一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。

背景技术：

萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase)是一种在三磷酸腺苷(atp)、二价金属离子如镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫萤光素并使其产生生物发光的酶。在过量的萤火虫萤光素酶和萤光素存在的情况下，萤光的产生和反应中存在的atp的量成正比，这种发光特性使得萤火虫萤光素酶在各种测定atp的研究、生产等过程中广泛应用。

为了提高萤火虫萤光素酶在atp检测中的实用性，已有的研究在野生型萤火虫萤光素酶上制作了各种突变体，以提高萤火虫萤光素酶的性能(cn105200022a、cn105368852b、cn100516223c)和发光强度(cn102191213a)等，也利用基因工程等技术在萤火虫萤光素酶的制备方法上做了大量的研究(cn101993858a)，萤火虫萤光素酶的稳定性、活性和产量等都有了一定程度的改进。

然而，随着技术的进步，本领域中对于细胞活力检测等提出了更高的要求。为了更好地应用这项技术，亟待对萤火虫萤光素酶的活性、稳定性等进行进一步地提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种萤火虫萤光素酶突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于seqidno:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位，第394位或第34位；(b)将(a)酶的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如8个，5个，3个，2个，1个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)酶的功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于seqidno:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)酶的氨基酸序列有85％以上同源性(较佳地88％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)且具有(a)酶功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于seqidno:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；或(d)在(a)酶的氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个优选例中，所述“具有(a)酶的功能/活性”包括，与(a)酶的活性相比，具有其至少85％以上、90％以上、95％以上的活性。

在另一优选例中，第357位由lys突变为glu(k357e)；第394位由pro突变为ala(p394a)；第34位由asp突变为val(d34v)；较佳地，所述的萤火虫萤光素酶突变体包括：seqidno:3，seqidno:4或seqidno:2。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸编码所述的萤火虫萤光素酶突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括霉菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种提高萤火虫萤光素酶的活性或信号稳定性的方法，包括对其进行突变改造，对应于seqidno:1所示的萤火虫萤光素酶，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第357位，第394位或第34位。

在本发明的另一方面，提供所述的萤火虫萤光素酶突变体的制备方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的萤火虫萤光素酶突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的萤火虫萤光素酶突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于催化氧化萤火虫萤光素底物、产生atp依赖性生物发光。

在本发明的另一方面，提供一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包括：利用所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行催化氧化、在atp存在的条件下产生生物、发光。

在另一优选例中，所述催化在适于反应的体系中进行，所述适于反应的体系中包括：二价金属离子和氧；较佳地所述二价金属离子包括：镁离子、钙离子、锌离子和/或锰离子；较佳地，所述的适于反应的体系中还包括(但不限于)选自下组的试剂：反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes(2-(n-吗啉基)乙磺酸、4-吗啉乙磺酸一水合物)、季铵盐如ctab、naf、螯合剂如edta、消泡剂如df204、含硫醇化合物如dtt、磷酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。

在另一优选例中，所述的缓冲液包括选自(但不限于)：柠檬酸钠、tris、pipes、磷酸盐缓冲液、hepes、tricine、mops。

在另一优选例中，用于包括(但不限于)下组的反应：体外atp检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，测定包含于溶液体系中的atp的量；细胞活力检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，与细胞培养物混和，测定细胞活力。

在另一优选例中，所述的细胞活力与所述生物发光的发光量成正比。

在另一优选例中，所述的细胞活力检测是针对离体细胞培养物的。

在另一优选例中，所述的细胞活力检测是不以疾病诊断为直接目的的。

在本发明的另一方面，提供一种用于催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的检测体系或检测试剂盒，其中含有：所述的萤火虫萤光素酶突变体，或所述的宿主细胞或其培养物或裂解物。

在另一优选例中，试剂盒中还包括萤火虫萤光素(作为底物)。

在另一优选例中，试剂盒中还包括该检测体系中还包括：二价金属离子和氧；较佳地所述二价金属离子包括：镁离子、钙离子、锌离子和/或锰离子。

在另一优选例中，该检测体系中还包括(但不限于)选自下组的试剂：反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin，mes，季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df20)4、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，还包括：细胞裂解试剂，和/或atp提取试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物(如萤光素)、二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。

