筛选，除此之外该
方法不仅适用于麦角甾醇的筛选同时也适用于其他甾醇类化合物的筛选，具有广泛的应用前景。
附图说明
51.图1pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。a.引物对1的电泳结果，b.引物对2的电泳结果。marker为dna分子量标准。
52.图2麦角甾醇标准曲线。
53.图3待测菌株中麦角甾醇产量。
54.图4pcr和hplc的结果的比对。黑色表示阴性，空白表示阳性。
具体实施方式
55.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
56.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
57.lmm培养基为无菌培养基，由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为：葡萄糖10g/l，20
×
nitrate salts 50ml/l，1000
×
trace elements1ml/l，酵母提取物5g/l，ph 6.5。其中，20
×
nitrate salts的制备方法如下：nano3120g，kcl 10.4g，mgso4·
7h2o 10.4g，kh2po
4 30.4g，利用超纯水溶解后定容至1l，121℃高温蒸汽灭菌20min，室温保存；1000
×
trace elements的制备方法如下：znso4·
7h2o 2.2g，h3bo
3 1.1g，mncl2·
4h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.16g，cocl2·
6h2o0.16g，cuso4·
5h2o 0.16g，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 0.11g，na2edta 5g，利用超纯水溶解后定容至100ml，用koh调节ph至6.5，室温保存。
58.pdb培养基为sigma-aldrich产品，货号：p6685。
59.实施例1：用于检测高产麦角甾醇食用菌的引物组合的制备
60.本实施例提供了一种用于检测高产麦角甾醇食用菌的引物组合，其由引物对1与引物对2组成。
61.引物对1由序列表中序列1所示的单链dna(记为erg1 ag_les f1，上游引物)与序列表中序列2所示的单链dna(记为erg1 ag_les r1，下游引物)组成，两条单链dna独立包装，该引物对中各单链dna的摩尔比为1:1。
62.引物对2由序列表中序列3所示的单链dna(记为erg1 ag_les f2，上游引物)与序列表中序列4所示的单链dna(记为erg1 ag_les r2，下游引物)组成，两条单链dna独立包装，该引物对中各单链dna的摩尔比为1:1。
63.序列表中，y表示c或t，r表示a或g，s表示g或c，k表示g或t，m表示a或c。
64.实施例2：实施例1的引物组合在检测高产麦角甾醇食用菌中的应用
65.一、待测菌株
66.所用待测菌株为伞菌目中的12个科，共30个种的30个菌株，各菌株如表1所示。
67.表1、菌株信息
[0068][0069][0070]
其中，lepista sordida记载在“plant growth inhibitors from the culture broth of fairy ring-forming fungus lepista sordida，mycoscience 58(2017)387e390”一文中；
[0071]
flammulina velutipes记载在“homocitrate synthase expression and lysine content in fruiting body of different developmental stages in flammulina velutipes，curr microbiol 70(2015)821
–
828，doi 10.1007/s00284-015-0791-0”一文中；
[0072]
oudemansiella raphanipes记载在“what is the radicate oudemansiella cultivated in china？phytotaxa 286(1):001
–
012，http://dx.doi.org/10.11646/phytotaxa.286.1.1”一文中；
[0073]
coprinus comatus记载在“spore formation and karyological characterization of basidiosporogenesis,meiosis,post-meiotic and nuclear migration mitosis in coprinus comatus，mycoscience 61(2020)122e127”一文中；
[0074]
agaricus sp.记载在“antioxidant activity of agaricus sp.mushrooms by chemical,biochemical and electrochemical assays，food chemistry 111(2008)61
–
66”一文中；
[0075]
agaricus xanthodermus记载在“fungal portraits，no.55agaricus xanthodermus，geoffrey kibby 14(3)，doi:10.1016/j.fl dmyc.2013.06.003”一文中；
[0076]
agaricus blazei记载在“isolation and purification of acidic polysaccharides from agaricus blazei murill and evaluation of their lipid-lowering mechanism，international journal of biological macromolecules 157(2020)276
–
287”一文中；
[0077]
agaricus bisporus记载在“viral diseases of agaricus bisporus，the button mushroom，encyclopedia of virology,4th edition,volume 4 doi:10.1016/b978-0-12-809633-8.21515-x”一文中；
