仿生硅化胶原材料的制备方法及其应用

本发明涉及仿生胶原材料技术，具体涉及仿生硅化胶原材料的制备方法及应用。

背景技术：

现有的仿生硅化胶原材料以往制备方法是用聚丙烯氯化铵作为胶原预处理剂，而聚丙烯氯化铵具有剂量依赖性毒性，限制了仿生硅化胶原材料的产业应用。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种仿生硅化胶原材料的制备方法。

为此，本发明所提供的制备方法包括将ace胶原在预处理液中浸泡得到仿生硅化胶原材料，所述预处理液由氯化胆碱和正硅酸溶液组成。

进一步，所述预处理液的ph值为5-6。

进一步，所述正硅酸溶液由silbond40、乙醇和水配置而成。

氯化胆碱是胆碱的盐酸盐，是一种高效的营养增补剂，作为维生素类产品，氯化胆碱广泛地应用于药品、保健品以及食品营养添加。本发明创新性地使用氯化胆碱作为胶原纤维仿生硅化的预处理剂和稳定剂，仅使用氯化胆碱合成了新型仿生硅化胶原支架材料(silicifiedcollagenscaffolds，scss)。单纯胆碱稳定的新型仿生硅化材料合成工艺简单，反应产物性能稳定，拥有潜在的临床应用前景。

信号素3a(semaphorin3a，sema3a)是一种可扩散的具有神经轴突化学趋化及生长导向作用的蛋白，在胚胎及神经系统发育、血管形成和肿瘤发生、免疫调节等多种生理过程中具有重要作用。sema3a属于信号素家族的分泌蛋白，为神经轴突导向因子，可由背根神经节等感觉神经元分泌(semaphoriniiicanrepulseandinhibitadultsensoryafferentsinvivo)。近年来，越来越多的研究表明在胚胎发育的过程中sema3a广泛表达,并影响了神经纤维的生长方向和聚集，因而sema3a被认为在神经生长、发育及损伤修复过程中发挥重要作用。本发明所构建的仿生硅化胶原材料具有良好的理化性能，新型仿生硅化材料促进了外周感觉神经轴突生长和激活感觉神经mtor信号通路分泌semaphorins3a。

基于此，本发明还提供了上述方法制备的仿生硅化胶原材料用于制备背根神经节细胞中sema3a分泌促进剂的应用。

进一步提供上述方法制备的仿生硅化胶原材料的浸提液用于制备背根神经节细胞中sema3a分泌促进剂的应用。

同时，本发明提供了硅酸用于制备背根神经节细胞中sema3a分泌促进剂的应用。

附图说明

图1为实施例1硅化前后的重组ⅰ型胶原支架，其中左侧为硅化前；右侧为硅化后；

图2为实施例1仿生硅化胶原支架和单纯胶原支架的形貌变化和元素分析；其中：a：扫描电镜镜下观察胶原支架(标尺＝500nm)b：元素分析；cs:单纯胶原支架；scs：硅化胶原支架；

图3为实施例1仿生硅化胶原支架透射电镜图(标尺＝200nm)；

图4为实施例1仿生硅化胶原支架和单纯胶原支架的红外光谱分析；

图5为实施例1制备的仿生硅化胶原支架的硅酸缓释曲线图；

图6为实施例1制备的仿生硅化胶原支架的孔隙率；

图7为实施例1制备的仿生硅化胶原支架的拉伸强度；

图8为实施例2中仿生硅化胶原支架浸提液背根神经节细胞形态影响的免疫荧光染色；(a)背根神经节细胞的代表性免疫荧光图像(比例尺：200μm)，(b)神经突起长度的定量分析，(c)神经元存活率的定量分析；

图9为实施例2中实时定量pcr检测硅化胶原支架浸提液对背根神经节各神经肽mrna表达的影响；

图10为实施例2中免疫荧光检测硅化胶原支架浸提液对背根神经节sema3a及sema4d蛋白的表达的影响(标尺＝50μm)；

图11为实施例3中不同浓度硅酸对背根神经节细胞形态影响的免疫荧光染色；(a)不同浓度硅酸培养3天的背根神经节细胞的代表性免疫荧光图像，(标尺＝200μm)，(b)神经突起长度的定量分析，(c)神经元存活率的定量分析；