在另一优选例中，所述的去垢剂包括阳离子去垢剂或阴离子去垢剂；优选地例如(但不限于)tritonx-100、thesit、chaps、chapso、brij35、tergitol、脱氧胆酸钠。

在本发明的另一方面，提供一种atp测试仪，其中包括：容器，包含于容器中的所述的萤火虫萤光素酶突变体；容器，包含于容器中的萤光素酶底物(如萤光素)；采样(如拭子)、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行atp测定的样品；气体供应装置，所述气体包含氧气；

较佳地，该atp测试仪还包括：容器，以及包含于容器中的：反应缓冲液、化钠、去垢剂、gelatin、mes、季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。

在另一优选例中，所述的atp测试仪中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物(如萤光素)、二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、未突变、d34v、k357e和p394a突变体粗酶的活性检测对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示；纵坐标为发光值(luminescence(relativelightunit,rlu))。

图2、d34v、k357e和p394a突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶的化学发光波谱扫描对比图。

图3、d34v突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela、nih3t3、jurkat细胞的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图4、k357e突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela、nih3t3、jurkat细胞的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图5、p394a突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela、nih3t3、jurkat细胞的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图6、d34v突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图7、k357e突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图8、p394a突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图9、d34v突变体和未突变重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图10、k357e突变体和未突变重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图11、p394a突变体和未突变重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号强度对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图12、d34v突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图13、k357e突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图14、p394a突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定atp标准品的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图15、d34v突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图16、k357e突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

图17、p394a突变体和未突变的重组萤火虫萤光素酶测定hela细胞活力的信号稳定性对比图。数据以平均数±标准偏差形式展示。

具体实施方式

萤火虫萤光素酶具有较长的氨基酸序列，在对其进行分析及突变改造的前期工作中，本发明人考虑了大量的位点，针对各个位点进行独立地或组合地分析及实验，最终确定了k357e、p394a和d34v三个突变位点。本发明的萤火虫萤光素酶突变体具有活性高、稳定性高的特点。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“萤火虫萤光素酶突变体”、“突变型萤火虫萤光素酶”、“萤光素酶突变体”、“突变型萤光素酶”可互换使用，是指对应于突变前的萤火虫萤光素酶，在本发明人确定的一些与酶的活性/稳定性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)，较佳地相应于seqidno:1所示的氨基酸序列，突变选自下组的位点或其组合：第357位，第394位或第34位。

若需要表示突变前的萤火虫萤光素酶(野生型)，其可以为“氨基酸序列如seqidno:1的酶。除非另外说明，本发明中的突变体的突变位点基于该seqidno:1所示的序列。

本发明中，除非另外说明，萤火虫萤光素酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示萤火虫萤光素酶突变体中突变的氨基酸，如k357e，表示位置357的氨基酸由出发萤火虫萤光素酶的k替换成e。

如本文所用，“分离的萤火虫萤光素酶”是指萤火虫萤光素酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化萤火虫萤光素酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“提高活性或信号稳定性”是指与改造前的萤火虫萤光素酶出发多肽相比，发生突变的萤火虫萤光素酶的活性或信号稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，活性或信号稳定性提高的突变型萤火虫萤光素酶在一定时间的反应后，酶活性或信号稳定性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。

如本文所用，“萤火虫萤光素酶突变体或编码其的多核苷酸的文库”是指含有本发明提供的一系列突变型萤火虫萤光素酶的多肽集合体或多核苷酸集合体。多条活性有不同或信号稳定性有不同的萤火虫萤光素酶突变体或编码其的多核苷酸被组装于一个库中，有利于本领域技术人员根据其所需的反应条件，选择合适的萤火虫萤光素酶或其编码核酸。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。

萤火虫萤光素酶突变体、其编码核酸及构建体

本发明的萤火虫萤光素酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述萤火虫萤光素酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然萤火虫萤光素酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的萤火虫萤光素酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于seqidno:1所示的氨基酸序列，选自k357e、p394a和d34v的突变。

在本发明中，术语“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括萤火虫萤光素酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seqidno:1所示的氨基酸序列，选自k357e、p394a和d34v的突变。