[0078]
agaricus bitorquis记载在“formation of interspecies fusants of agaricus bisporus and agaricus bitorquis mushroom by protoplast fusion,indian j.microbiol.47 2007 369
–
372”一文中；
[0079]
agaricus subrufescens记载在“development of polymorphic microsatellite markers issued from pyrosequencing technology for the medicinal mushroom agaricus subrufescens，fems microbiol lett 334(2012)119
–
126”一文中；
[0080]
macrolepiota sp.记载在“macrolepiota in korea:new records and a new species,mycobiology，47(2019)368-377”一文中；
[0081]
hebeloma sp.记载在“identification of nitrogen mineralization enzymes，l-amino acid oxidases,from the ectomycorrhizal fungi hebeloma spp.and laccaria bicolor，mycological research 112(2008)1453
–
1464”一文中；
[0082]
lycoperdon sp.记载在“phylogenetic relationships among species and genera of lycoperdaceae based on its and lsu sequence data from north european taxa，mycological research，112(2008)4-22”一文中；
[0083]
lentinula edodes记载在“mycoviral diversity and characteristics of a negative-stranded rna virus lensrv1 in the edible mushroom lentinula edodes，virology 555(2021)89
–
101”一文中；
[0084]
agrocybe pediades记载在“expression,gene cloning,and characterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi:peniophora lycii,agrocybe pediades，a ceriporia sp.,and trametes pubescens，applied and environmental microbiology(2001)4701
–
4707”一文中；
[0085]
agrocybe aegirit记载在“immobilization ofβ-glucosidase by self-catalysis and compared to crosslinking with glutaraldehyde，international journal of biological macromolecules，154(2020)1490-1495”一文中；
[0086]
panaeolus retirugis记载在“two new biologically active illudane sesquiterpenes from the mycelial cultures of panaeolus retirugis,the journal of antibiotics,57(2004)721-725”一文中；
[0087]
hypsizygus marmoreus记载在“genetic and functional analysis of the zn(ii)2cys6transcription factor hada-1in hypsizygus marmoreus，applied microbiology and biotechnology，https://doi.org/10.1007/s00253-021-11175-4”一文中；
[0088]
pleurotus geesteranus记载在“umami taste and its association with energy status in harvested pleurotus geesteranus stored at different temperatures，food chemistry 279(2019)179
–
186”一文中；
[0089]
pleurotus sajor-caju记载在“effect of pre-supplementation with pleurotus sajor-caju crude extracts on body weight and consequence responses of leukocytes and immune organs in fancy carp following inoculation with aeromonas veronii，veterinary world,eissn:2231-0916”一文中；
[0090]
pleurotus eryngii记载在“advances allowing feasible pyrg gene editing by a crispr-cas9 system for the edible mushroom pleurotus eryngii，fungal genetics and biology 147(2021)103509”一文中；
[0091]
pleurotus ostreatus记载在“identification of hydrophobin genes and their physiological functions related to growth and development in pleurotus ostreatus，microbiological research 247(2021)126723”一文中；