图12为实施例3中实时定量pcr检测10μm硅酸培养基的背根神经节各神经肽mrna的表达；

图13为实施例3中免疫荧光检测10μm硅酸培养基的背根神经节神经肽的表达(标尺＝50μm)；

图14为实施例3中pi3k-akt-mtor信号通路的激活；

图15为实施例4中背根神经节组织中sema3a免疫荧光染色(标尺＝200nm)。

具体实施方式

除非另有说明，本文中的术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。

除非有特殊说明，以下实施例中所用试剂、设备均为市售产品。另外，以下实施例中所涉及统计学分析均为：检测所得数据首先进行正态分布检验和方差齐性检验，两组间的比较采用双尾t检验(ɑ＝0.05)。

本发明所用的正硅酸溶液可采用已有方法配置。本发明的预处理液的组分为氯化胆碱和正硅酸溶液，这两种组分的浓度及预处理液的终ph值可根据实际情况进行优选，目标是得到具有较优物化特性和相应活性的仿生硅化胶原材料。

本发明所述的仿生硅化胶原材料的浸提液是指采用生物体体液模拟液对仿生硅化胶原材料进行浸泡后的浸提液，例如缓冲液或双蒸水均是常见的生物体液模拟液。

实施例1：仿生硅化胶原材料的制备

室温下将silbond40、无水乙醇、去离子水以及37％盐酸(ph调节剂)按照1.875:396.79:12.03:0.0218的摩尔比(质量比为15:182.8:2.167:0.008)混合,得到体积百分比为3％的正硅酸溶液；

将上述体积百分比为3％正硅酸溶液与36mm(cholinechloride,分子量：139.62；sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)等体积均匀混合制备预处理液，并将预处理液的ph值调至5.5，正硅酸浓度调至体积百分比为1.5％；

将三维重组i型胶原海绵(ace胶原，acesurgicalsupplyco.,inc,ma,usa)修剪为直径0.3厘米大小的胶原块，milli-q去离子水冲洗三遍后备用；

分别采用表1所示四种方案对胶原海绵进行仿生硅化：

表1

各方案中将胶原块浸泡于1ml氯化胆碱稳定的硅酸溶液中，37℃条件下孵育7天，每天更换硅酸前体溶液。

1.1仿生硅化胶原支架材料观察

ace胶原置于胆碱稳定的硅酸前体溶液7天后，无水硫酸钙过夜干燥，进行大体观察；其中上述方案三制备的支架材料如图1所示(以下测试及后续实施例用该方案制备的支架材料)；

仿生硅化胶原支架和未经任何处理的ace胶原支架使用去离子水冲洗三遍后，依次以50％、70％、80％、95％乙醇梯度脱水30分钟；100％乙醇脱水3次，每次15分钟；hmds脱水30分钟；通风干燥固定样本过夜；

导电双面碳胶将样品固定于铝质基座上，无水硫酸钙干燥样品过夜；离子喷溅器(humme,technicsinc.,alexandria,va,usa)将样品喷涂金/钯后，扫描电镜(hitachi,tokyo,japan)10-15kv电压下观察胶原支架的超微结构，在胶原纤维矿化表面进行选区元素分析。

扫描电镜下，仿生硅化胶原和未经任何处理的ace胶原的表面形貌如图、2所示：硅化前后的单根胶原轮廓清晰，无塌陷；对比扫描电镜中胶原的形态可以发现，未经处理的胶原支架具有胶原特有的周期性带状图案；仿生硅化胶原支架显示出明显的纤维外矿物沉积迹象；元素分析确定仿生硅化胶原中si元素的含量显著高于对照组。