在本发明中，术语“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的萤火虫萤光素酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在肯定存在至少一个本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于seqidno:1所示的氨基酸序列，选自k357e、p394a和d34v的突变。

发明还提供所述萤火虫萤光素酶突变体的类似物。这些类似物与所述萤火虫萤光素酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码本发明萤火虫萤光素酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或萤火虫萤光素酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。

通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的萤火虫萤光素酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码萤火虫萤光素酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，萤火虫萤光素酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含萤火虫萤光素酶突变体编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。在本发明的优选方式中，所用的表达载体为pet28a；所述表达载体转化的微生物宿主细胞均为大肠杆菌。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

萤火虫萤光素酶突变体的应用

在适合的反应条件下，萤火虫萤光素酶可催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光；也即，本发明的萤火虫萤光素酶可应用于三磷酸腺苷生物发光法，作为催化剂。三磷酸腺苷生物发光法是一种经过简化的生物化学方法，利用atp与萤光素-萤光素酶复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(atp)，该法可用于体外环境或细胞的atp量的测定。生物发光反应需要atp、萤光素和萤火虫萤光素酶。反应期间萤光素被氧化并发出荧光，光子的数量可采用atp荧光仪进行测量，光子的数量的atp含量成正比。应用于细胞活力测定时，由于每种细胞中的atp含量是恒定的，样品中atp含量与样品中细胞的数量有关。这一方法可在非常快的时间内(例如数秒)进行atp量的测定。利用本发明的萤火虫萤光素酶突变体，可以更为高效、灵敏地实现检测。

在获得了本发明的萤火虫萤光素酶突变体酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥催化氧化萤火虫萤光素、在atp存在的条件下产生生物发光的作用。在优选的方式中，所述催化在适于反应的体系中进行，所述适于反应的体系中包括：二价金属离子(如镁离子)和氧；较佳地，所述的适于反应的体系中还包括(但不限于)选自下组的试剂：反应缓冲液，氯化钠，去垢剂，gelatin，mes，季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。

基于萤火虫萤光素酶的atp生物发光法的应用范围十分广泛，可被应用于食品(如微生物检测)、药品、电子和化妆品等众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。atp生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。atp生物发光法还可用于食品生产环境的清洁度检测；例如，用atp生物发光法检测食品生产线及厨房、冰箱、食品操纵台、铁路站车食品器具等处的清洁度。atp生物发光法还可用于医疗环境中的清洁度检测；例如，对于手术用具、医用耗材的微生物检测。

对于动植物组织样品或细胞样品，也可应用如本发明的方法来进行atp量的检测，以研究生物代谢性能等。例如，在涉及转基因研究的植物学领域中，可对于植物的愈伤组织进行atp含量的测定，以研究其中的细胞能量代谢的特点。

应理解，本发明的具有更高活性及稳定性的萤火虫萤光素酶突变体，适用于多种多样本领域已知或正在发展的atp检测方法中，具有广泛的可应用性。

在本发明的具体实施例中，针对三种萤火虫萤光素酶突变体d34v、k357e和p394a，构建了相应的原核表达质粒，所构建的突变体质粒序列均经过测序确认；然后进行突变体的筛选：将未突变的萤火虫萤光素酶重组基因质粒和3个突变体质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞中，培养、诱导萤火虫萤光素酶的表达，收集菌体获得突变酶粗提液；选择有蛋白表达的酶粗提液，测定atp进行萤火虫萤光素酶活性检测；将活性筛选结果较优的突变体菌株在液体培养基中培养、诱导蛋白表达，收集菌体，并纯化得到萤火虫萤光素酶；利用纯化得到的萤火虫萤光素酶进行生物发光光谱扫描、测定atp和hela、nih3t3、jurkat细胞活力，进行萤火虫萤光素酶的酶活性和信号稳定性的比较测试。本发明方法采用分子理论设计与功能筛选相结合，筛选得到具有更高活性和更好的信号稳定性的萤火虫萤光素酶突变体。d34v、k357e和p394a突变体的生物发光光谱和未突变的重组萤光素酶光谱一致，三个突变体的信号强度和信号稳定性均优于未突变的重组萤火虫萤光素酶，其中d34v突变体的信号强度比未突变的重组萤光素酶信号强度高25％-50％，k357e突变体的信号强度比未突变的重组萤光素酶信号强度高50％-100％，p394a突变体的信号强度比未突变的重组萤光素酶信号强度高40％-70％。未突变的萤火虫萤光素酶在60min信号衰减了20％，信号半衰期在2.5h左右，d34v突变体的发光信号在60min仅衰减了不到10％，k357e和p394a突变体的发光信号在60min基本恒定，三个突变体信号半衰期均可达5h。