[0092]
psathyrella bivelata记载在“a revision of the genus psathyrella,with a focus on subsection spadiceogriseae，fungal systematics and evolution，4(2019)97
–
170”一文中；
[0093]
psathyrella subsingeri记载在“the northeast chinese species of psathyrella(agaricales,psathyrellaceae)，mycokeys 33:85
–
102(2018)，doi:10.3897/mycokeys.33.24704”一文中；
[0094]
psathyrella sulcatotuberculosa记载在ncbi数据库中，genbank登录号为mn523296.1；
[0095]
psathyrella candolleana记载在“cytotoxic ergosterols from cultures of the basidiomycete psathyrella candolleana，fitoterapia 138(2019)104289”一文中；
[0096]
coprinellus radians记载在“terpenoids from the fermented broths of coprinellus radians，natural product communications 11(9)2016”一文中；
[0097]
coprinopsis atramentaria记载在“coprinopsis atramentaria extract,its organic acids,and synthesized glucuronated and methylated derivatives as antibacterial and antifungal agents，doi:10.1039/c4fo00490f”一文中；
[0098]
amanita sp.记载在“validation of two amanita species from eastern north america:a.rhacopus sp.nov.and a.variicolor sp.nov.，mycokeys 38(2018)47
–
57”一文中；
[0099]
cyathus sp.记载在“the potential of cyathus africanus for transformation of terpene substrates，phytochemistry 82(2012)61
–
66”一文中。
[0100]
二、待测菌株基因组dna的提取
[0101]
分别从4℃保存的上述菌种中挑取小块置于新鲜的pda平板上进行活化，28℃倒置
培养2-3d，再将其转接到新鲜的pda平板上，28℃培养5-7d后，作为种子菌株备用。
[0102]
用无菌打孔器在pda平板上获得直径为1cm的菌饼，打碎后置于液体培养基lmm中，静置培养3-5d，挑取部分菌丝吸干培养基，置于1.5ml离心管中，通过广谱植物基因组dna快速提取试剂盒法或改良的ctab法或其他方法提取得到各菌株的基因组dna。
[0103]
三、pcr扩增
[0104]
利用实施例1的引物对1和引物对2分别对步骤二所得各菌株的基因组dna进行pcr扩增，每个菌株均有一个引物对1的反应体系和一个引物对2的反应体系。
[0105]
pcr反应体系为10μl：待测菌株基因组dna 0.5μl，上游引物(10μmol/l)0.4μl，下游引物(10μmol/l)0.4μl，2
×
santaq pcr mix 5μl，ddh2o 3.7μl。其中，2
×
santaq pcr mix为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。以水替代待测菌株基因组dna作为阴性对照(ck)。
[0106]
pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃补延伸10min，4℃保存。
[0107]
在pcr扩增完成以后对所得pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。引物对1在30株菌株中共有16株能得到目的条带(大小为450-1500bp)，共有14株未能扩增出条带(这14个菌株分别为lepista sordida，flammulina velutipes，oudemansiella raphanipes，coprinus comatus，agaricus blazei，macrolepiota sp.，lycoperdon sp.，psathyrella candolleana，agrocybe pediades，pleurotus geesteranus，pleurotus sajor-caju，pleurotus eryngii，pleurotus ostreatus和amanita sp.)，表明了引物对1不适用于该14株菌株的检测。引物对2在30株菌株中共有21株能得到目的条带(大小为600-800bp)，9株未扩增出条带(这9个菌株分别为agaricus blazei，agaricus bisporus，macrolepiota sp.，lentinula edodes，lycoperdon sp.，psathyrella sulcatotuberculosa，agrocybe aegirit，amanita sp.和cyathus sp.)，表明了引物对2不适用于该9株菌株的检测。
[0108]
综合分析引物对1和引物对2的pcr结果，在30株菌株中仅有4株未扩增出目标条带(这4个菌株分别为agaricus blazei，macrolepiota sp.，lycoperdon sp.和amanita sp.)，记为pcr结果阴性；剩余26株菌株引物对1和引物对2均至少能得到一条目标条带，记为pcr结果阳性。
[0109]
四、待测菌株中麦角甾醇的定量分析
[0110]
1、麦角甾醇标准曲线的制备：
[0111]