1.2仿生硅化胶原支架材料的扫描电镜观察

仿生硅化胶原支架使用去离子水冲洗三遍后，依次以50％、70％、80％、95％乙醇梯度脱水30分钟；100％乙醇脱水3次，每次15分钟；100％环氧丙烷浸透3次，每次约30分钟；环氧丙烷与包埋树脂按照1:1体积比浸透2次，每次约30分钟；环氧丙烷与包埋树脂按照1:3体积比浸透12小时；100％包埋树脂浸透12小时；随后将仿生硅化胶原支架置于硅胶模具中，用包埋树脂完全包埋，置于48℃烘箱中4小时，80℃烘箱中24小时，固化形成包埋块；leicaemuc7超薄切片机(leica,wetzlar,germany)切片切出60-90nm厚的透射电镜制件；jem-1230透射电镜(jeol,tokyo,japan)观察样品的超微结构，电压参数为110kv。

未经染色的透射电镜图像显示，硅化后的胶原支架实现了良好的纤维内矿化(图3)；纤维内矿物质沉积展示了胶原纤维的微结构，有序的带状矿化结构模拟了自然骨组织中胶原纤维内部矿化的结构特征。

1.3仿生硅化胶原支架材料的扫描电镜观察

仿生硅化胶原支架和未经任何处理的ace胶原支架使用去离子水冲洗三遍后，置于无水硫酸钙中干燥48小时。通过ftir8400s衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪(shimadzu,tokyo,japan)采集样品的红外光谱，设定光谱波长范围为400-4000cm^-1，扫描次数32次，分辨率为4cm^-1；将所获得的红外光谱图在酰胺a键(～3300cm^-1)处标准化处理以便于比较。

红外光谱图分析显示，硅化处理后的胶原支架同时具有胶原和二氧化硅的特征峰(图4)；未经硅化处理的胶原支架可见胶原纤维的特征峰，包括在3300cm^-1处对应酰胺a的nh伸缩峰；在2900cm^-1处对应酰胺b的ch2非对称伸缩峰；在1650cm^-1处对应酰胺ⅰ的c＝o伸缩峰；在1550cm^-1处对应酰胺ⅱ的nh弯曲峰。硅化处理后胶原支架的光谱根据1650cm^-1处i型胶原酰胺i中c＝o伸缩峰进行标准化转换后，仍可见上述的胶原特征峰。除此之外，硅化作用引入了水合二氧化硅的特征峰，其中460cm^-1、800cm^-1、1070cm^-1处对应si-o-si的to1、to2、to3模式；940-960cm^-1处对应si-oh振动峰。

1.4仿生硅化胶原支架的硅酸缓释测定

上述方案三制备的干燥的仿生硅化胶原支架(100mg)在37℃下浸泡在10mltris盐酸缓冲液(ph＝7.4)中；在指定的时间段：0.125、0.25、0.5、1、2、4和8天回收400μl浸泡溶液以评估硅酸释放；用硅钼酸分光光度法测定吸光度(λ＝700nm)；采用同样方法测定硅酸标准品并绘制标准曲线，利用标准曲线计算溶液中的硅酸释放的浓度，并绘制相应的曲线，硅酸释放的曲线如图5所示，浸泡在tris-hcl中的scs发生硅酸的持续释放，在最初的4天内有一个较快的释放阶段，随后始终维持在一个稳定的释放阶段。

1.5孔隙率测定

以无水乙醇为置换液测定材料的孔隙率。

将已知体积(v)的预称重(wdry)试样在真空中浸入乙醇中1小时使孔隙饱和，然后重新称重(wsat)；孔隙率通过以下公式确定：(wsat–wdry)/(ρv)×100，其中ρ是酒精的密度。

高孔隙率的多孔支架有利于气体和营养物质的交换，进而促进细胞的黏附和增值。支架材料应有足够的孔隙率来满足组织工程的要求。参见图6所示，仿生硅化胶原支架的孔隙率为86.7±1.5％，显著高于未矿化胶原支架(76.8±2.4％)。说明虽然二氧化硅在纤维内外的沉积改善了胶原支架材料的物理性质，使其具有更高的孔隙率。

1.6拉伸强度测定

裁剪尺寸为40×8×2mm³(长×宽×高)的胶原支架，如方案三进行硅化。硅化前后测算试样的平均厚度，拉伸试验之前在pbs中浸泡以模仿体内环境；试样固定在拉伸试验机(shimadzu，kyoto，japan)的两个相对夹点之间，使用1mm/min的速度对试样施加应力至失效，拉伸模量被确定为应力-应变曲线线性区域的斜率。