萤火虫萤光素酶突变体的组合物/试剂盒

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的萤火虫萤光素酶突变体以及在检测中所需的其它组分。这类组分包括(但并不限于)选自下组的组分：萤火虫萤光素(作为底物)，二价金属离子，反应缓冲液，氯化钠，去垢剂，gelatin，mes，季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中萤火虫萤光素酶突变体的有效量。所述的组合物中还可添加进一步调节本发明的萤火虫萤光素酶突变体酶活性或促进反应进程的其它物质。

本发明还提供了一种检测体系，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶突变体、萤火虫萤光素(作为底物)；较佳地还包括选自下组的组分：二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes、季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。该检测体系中，当加入待测样品后，可以在很短的时间内发生反应，获得测定结果。

为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种检测体系或检测试剂盒，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶突变体、萤火虫萤光素(作为底物；较佳地还包括选自下组的组分：二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes、季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。其中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素、二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。

作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中还可包括：细胞裂解试剂，和/或atp提取试剂。

作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中，还可包括使用说明书，以指导人们以正确的方法应用本发明的试剂盒。

为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种atp测试仪，其中包括：容器，包含于容器中的所述的萤火虫萤光素酶突变体；容器，包含于容器中的萤光素酶底物(如萤光素)；采样(如拭子)、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行atp测定的样品；气体供应装置，所述气体包含氧气。或者，也可以自然状态下存在的空气(氧气)来替代该气体供应装置。

作为本发明的优选方式，所述的atp测试仪中还包括：容器，以及包含于容器中的：二价金属离子(溶液)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes、季铵盐(如ctab)、naf、螯合剂(如edta)、消泡剂(如df204)、含硫醇化合物(如dtt)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除gelatin外的bsa、甘油等蛋白质稳定剂。所述的atp测试仪中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素、二价金属离子、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、gelatin、mes等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。所述的atp测试仪内可设置有一些计算程序，以及设置有输出屏，从而直观地向人们展示测定结果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

i.材料与方法

1、实验材料、试剂与仪器

细胞：大肠杆菌dh5α、bl21(de3)、pet-n-his-c-his质粒、hela细胞、nih3t3细胞、jurkat细胞。

试剂盒：基因定点突变试剂盒，质粒抽提试剂盒。

试剂：atp标准品、atp检测裂解液、限制性内切酶dpni、抗生素等。

仪器：超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；pure蛋白纯化系统及其配套ni亲和层析预装柱和superdex200凝胶过滤层析预装柱(美国ge公司)；clinx凝胶成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司)；多功能酶标仪varioskanlux(thermofisher)。

2、实验方法

2.1突变体构建

非突变的萤火虫萤光素酶重组基因序列见美国专利us7083911b2(其编码的蛋白如seqidno:1)，人工合成其核苷酸序列，克隆至载体pet-n-his-c-his中，获得pet-n-his-luc4-c-his质粒。

萤火虫萤光素酶突变体的构建：以质粒pet-n-his-luc4-c-his为原始模板，以d34、k357和p394作为突变位点，设计特异性引物，将d34突变为v、k357突变为e、p349突变为v。使用quickmutation^tm基因定点突变试剂盒(碧云天，d0206)进行高保真扩增，在50μl反应体系中，加入5μl10xbeyofusion^tmbuffer(withmg2+)，4μl相应的引物(10μm)，10μldntpmix(2.5mmeach)，和200ngpet-n-his-luc4-c-his质粒。扩增条件为95℃30s；20个循环：95℃30s，55℃30s，68℃30s-3min(30s/kb)；68℃继续延伸15min。

pcr反应后，直接在pcr反应体系中加入1μldpni(beyotime，d6257)，混匀后37℃孵育5min。取dpni消化后的各产物10微升，加至100μl的dh5a感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入900μllb培养基，37℃摇菌45min。将菌液均匀涂布在50μg/ml卡那霉素的lb平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。挑单克隆菌落至lb培养液中，培养过夜，用质粒小量抽提试剂盒(beyotime，d0005)提取各菌液中的质粒，测定质粒浓度并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒纯度，送出测序，最终选择测序结果正确的质粒，分别命名为pet-n-his-luc4-d34v-c-his、pet-n-his-luc4-k357e-c-his、pet-n-his-luc4-p394a-c-his。

