一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白、编码基因、重组腺相关病毒及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白、编码基因、重组腺相关病毒及其应用。

背景技术：

1、全球约有4.5亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)，其中中国约有1亿。慢性乙型肝炎病毒感染是个缓慢的过程，在这个过程中可以产生至少三种抗原：乙肝表面抗原(hbsag)、乙肝核心抗原(hbcag)、乙肝e抗原(hbeag)；其分别对应的抗体为：乙肝表面抗体(hbsab)、乙肝核心抗体(hbcab)、乙肝e抗体(hbeab)；并产生共价互补环状双链dna(cccdna)，cccdna是hbv前基因组rna复制的原始模板，虽然含量较少，每个肝细胞内只有约5-50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。在感染的中后期，有部分有前基因组rna逆转录产生的双链hbv dna整合到其宿主肝脏细胞的染色体dna上，这种整合是hbv感染由量变到质变的重大事件，从此慢性乙型肝炎→肝纤维化→肝硬化→肝癌基本上是一条直线发展。

2、虽然预防性乙肝疫苗已经上市多年，但仍然存在如下几个问题：(1)70年代及以前出生的人很大比例没有接种疫苗；(2)目前的疫苗有效保护率只有87％，也就是还有13％的免疫人群不能产生保护效果，因此风险很大；(3)预防性疫苗对已经感染hbv的患者是无效的。抗病毒药不能根治hbv感染，且副作用大，依从性差，容易产生抗药突变。干扰素根治率也很低，但流感样等副作用让患者依从性很差。总之，慢性乙肝对人类健康危害极大，研发有效的生物制品势在必行。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白、编码基因、重组腺相关病毒及其应用，该蛋白及其编码基因克服了机体免疫系统对hbv的免疫耐受，利用含有该编码基因的重组腺相关病毒进行免疫后，乙肝病毒载量明显下降，疫苗效力显著提高。

2、本发明还提供一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白，其氨基酸序列选自seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4所示的氨基酸序列中的一种。

3、具体地，从genbank查到序列m38454、af286594、d00630，经过生物信息学分析找出共有序列。hbsag由226个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq id no：1所示；hbcag由143个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq id no：2所示；pol由771个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq id no：3所示；scpol由1140个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq idno：4所示。

4、即，本发明还提供一系列优化的蛋白的氨基酸序列，其中包括：一种优化的hbsag氨基酸序列；一种优化的hbcag氨基酸序列；一种优化的hbv pol氨基酸序列；一种优化的hbsag-hbcag-pol氨基酸序列(顺序可以自由组合为6种)；一种优化的p1氨基酸序列；一种优化的s1氨基酸序列；一种优化的s2氨基酸序列；一种优化的s1+s2氨基酸序列；一种优化的hbsag-hbcag氨基酸序列；一种优化的hbcag-hbsag氨基酸序列等。

5、本发明提供一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的编码基因，其编码上述任一所述的蛋白。

6、具体地，本发明的用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的编码基因，选自核苷酸序列为seq id no：5的hbsag编码基因、核苷酸序列为seq id no：6的hbcag编码基因和核苷酸序列为seq id no：7的pol编码基因中的一种。

7、在本发明中，hbsag编码基因是针对人的遗传密码偏爱性全新设计的hbsag编码基因，其核苷酸序列如seq id no：5所示；该hbsag编码基因参考了c亚型的多个病毒株，序列充分考虑了不同病毒株的变异问题，具有广谱性。

8、在本发明中，hbcag编码基因是针对人的遗传密码偏爱性全新设计的hbcag编码基因，其核苷酸序列如seq id no：6所示；该hbcag编码基因参考了c亚型的多个病毒株，序列充分考虑了不同病毒株的变异问题，具有广谱性。

9、在本发明中，pol编码基因是针对人的遗传密码偏爱性全新设计的pol编码基因，其核苷酸序列如seq id no：7所示；该pol编码基因参考了c亚型的多个病毒株，序列充分考虑了不同病毒株的变异问题，具有广谱性。

10、进一步地，上述编码基因可以为融合基因；即，本发明还提供一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的融合基因，所述融合基因含有核苷酸序列为seq id no：5的hbsag编码基因、核苷酸序列为seq id no：6的hbcag编码基因和核苷酸序列为seq id no：7的pol编码基因中的至少两种。

11、本发明对上述融合基因的融合方式不作严格限制，融合基因可以为hbsag编码基因、hbcag编码基因和pol编码基因中的任意两者或者三者，其顺序可以自由组合。例如，融合基因可以为hbsag-hbcag融合基因、hbcag-hbsag融合基因、hbsag-hbcag-pol融合基因等，其中hbsag-hbcag-pol融合基因的顺序可以自由组合为6种。

12、在一实施方式中，融合基因可以是针对人的遗传密码偏爱性全新设计的scpol编码基因，其核苷酸序列如seq id no：8所示；该融合基因具有广谱性信息，与单独的抗原比且包含了更多的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位，因此清除病毒的能力更强、范围更广。

13、在另一实施方式中，融合基因还可以是针对人的遗传密码偏爱性全新设计的scpol编码基因及旁侧序列，其核苷酸序列如seq id no：9所示。

14、即，本发明提供上述一系列的优化编码基因序列，其中包括：一种优化的hbsag基因序列；一种优化的hbcag基因序列；一种优化的hbv pol基因序列；一种优化的hbsag-hbcag-pol基因序列(顺序可以自由组合为6种)；一种优化的p1基因序列；一种优化的s1基因序列；一种优化的s2基因序列；一种优化的s1+s2基因序列；一种优化的hbsag-hbcag基因序列；一种优化的hbcag-hbsag基因序列等。

15、本发明还提供上述任一所述的蛋白或上述任一所述的编码基因在制备用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的生物制品上的应用。

16、本发明还提供一种重组腺相关病毒穿梭质粒，其含有上述任一所述的编码基因。

17、在一实施方式中，重组腺相关病毒穿梭质粒的核苷酸序列如seq id no：10所示。

18、本发明还提供一种重组腺相关病毒，由上述的重组腺相关病毒穿梭质粒和辅助质粒共转染工程细胞后包装而成；优选地，所述辅助质粒为paav-rc载体和phelper载体；所述工程细胞为293细胞。

19、在本发明中，可以采用aav2包装载体与上述任意的基因进行重组以获得重组体；例如：aav2包装载体与hbsag-hbcag-pol基因序列(顺序可以自由组合为6种)的重组体；aav2包装载体与hbsag-hbcag基因序列的重组体；aav2包装载体与hbcag-hbsag基因序列的重组体等。此外，还可以采用aav其它血清型与上述任意的基因进行重组以获得重组体。

20、本发明还提供重组腺相关病毒在制备用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的疫苗上的应用。具体地，上述重组体的包装病毒体可以作为疫苗成分进行应用。

21、研究表明：hbsag、hbcag可以产生一定的细胞免疫，但目前尚没有成功的产品。腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)属于微小病毒科，是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制，病毒直径约20nm。两侧末端有反向重复序列(itr)，基因组编码cap和rep基因。itrs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。aav能感染多种细胞。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，作为转移载体之一被广为重视，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。aav载体疫苗，具有免疫稳定、持久、安全等特点。本发明引入aav载体，设计研发出安全有效的hbv预防/治疗性疫苗，有望攻克乙肝难题。

22、本发明的编码基因及其蛋白克服了机体免疫系统对hbv的免疫耐受，利用含有该编码基因的重组腺相关病毒进行免疫后，乙肝病毒载量明显下降，疫苗效力显著提高，有利于hbv治疗和/或预防性疫苗的开发及应用。