仿生硅化前后胶原支架的力学强度对比图，材料拉伸强度过低会影响材料在体内的耐久性，参见图7所示，仿生硅化材料的拉伸模量为5.96±0.73mpa，显著高于未矿化胶原支架(2.88±0.51mpa)。

上述研究结果表明，氯化胆碱用于稳定硅化介质，作为纤维内硅化的第一步。仿生硅化胶原支架具有高度矿化的表面形态，可产生微尺度的表面粗糙度以增强细胞附着；仿生硅化胶原支架的高孔隙率可以促进细胞的浸润和增殖，拉伸模量的增加也创造了具有更好的机械稳定性；仿生硅化胶原支架在液体环境中稳定持续地进行硅酸的缓释。

上述实施例证实了仿生硅化胶原支架材料能够稳定而持续地缓释硅酸离子，具有良好的孔隙率和机械强度，发明人进一步探究仿生硅化胶原支架浸提液与硅酸对外周感觉神经细胞(原代分离的背根神经节细胞)的作用。

实施例2：硅化胶原支架浸提液对背根神经节细胞形态和神经肽表达的影响

2.1仿生硅化胶原支架浸提液的制备

按照实施例1中1.4方法，将干燥的仿生硅化胶原支架(100mg)在37℃下浸泡在10mltris盐酸缓冲液(ph＝7.4)中，24小时后取出材料，收集缓冲液；

将上述缓冲液与含20ng/ml神经生长因子(r&dsystems，minneapolis,mn，usa)的neurobasal完全培养基按照1:2比例混合，作为浸提液培养基用于背根神经节细胞的培养(浸提液组)，对照组背根神经节细胞用含20ng/ml神经生长因子neurobasal完全培养基进行培养(对照组)。neurobasal-a完全培养基配置方法为neurobasal-a培养基(gibco,gaithersburg,md,usa)中添加0.5mm/l谷氨酰胺(gibco,gaithersburg,md,usa)、1％青霉素-链霉素(invitrogen,carlsbad,ca,usa)和2％b-27(gibco,gaithersburg,md,usa)。

2.2背根神经节细胞的分离培养

取-5日龄新生spf清洁级sprague-dawley大鼠乳鼠(购自空军军医大学实验动物中心，动物实验符合国家健康机构实验动物应用指导的规范，并经空军军医大学动物管理使用委员会批准，动物实验伦理审查编号：iacuc-20190110)断头，75％的酒精浸泡10分钟消毒，用眼科剪沿着仔鼠后背正中剪开皮肤，暴露出脊柱；

用眼科剪仔细分离软组织，将脊柱完整取出，用显微骨科剪刀沿着脊髓纵向剪开后椎板，取无菌纱布擦去脊髓和多余出血，在体式放大镜下可见脊髓各节段和隐窝内的背根神经节，呈透亮球形，与外周感觉神经纤维相连；用显微镊逐个摘取仔鼠双侧的背根神经节，放于事先预冷的无血清dmem培养基中；用显微镊和显微剪仔细去除与神经节相连的神经纤维及表面被膜，用显微剪尽量将取出的脊神经节剪碎；

dmem培养基(gibco,gaithersburg,md,usa)冲洗3遍后，将背根神经节组织碎块连同dmem培养基移入15ml离心管，每分钟1000转离心3分钟，弃上清，离心管内加入0.1％胶原酶(gibco,gaithersburg,md,usa)和0.25％胰蛋白酶(corning,lowell,ma,usa)消化背根神经节组织碎块，晃匀后放于37°恒温水浴箱中，消化40分钟，期间每10分钟晃动1次；消化完成结束后，加入含10％血清(gibco,gaithersburg,md,usa)的dmem培养基以终止消化，再次以每分钟1000转离心3min，弃上清液；