准确称取麦角甾醇(上海源叶生物科技有限公司，货号是b20833)10mg，用甲醇氯仿溶液(甲醇、氯仿的体积比为10:1)配制成1mg/ml的麦角甾醇母液，向麦角甾醇母液中加入酮康唑(北京索莱宝科技有限公司，货号是k8090，作为内标)，得到标准液，标准液中内标酮康唑的浓度为0.6mg/ml。将上述标准液利用甲醇氯仿溶液(甲醇氯仿的体积比为10:1)依次稀释成麦角甾醇浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的稀释液，各稀释液中内标酮康唑浓度均为0.6mg/ml，各个稀释液分别取200μl进行hplc检测分析，再以麦角甾醇浓度为横坐标、麦角甾醇与酮康唑的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。hplc检测条件如下：
[0112]
样品进样10μl，流速为1ml/min，检测波长280nm；
[0113]
流量为：0-10min，乙腈水溶液(溶剂为甲酸体积百分比含量为0.1％的甲酸水溶
液)，乙腈的体积百分比由5％匀速升至100％；
[0114]
10-30min，乙腈；
[0115]
30.1-35min，乙腈水溶液(溶剂为甲酸体积百分比含量为0.1％的甲酸水溶液)，乙腈的体积百分比由100％匀速降至5％。
[0116]
获得麦角甾醇标准曲线如图2所示，由于r2趋向于1，表明回归方程线性关系良好，可用于对麦角甾醇进行定量研究。
[0117]
2、筛选菌株的发酵及麦角甾醇产量的测定：
[0118]
首先用无菌打孔器在培养待测菌株的pda平板上获得直径为1cm的菌饼，打碎后置于20ml液体培养基pdb中，26℃、180rpm黑暗培养10天，将所得发酵液过滤，收集菌体沉淀用蒸馏水洗涤2-3次，将菌体吸干水分后置于真空冷冻干燥机中冻干48h，得到冻干菌体。称取50mg冻干菌体加至500μl酮康唑氯仿溶液(酮康唑的浓度为0.6mg/ml)中，通过高通量组织研磨仪破碎菌体(70hz，1min)后，再加入500μl酮康唑氯仿溶液(酮康唑的浓度为0.6mg/ml)，超声10min，25℃振荡8h，得到菌体破碎液，取出所得菌体破碎液13000rpm离心10min，吸取上清置于新的1.5ml离心管，通过真空离心浓缩仪挥干有机溶剂，再向沉淀中加入300μl甲醇氯仿溶液(甲醇、氯仿的体积比为10:1)进行溶解，13000rpm离心10min，取上清200μl按照步骤四中的hplc检测条件进行hplc分析，注意整个过程的避光处理。
[0119]
根据步骤1所得标准曲线计算待测菌株中麦角甾醇质量百分比含量。各菌株中麦角甾醇质量百分比含量如表2和图3所示。
[0120]
表2、麦角甾醇质量百分比含量检测结果
[0121][0122][0123]
结果表明，不同菌株其产生麦角甾醇的能力差别较大，产生麦角甾醇较高的菌株有flammulina velutiper、agaricus blazei、coprinellus radians和lycoperdon sp.，其
产量均达到了其菌体重量的12％以上。另外在12个科中还有2株菌中的麦角甾醇呈现出了极低的产量，分别为psathyrella subsingeri和amanita sp.。其余菌株均能检测到较多的麦角甾醇产生。将麦角甾醇含量大于0.05％记为hplc结果阳性，将麦角甾醇含量小于或等于0.05％记为hplc结果阴性。
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五、检测结果的评价
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比较pcr和hplc的结果，在全部30株菌中，有25株菌的pcr和hplc的结果均为阳性，有1株菌的pcr和hplc的结果均为阴性；有4株菌的pcr结果与hplc的结果不一致，其中对于菌株psathyrella subsingeri，pcr验证结果显示为阳性，而hplc的结果显示为阴性，表明了本发明在检测这类菌株时会有呈现出一定的假阳性；而对于菌株agaricus blazei，macrolepiota sp.和lycoperdon sp.，pcr验证结果显示为阴性，而hplc的结果显示为阳性，表明了筛选引物可能不适用这几种菌株的筛选；对于菌株amanita sp.，pcr和hplc的验证结果均显示为阴性，证明了本发明在检测低产量麦角甾醇菌株时的可行性。说明，实施例1的引物组合可用于检测待测伞菌目菌株是否为高产麦角甾醇菌株，准确性为(25+1)/30
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100％＝86.7％，真阳性率(实际高产麦角甾醇而按pcr检测被正确判断为高产麦角甾醇的百分率)＝真阳性菌株数/(真阳性菌株数+假阴性菌株数)
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100％＝25/(25+3)
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100％＝89.3％，真阴性率(实际低产麦角甾醇而按pcr检测被正确判断为低产麦角甾醇的百分率)＝真阴性菌株数/(真阴性菌株数+假阳性菌株数)＝1/(1+1)
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100％＝50％。
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综上，该实施例1的引物组合能够广泛用于伞菌目中口蘑科，泡头菌科，伞菌科，丝膜菌科，光茸菌科，离褶伞科，小脆柄菇科，粪伞科，侧耳科，鹅膏科和鸟巢菌科菌株是否高产麦角甾醇的检测，并呈现出极高的检测效率。
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具体的，以待测伞菌目菌株为检测对象判断其麦角甾醇产量时，判断方法如下：以待测伞菌目菌株的基因组dna为模板，分别利用实施例1的引物对1和引物对2进行pcr扩增，如待测菌株的引物对1和引物对2至少有一个引物对能扩增到目标片段，该待测菌株为高产麦角甾醇菌株，麦角甾醇产量大于0.05％(质量百分比)；如待测菌株的引物对1和引物对2均不能扩增到目标片段，该待测菌株为低产麦角甾醇菌株，麦角甾醇产量小于等于0.05％(质量百分比)。
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以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。