2.2突变体的筛选

将模板质粒pet-n-his-luc4-c-his和3个突变体质粒转化进入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，并在含有抗生素的lb平板上以37℃条件培养过夜。挑取平板上的单克隆接种到含抗生素的lb液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床中活化培养至od值为0.4～0.6，再加入终浓度为0.2mm的诱导剂iptg在16℃下以200rpm摇动培养16小时，诱导蛋白表达。iptg诱导后的发酵液以8000xg离心5min收集菌体。菌体以2ml裂解液(50mmnah2po4.2h2o；300mmnacl；ph8.0，10％甘油，1mmdtt)充分重悬后，22℃静置15min，涡旋1min后以18,000xg低温离心5min取上清，获得模板质粒和突变体质粒的酶粗提液。对各酶粗提液进行sds-page电泳检测，观察有无目的蛋白的表达。

选择有蛋白表达的酶粗提液，进行萤火虫萤光素酶活性检测。用atp检测裂解液稀释的浓度为0.01μm和1μm的atp标准品100微升作为样品，用100微升atp检测裂解液作为空白对照，加入萤光素酶底物和萤火虫萤光素酶粗提液等物质配制的atp检测试剂100微升，混匀后用多功能酶标仪化学发光进行检测，atp标准品孔的rlu值明显高于空白对照孔的rlu值则认为酶粗提液具有萤火虫萤光素酶活性，atp标准品孔的rlu值明显高于模板的rlu则认为突变体的萤火虫萤光素酶活力较模板有明显的提高。

2.3优选萤火虫萤光素突变体的表达与纯化

将表达活力较好的萤火虫萤光素酶突变体的bl21(de3)菌种(含pet-n-his-luc4-d34v-c-his、pet-n-his-luc4-k357e-c-his和pet-n-his-luc4-p394a-c-his质粒)和含未突变质粒的菌株(含pet-n-his-luc4-c-his质粒)在含有抗生素的lb液体培养基中分别进行诱导培养，具体条件见步骤2.2中所述。取发酵后的菌体用裂解液(50mmnah2po4·2h2o；300mmnacl；ph8.0，10％甘油，1mmdtt)于超声波细胞粉碎机超声粉碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到纯化的萤火虫萤光素酶。纯化后的酶使用储存缓冲液(10mmtris–hcl，ph7.5，100mmnacl，0.1mmedta，1mmdtt，50％甘油)于-20℃保存。用bradford蛋白浓度测定试剂盒(beyotime，p0006)，通过在595nm处的吸光度确定浓度。

2.4萤火虫萤光素酶突变体与萤光素底物产生的生物发光的光谱扫描

将含有萤火虫萤光素酶突变体、atp和萤光素酶底物的柠檬酸缓冲液加入96孔板，在450-700nm波长范围内进行生物发光光谱扫描。

2.5萤火虫萤光素酶突变体用于不同细胞的活力检测

将hela、nih3t3和jurkat细胞按照5万个/孔的密度种96孔板，37℃、5％co2培养箱中培养2.5h，取出培养板室温平衡10min，加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等配制的检测工作液100微升，混匀、室温震荡2min，室温孵育10分钟后进行化学发光检测。

2.6萤火虫萤光素酶突变体用于atp标准品的检测

希望通过对于atp标准品的检测来测定该纯化的萤火虫萤光素酶突变体的使用效果。

将atp标准品用pbs分别稀释成浓度为0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nm的atp标准溶液，100μl每孔加入96孔板作为标准品孔，各孔加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等物质配制的检测工作液100微升，混匀后进行化学发光检测。