将分离的细胞重新悬浮在neurobasal完全培养基中，密度为10000个/ml；用0.01％多聚赖氨酸(gibco,gaithersburg,md,usa)提前将24孔板(corning,lowell,ma,usa)、细胞爬片(corning,lowell,ma,usa)或transwell小室(corning,lowell,ma,usa)包被过夜，使用前pbs缓冲液(corning,lowell,ma,usa)冲洗3遍，每次5分钟，将背根神经节细胞均匀接种后，移入37℃、5％co2的细胞培养箱(thermofisherscientific,usa)中，4h后，用含20ng/ml神经生长因子的neurobasal完全培养基(对照组)或按照1:2比例配置的浸提液培养基(浸提液组)；之后每2-3日换一次液，每天在倒置相差显微镜下观察细胞状态。

2.3免疫荧光染色实验

为探讨仿生硅化胶原支架浸提液背根神经节细胞的影响，将分离的背根神经节细胞接种于24孔板的细胞爬片上，浸提液组用上述实验获得的浸提液培养基培养3天，对照组用含20ng/ml神经生长因子的neurobasal完全培养基培养3天。移除培养皿中的培养基，用pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟，4％多聚甲醛(macklin，shanghai，china)固定细胞30分钟后吸除，用pbs缓冲液冲洗3次，每次5分钟；

接着用0.1％triton-100(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)溶液对标本打孔处理15分钟，用pbs缓冲液洗去打孔液，每次5分钟，冲洗3次，吸干切片上多余的液体后，用含5％血清的封闭液封闭标本1小时，封闭完成后吸干多余的液体后，将切片在4℃下与一抗：神经特异的抗β-iiitubulin抗体(ab78078,abcam,cambridge,ma,usa)和抗neun抗体(ab177487,abcam,cambridge,ma,usa)进行免疫荧光孵育过夜；

第二天，取出切片，用pbs缓冲液洗去一抗，每次10分钟，冲洗3次，用相对应种属的荧光二抗(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa,usa)进行室温下孵育1小时；

孵育结束后，避光条件下用pbs缓冲液洗去荧光二抗，每次10分钟，冲洗3次，用含有dapi的长效抗淬灭剂(invitrogen,sandiego,ca,usa)、对细胞核进行复染，并用盖玻片封片，少量指甲油固定盖玻片边缘，防止盖玻片滑动；

最后在激光共聚焦显微镜(bx-60,olympus,japan)下观察染色结果并采集图像，imagej软件分析荧光强度。

如图8所示，背根神经节细胞分别在对照及含硅化胶原支架浸提液的培养基中培养3天后，与对照组相比，硅化胶原支架浸提液对神经元存活无明显的抑制作用(p>0.05)，但可明显促进神经元轴突长度的增加(p<0.01)。2.4实时定量聚合酶链反应(qrt-pcr)检测

实时定量聚合酶链反应检测仿生硅化胶原支架浸提液对背根神经节细胞神经肽基因表达的影响，以已发表的cdna序列为基础，设计了引物(宝生物工程，大连，中国)，如表2所示。

表2实时定量pcr引物序列

用上述实验获得的硅化胶原支架浸提液培养基培养背根神经节细胞3天后，分别进行以下操作：

总rna提取:按trizol(beyotime,shanghai,china)说明书进行操作，加入trizol于培养板中，反复吹打直至细胞脱落，用无酶枪头吸至1.5ml无酶ep管中，分别加入trizol体积1/5的三氯甲烷，剧烈震荡约30秒至混合液体呈现粉色后，4℃静置约5分钟，待液体分层，将ep管置于4℃，12000rpm离心15分钟，可见混合液分三层，小心收集上层无色水相到新的无酶ep管中；随后加入等体积的异丙醇，室温下混匀，静置10分钟，再次将ep管置于高速离心机中，4℃，12000rpm分离15分钟，可见管底白色凝胶样rna沉淀，小心倒出上清，加1mldepc水(beyotime,shanghai,china)配置的75％乙醇，4℃，12000rpm离心5分钟洗涤rna沉淀。弃上清，室温下干燥5-10分钟(不宜过度干燥)，用10μldepc水重新溶解rna，测定浓度。

rna质量检测：酶标仪测定上述10μl溶液a260/a280的比值即为rna纯度；加depc水调节rna浓度，使rna总量满足试剂说明书中要求(1000ng)，样品a260/a280的比值应该调节在300～500之间。

