恒温核酸扩增检测仪及其应用的制作方法

1.本发明涉及医学检测工具技术领域，尤其涉及一种恒温核酸扩增检测仪及其应用。


背景技术：

2.近年来，冠状病毒、新型冠状病毒、埃博拉病毒等各种病毒疫情频发，以及对女性身心健康造成极大危害的hpv病毒的感染，给人类的健康和生活造成了严重的影响。非洲猪瘟等动物疫病也给畜牧业和食品安全领域造成很大危害。为了防控这些病毒疫情，快速准确且高灵敏地检测出病毒的存在是关键。目前应用于病毒检测的方法包括核酸检测、抗原检测和抗体检测。其中病毒核酸检测是应用最为广泛的检测手段，适合疾病的早期发现和早期诊断。pcr是核酸检测中最主要的技术，其特异性好，但检测所需时间较长，灵敏度偏低，且检测所需设备较为昂贵，需要专用实验室进行核酸检测，不利于快速检测。
3.重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶)对dna模板进行特异性扩增，是一种恒温核酸扩增技术，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(36℃-42℃，5-30min)，作为一种恒温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，在病毒疫病快速检测方面具有广泛的应用前景。但是目前用于检测判别rpa结果的荧光分析装置结构复杂、价格昂贵、使用和携带不便，不利于rpa结果的快速直观判断，更不利于高灵敏度核酸检测技术进入家庭。为了实现疾病相关核酸的居家检测服务，以在家即可早期发现疾病，非常有必要研发基于rpa技术的便携式荧光检测设备。


技术实现要素：

4.本发明要解决目前荧光分析装置使用和携带不便的技术问题，提供一种恒温核酸扩增检测仪，该检测仪携带便利、使用方便，能快速直观准确地给出rpa的检测结果。
5.为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
6.在本发明的一个方面，提供了一种恒温核酸扩增检测仪，包括壳体、壳盖，该壳盖上设有滤光屏，在所述壳体中设有凹槽，该凹槽内侧面上设置有蓝光灯，所述壳体内还设有与蓝光灯电连接的供电装置。
7.所述供电装置包括电源、开关，该开关的操作部件位于壳体的外侧面。
8.所述壳体外侧面还设有充电接口；所述壳体的底部设有电池盒。本发明检测仪的电源可以通过充电接口充电，也可以在电池盒中安装电池。
9.所述壳盖与壳体的一边铰连接，方便操作。
10.优选的，所述凹槽的底面为黑色，因为黑色的背景有利于rpa荧光检测结果的观察和判断。
11.所述壳体盖上壳盖后，壳盖上的滤光屏位于凹槽对应的上方。
12.所述蓝光灯的波长为450-490nm。
13.在本发明的另一个方面，提供了一种上述恒温核酸扩增检测仪的应用，用于检测恒温核酸扩增的结果。
14.本发明的恒温核酸扩增检测仪，使用和携带方便，能快速直观准确地给出rpa的检测结果，具有非常好的应用前景。
附图说明
15.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
16.图1是本发明恒温核酸扩增检测仪的立体结构示意图；
17.图2是本发明恒温核酸扩增检测仪打开壳盖的立体结构示意图；
18.图3是本发明恒温核酸扩增检测仪的外观侧视图；
19.图4是本发明恒温核酸扩增检测仪的外观后视图；
20.图5是本发明恒温核酸扩增检测仪的外形照片图；
21.图6是本发明恒温核酸扩增检测仪的检测结果示意图；
22.图7是使用本发明恒温核酸扩增检测仪进行新冠病毒n基因nestrpa检测的结果图；
23.其中，在图1-4中：
24.1-壳体，2-壳盖，3-滤光屏，4-凹槽，5-蓝光灯，6-开关的操作部件，7-充电接口，8-电池盒。
具体实施方式
25.如图1-2所示，本发明的恒温核酸扩增检测仪，包括壳体1、壳盖2，该壳盖2上设有滤光屏3，在壳体1中设有凹槽4，凹槽4内侧面上设置有蓝光灯5，壳体1内还设有与蓝光灯5电连接的供电装置。
26.供电装置包括电源和开关，其中，开关的操作部件6位于壳体1的外侧面(见图3)。壳体1外侧面还设有充电接口7，壳体1的底部设有电池盒8(图4)。本发明恒温核酸扩增检测仪的电源可以通过充电接口7充电，也可以在电池盒8中安装电池。
27.在本发明的具体实施例中，壳盖2与壳体1的一边铰连接，方便实验者操作。凹槽4的底面为黑色，黑色的背景有利于荧光检测结果的观察和判断。当壳体1盖上壳盖2后，壳盖2上的滤光屏3位于凹槽4对应的上方(图5)。通过滤光屏3能清晰地观察到放置于凹槽4中的恒温核酸扩增反应物在蓝光灯5照射下显示出的荧光检测结果。蓝光灯5的波长为450-490nm。
28.使用本发明的检测仪进行检测时，只需将含有恒温核酸扩增(rpa)反应物的反应管放置于壳体1的凹槽4中，再盖上壳盖2，拨动开关的操作部件6开起蓝光灯，即可透过棕色滤光屏3清晰地观察到放置于凹槽4中的rpa反应物在蓝光灯5照射下显示出的绿色荧光结果(见图6)，rpa反应物在蓝光灯下显示浑浊即含大量荧光的样本为含有病毒核酸的阳性样本，rpa反应物在蓝光灯下显示澄清无荧光的样本为不含有病毒核酸的阴性样本，检测判断十分方便，且判断结果准确可靠。
29.实施例1
30.1.方法
31.使用恒温核酸扩增反应管进行nestrpa反应，检测新冠病毒核酸片段(含新冠病毒n基因片段的阳性质粒)，包括两个步骤：
32.步骤一：
33.nestrpa反应混合液i：5ul 10
×
ria reaction buffer，10ul ria enzyme mix(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶),13.5ul ria reaction core mix，2.4ul正向外引物(10um)，2.4ul反向外引物(10um)，1ul dntp(25mm)。
34.在灭菌的200ul ep管中配置上述反应混合液i，加入5ul待测样品，2.5ul乙酸镁(280mm)，立即进行振荡混匀，离心后使用移液枪，将全部溶液转移至恒温核酸扩增反应管管盖内，封膜(parafilm封口膜)，平放，39℃恒温室孵育10min。
35.步骤二：
36.nestrpa反应混合液ii：5ul 10
×
ria reaction buffer，10ul ria enzyme mix(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，13.5ul ria reaction core mix，2.4ul正向内引物(10um)，2.4ul反向内引物(10um)，0.6ul probe n，1ul exonuclease iii，1ul dntp(25mm)。
37.在灭菌的200ul ep管中配置上述反应混合液ii，预先加入恒温核酸扩增反应管管体内，待步骤一孵育完成后，将封膜的管盖扣于管体，用力向下按压，穿刺部件刺破封膜，然后震荡混匀2000转/分离心1分钟，第一次反应液即可在不打开盖子的前提下，顺利进入第二次反应体系中，开始第二次核酸扩增反应。将恒温核酸扩增反应管置于本发明的恒温核酸扩增检测仪中，设置39℃，反应时间1-30min，通过本发明的检测仪可实时观察获得结果。
38.表1检测新冠n基因使用的特异性引物对与探针序列
[0039][0040]
2.结果
[0041]
使用本发明恒温核酸扩增检测仪进行新冠病毒n基因nestrpa检测结果判断，阳性质粒样品检测结果为阳性，阴性对照(其他无关序列)及空白对照(水)样品检测结果为阴性(见图7)。
[0042]
以上所述的实施方式较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。