2.7萤火虫萤光素酶突变体用于hela细胞活性曲线的检测

借助于atp依赖的萤光素酶催化的萤光素发光反应，通过细胞内atp水平来反应代谢活力。希望通过对于细胞的活力检测来进一步测定该纯化的萤火虫萤光素酶突变的使用效果。

hela细胞的活性曲线检测。将hela细胞按照0、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000万个/孔的密度种96孔板，37℃、5％co2培养箱中培养2.5h，取出培养板室温平衡10min，加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等物质配制的检测工作液100微升，混匀、室温震荡2min，室温孵育10分钟后进行化学发光检测。

2.8萤火虫萤光素酶突变体测定

atp标准品产生的发光信号稳定性检测：用atp检测裂解液将atp标准品稀释成1μm的溶液，100微升加入96孔板，加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等物质配制的检测工作液100微升，混匀、室温震荡2min，室温孵育10分钟后进行化学发光检测，每10min测定一次。

2.9萤火虫萤光素酶突变体测定hela细胞活力产生的发光信号稳定性检测

将hela细胞按照2.5万个/孔的密度种96孔板，37℃、5％co2培养箱中培养2.5h，取出培养板室温平衡10min，加入萤光素酶底物和纯化得到的萤火虫萤光素酶等物质配制的检测工作液100微升，混匀、室温震荡2min，室温孵育10分钟后进行化学发光检测,每10min测定一次。

ii.实施例

实施例1、突变体构建

萤火虫萤光素酶具有较长的氨基酸序列，在对其进行分析及突变改造的前期工作中，本发明人考虑了大量的位点，针对各个位点进行独立地或组合地分析及实验，最终确定了d34v、k357e和p394a三个突变位点。

本发明中，所基于的未突变的萤火虫萤光素酶146-1h2氨基酸序列如下(seqidno:1)：

madknilygpepfypledgtageqmfdalsryaaipgcialtnahtkenvlyeeflklscrlaesfkkyglkqndtiavcsenslqfflpviaslylgiivapvndkyierelihslgivkprivfcskntfqkvlnvksklksietiiildlnedlggyqclnnfisqnsdsnldvkkfkpysfnrddqvasimfssgttglpkgvmlthknivarfsiakdptfgnainptsailtvipfhhgfgmmttlgyftcgfrvvlmhtfeeklflqslqdykvestllvptlmaflaksalvekydlshlkeiasggaplskeigemvkkrfklnfvrqgygltettsavlitpkgdakpgstgkivplhavkvvdpttgkilgpnepgelyfkgpmimkgyynneeatkaiidndgwlrsgdiayydndghfyivdrlkslikykgyqvapaeiegillqhpyivdagvtgipdeaagelpaagvvvqtgkylneqivqdyvasqvstakwlrggvkfldeipkgstgkidrkvlrqmlekhtng

146-1h2d34v突变体的氨基酸序列如下(seqidno:2)：

madknilygpepfypledgtageqmfvalsryaaipgcialtnahtkenvlyeeflklscrlaesfkkyglkqndtiavcsenslqfflpviaslylgiivapvndkyierelihslgivkprivfcskntfqkvlnvksklksietiiildlnedlggyqclnnfisqnsdsnldvkkfkpysfnrddqvasimfssgttglpkgvmlthknivarfsiakdptfgnainptsailtvipfhhgfgmmttlgyftcgfrvvlmhtfeeklflqslqdykvestllvptlmaflaksalvekydlshlkeiasggaplskeigemvkkrfklnfvrqgygltettsavlitpkgdakpgstgkivplhavkvvdpttgkilgpnepgelyfkgpmimkgyynneeatkaiidndgwlrsgdiayydndghfyivdrlkslikykgyqvapaeiegillqhpyivdagvtgipdeaagelpaagvvvqtgkylneqivqdyvasqvstakwlrggvkfldeipkgstgkidrkvlrqmlekhtng