去基因组dna：按takara公司(takara，shiga，japan)试剂盒说明书进行，反应全程在冰上进行；将试剂或样本按按下列顺序及用量加入无酶ep管中，得到10μl体系，混匀后离心；将无酶ep管置入反转录仪(berkeley,california,usa)，参数设置：温度42℃，时间：2分钟；温度：4℃，时间：保持，反应体系如表3所示。

表3去基因组dna体系

cdna合成:按takara公司试剂盒说明书进行，反应全程在冰上进行。将试剂或样本按按下列顺序及用量加入无酶ep管中，得到20μl体系，混匀后离心；将无酶ep管置入反转录仪进行逆转录，参数设置：温度：37℃，时间：15分钟，温度：85℃，时间：5分钟；温度：4℃，时间：保持；逆转录体系如表4所示。

表4rna逆转录体系

实时定量pcr检测：按takara公司试剂盒说明书进行，反应全程在冰上进行；设计好分组布局及重复样本孔量后，将试剂或样本按按下列顺序及用量加入无酶ep管中，得到25μl体系，混匀后离心；在荧光定量仪器(berkeley,california,usa)上进行pcr扩增，参数设置：温度：95℃，时间：10分钟；温度：95℃，时间2秒；温度：60℃，时间20秒；温度：70℃，时间：10秒(40个循环)，pcr体系如表5所示。

表5实时定量pcr体系

以甘油醛3-磷酸脱氢酶(gadph)为管家基因，使用2^-δδct方法计算校正gadph表达水平后获得的结果，并表示为相对于对照的倍数增加；

如图9所示，与对照组相比，硅化胶原支架浸提液可显著促进背根神经节细胞中sema3a和sema4d基因的表达，然而，其对cgrp、sp、sema3e和sema7d的表达与对照组相比无显著差异。

2.5sema3a及sema4d的免疫荧光染色

方法同2.2，所选一抗为抗sema3a抗体(sc-74555,santacruzbiotechnology,inc.,dallas,tx,usa)及抗sema4d抗体(sc-136250,santacruzbiotechnology,inc.,dallas,tx,usa)。

如图10所示，激光共聚焦显微镜下，硅化胶原支架浸提液刺激组，神经元轴突sema3a及sema4d的表达强度较对照组显著增加，显示出明显的轴突形态；neun作为神经元细胞核特异抗体标记外周感觉神元，免疫荧光染色检测硅化胶原支架浸提液在体外促进感觉神经轴突生长，sema3a及sema4d的表达。

实施例3：硅酸对背根神经节细胞形态和神经肽表达的影响

3.1背根神经节细胞的分离培养

同实施例2。

3.2免疫荧光染色实验

为探讨硅酸刺激对背根神经节细胞的影响，在完全培养基中稀释适量的原硅酸钠来制备新鲜的含硅培养基，最终硅浓度在5μm到40μm之间；将分离的背根神经节细胞接种于24孔板的细胞爬片上，不同浓度的含硅培养基培养3天后，进行免疫荧光染色实验；具体方法同实施例2；

3.3硅酸对背根神经节细胞形态影响的测定

背根神经节细胞分别在5、10、20、40μm硅酸培养基中培养3天后，与对照组相比，在40μm硅酸明培养基中细胞数量显著降低，但随着硅酸浓度的降低，硅酸对神经元存活无明显的抑制作用，与对照组相比，5、10、20μm硅酸培养基对神经突起生长没有明显的抑制作用，其中浓度为10μm时，神经元轴突长度明显增高(图11)，背根神经节细胞的原代培养是一种神经元细胞体外培养的良好模型，合适浓度的硅酸条件培养基不会影响神经元存活的同时，可以促进神经元细胞轴突的生长。

3.4硅酸对背根神经节细胞基因表达影响的测定

10μm硅酸培养的背根神经节细胞3天后，与对照组相比，在背根神经节细胞中sema3a和sema4d的表达显著增加；相反，cgrp、sp、sema3e和sema7d的表达与空白对照无显著差异(图12)，感觉神经分泌的cgrp和sp可以同时作用于成骨细胞和破骨细胞，进而调控骨代谢，然而在硅酸条件培养基中，cgrp和sp的表达都没有明显变化，证明在仿生硅化材料调节感觉神经促进的骨再生过程中，cgrp和sp可能不是发挥调节作用的关键因素。3.5硅酸对背根神经节细胞sema3a和sema4d蛋白表达的影响

激光共聚焦显微镜下，如图13所示，10μm硅酸培养基中，神经元轴突sema3a及sema4d表达强度增加，显示出明显的轴突形态。neun作为神经元细胞核特异抗体标记外周感觉神元；sema4d主要以膜蛋白的形式存在神经元胞体上，只有少量以分泌形式存在；sema3a主要以分泌蛋白的形式存在；免疫荧光染色检测硅酸在体外促进drg轴突生长和sema3a及sema4d表达。

3.6信号通路westernblot检测

通过westernblot法检测对照组和硅酸刺激组背根神经节细胞中蛋白表达情况，具体步骤如下：

提取总蛋白：每孔细胞加入含pmsf和ripa(磷酸酶抑制剂)的200μl裂解液，冰上裂解30分钟后转移到预冷过的离心管中。

蛋白浓度测定：按说明书使用bca法蛋白定量试剂盒，配置相应的蛋白标准液梯度和工作液。将混合好样品的96孔板锡纸遮盖，在37℃中孵育30min；酶标仪测各组样本吸光度，设定波长为562nm，按照标准品的浓度和吸光度值绘制标准蛋白曲线，按照标准曲线和样品的吸光度值计算样品的蛋白浓度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：使用碧云天公司的试剂盒，配制sds-page聚丙烯酰胺凝胶。根据各样品蛋白体积，加入5×loadingbuffer配成蛋白浓度为3μg/μl的蛋白混液，体积不足用pbs配齐，电泳时浓缩胶电压为80v，时间约20min，分离胶电压为120v，时间约为90min，待溴酚蓝跑至玻璃板底部，且marker条带分开的距离足够时，停止电泳。戴干净pe手套剪取pvdf膜，放入甲醇中激活5分钟，再放入转膜液中。

电泳结束后，按marker指示切下整板区域的凝胶，浸入转膜液中，随后按海绵—滤纸—胶—pvdf膜—滤纸—海绵的顺序放入转膜模板中，夹稳固后放入电转槽，冰浴恒流200ma90分钟，转膜束后，将膜取出放入提前配制封闭液(5％胎牛血清)中，室温封闭1小时，吸弃封闭液，将膜加入用tbst稀释的一抗，放入4℃冰箱中过夜孵育，tbst洗膜3次(10分钟/次)，将膜加入稀释的二抗((santacruzbiotechnology,inc.,dallas,tx,usa))，室温孵育60min，tbst洗膜5次(5分钟/次)，使用新鲜配置的化学发光液(genetex,irvine,ca,usa)发光后，将膜置于化学发光检测仪中(chemidoc^tm成像系统)检测，拍照获取图像，。使用imagej软件分析数据对染色带进行扫描和定量。蛋白表达水平与β-肌动蛋白标准化后，绘制图表。

westernblot检测中所使用的一抗包括：active-β-catenin(milliporecorp.,billerica,ma,usa)，β-catenin(cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，p38mapk((cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，phospho-p38mapk(cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，phosphoinositide3-kinase(pi3k)(cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，phospho-akt(cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，aktantibody(genetex,irvine,ca,usa)，mtorantibody(genetex,irvine,ca,usa)，phospho-mtor(cellsignalingtechnology,inc.danvers,ma,usa)，β-actin(genetex,irvine,ca,usa)

wnt/β-catenin和mapk/p38通路在两组均无明显改变。磷酸化pi3k、akt和雷帕霉素(mtor)的表达显著升高，而pi3k、akt和mtor的总蛋白含量没有显著改变；如图14所示，pi3k/akt/mtor信号通路在仿生硅化胶原刺激感觉神经生长及sema3a分泌过程中被激活。

实施例4：仿生硅化材料植入小鼠股骨髁缺损区对其背根神经节感觉神经肽表达的影响

4.1大鼠股骨远端缺损模型的建立

建立股骨远端缺损模型验证scs植入促进背根神经节细胞sema3a表达的能力。

雄性2月龄sprague-dawley大鼠，购自空军军医大学动物实验中心，常规饮食，spf级环境饲养。配置1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(用量：20mg/kg)，仰卧位固定于手术台，右后肢膝盖周围剃毛，75％乙醇消毒后铺巾。在大鼠的右侧股骨远端骨骺表面做1.5cm左右的线性切口，逐层切开皮肤、皮下组织、肌膜，然后钝性剥离股骨髁部的肌肉，暴露股骨髁。在生理盐水持续冲洗下，使用环钻在垂直于股骨远端的位置形成直径3mm、深4mm的孔洞，生理盐水不断冲洗，去除残留的骨碎片，仿生硅化胶原支架组大鼠植入材料，可吸收缝线逐层缝合切口，苏醒后常规饲养，不限制动物活动，每日观察健康状态。空白组缺损部位不植入填充物。

4.2心脏灌注固定和取材

大鼠股骨远端缺损模型的建立六周后，sd大鼠称重，配置1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(用量：20mg/kg)；

仰卧位固定大鼠,用左手持镊子轻轻夹起胸骨剑突上部的皮肤,右手持剪刀自胸骨剑突剪一开口向上的“v”型切口，沿“v”型切口向左上和右上方分别扩大切口,将皮肤、皮下组织和腹部肌肉剪开至肋弓下缘；

用止血钳钳夹住胸骨柄末端的皮肤及肌肉组织,轻轻向上拉起既，可暴露出隔肌，用眼科剪刀小心沿隔肌斜上剪至第二肋骨处，可暴露出心脏和大血管，左手用镊子小心将心包打开,轻轻钳夹住心脏下端,右手持灌注针从心尖斜向左上方插入左心室内，并送至主动脉。此时右手换直镊钳牢牢夹住心尖部心肌及灌注针,防止灌注针脱出；

用输液器快速推注生理盐水,同时剪开右心耳,使血液排出。随着生理盐水的灌注，观察到肝脏逐渐变白、内脏膨出、右心耳流出的液体清亮，此时,将灌注液换为4％多聚甲醛固定液,观察到大鼠出现四肢肌肉抽动,随后全身器官组织僵硬后即可取材；

截取股骨髁及上端相连的部分股骨作为标本，浸泡在4％多聚甲醛中4℃保存；

背根神经节位于椎间孔内侧缘紧贴椎管壁上,小心将l3-l5背根神经节取出后放入-70℃冰箱内保存,以备冰冻切片用。

4.3冰冻组织切片与免疫荧光实验

oct包埋的背根神经节组织使用冰冻切片机切片按15μm厚度进行切片。室温下晾干20分钟确定切下的片子牢固、平展的黏贴在载玻片上；

切片浸入pbs缓冲液复水10分钟后，用0.1％triton-100溶液对标本打孔处理15分钟；

用pbs缓冲液洗去打孔液，每次5分钟，冲洗3次。吸干切片上多余的液体后，用含5％血清的封闭液封闭标本1小时；

封闭完成后吸干多余的液体后，将切片在4℃下与一抗孵育过夜。第二天，取出切片，用pbs缓冲液洗去一抗，每次10分钟，冲洗3次。用相对应种属的荧光二抗进行室温下孵育1小时；

孵育结束后，避光条件下用pbs缓冲液洗去荧光二抗，每次10分钟，冲洗3次；

用含有dapi的长效抗淬灭剂、对细胞核进行复染，并用盖玻片封片；少量指甲油固定盖玻片边缘，防止盖玻片滑动。最后在共聚焦显微镜下观察染色结果并采集图像，imagej软件分析荧光强度。

结果显示：仿生硅化胶原支架植入组背根神经节感觉神经元sema3a蛋白表达较空白对照组显著增高(图15)，这与体外实验一致。