146-1h2k357e突变体的氨基酸序列如下(seqidno:3)：

madknilygpepfypledgtageqmfdalsryaaipgcialtnahtkenvlyeeflklscrlaesfkkyglkqndtiavcsenslqfflpviaslylgiivapvndkyierelihslgivkprivfcskntfqkvlnvksklksietiiildlnedlggyqclnnfisqnsdsnldvkkfkpysfnrddqvasimfssgttglpkgvmlthknivarfsiakdptfgnainptsailtvipfhhgfgmmttlgyftcgfrvvlmhtfeeklflqslqdykvestllvptlmaflaksalvekydlshlkeiasggaplskeigemvkkrfklnfvrqgygltettsavlitpkgdaepgstgkivplhavkvvdpttgkilgpnepgelyfkgpmimkgyynneeatkaiidndgwlrsgdiayydndghfyivdrlkslikykgyqvapaeiegillqhpyivdagvtgipdeaagelpaagvvvqtgkylneqivqdyvasqvstakwlrggvkfldeipkgstgkidrkvlrqmlekhtng

146-1h2p394a突变体的氨基酸序列如下(seqidno:4)：madknilygpepfypledgtageqmfdalsryaaipgcialtnahtkenvlyeeflklscrlaesfkkyglkqndtiavcsenslqfflpviaslylgiivapvndkyierelihslgivkprivfcskntfqkvlnvksklksietiiildlnedlggyqclnnfisqnsdsnldvkkfkpysfnrddqvasimfssgttglpkgvmlthknivarfsiakdptfgnainptsailtvipfhhgfgmmttlgyftcgfrvvlmhtfeeklflqslqdykvestllvptlmaflaksalvekydlshlkeiasggaplskeigemvkkrfklnfvrqgygltettsavlitpkgdakpgstgkivplhavkvvdpttgkilgpnepgelyfkgamimkgyynneeatkaiidndgwlrsgdiayydndghfyivdrlkslikykgyqvapaeiegillqhpyivdagvtgipdeaagelpaagvvvqtgkylneqivqdyvasqvstakwlrggvkfldeipkgstgkidrkvlrqmlekhtng

本发明人将所述萤火虫萤光素酶突变体构建于原核表达质粒中，获得pet-n-his-luc4-d34v-c-his、pet-n-his-luc4-k357e-c-his和pet-n-his-luc4-p394a-c-his质粒，以所述质粒为模板，进行pcr扩增。将所得pcr产物经dpni酶切后进行转化，各个点突变挑取单克隆3个，lb培养过夜后用质粒小量抽提试剂盒(beyotime，d0005)提取各菌液中的质粒，测定质粒浓度并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒纯度。

电泳结果显示，挑取的各克隆均为阳性，测序结果表明所构建的d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体质粒序列均正确。

实施例2、突变体粗酶的活性检测

根据sds-page电泳结果，选择有蛋白表达的突变酶粗提液，配制成atp检测试剂(配方为：500μg/ml粗酶(蛋白量)，25mmtris，ph7.0，50mmnacl，0.1％gelatin，2.5mmmgso4，100μmd-luciferin)，测定0.01和1μm的atp标准品。

结果如图1，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体均有较高的活力，0.01μmatp的rlu值即可以达到空白对照的50倍以上，和未突变的萤火虫萤光素酶信号相比，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体的信号强度分别高于未突变萤火虫萤光素酶约35％、85％和60％，具有及其显著的差异。

实施例3、萤火虫萤光素酶突变体与萤光素底物(d-luciferin)产生的生物发光的光谱扫描

根据bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫萤光素酶配制柠檬酸缓冲液(配方为：5μg/ml萤火虫萤光素酶，50mm柠檬酸钠，ph6.0，5mmmgso4，0.2mmatp，1mmd-luciferin)，取100微升加入96孔板，在450-700nm波长范围内进行生物发光的光谱扫描。

结果显示，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体和未突变的重组萤光素酶的生物发光光谱一致，最佳发射波长均在550-560nm，但是d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体配制的柠檬酸缓冲液的信号强度要分别高于未突变的重组萤光素酶配制的柠檬酸缓冲液信号强度约30％、80％和50％(图2)。

实施例4、萤火虫萤光素酶突变体对不同细胞的活力检测

根据bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫萤光素酶配制细胞活力检测试剂(配方为：30μg/ml萤火虫萤光素酶，50mmmes，ph6.5，500mmnacl，0.5％gelatin，1％tritonx-100，15mmmgso4，2mmd-luciferin)测定5万个hela、nih3t3、jurkat细胞的活力。

结果显示，对于hela、nih3t3、jurkat细胞的活力检测，d34v萤火虫萤光素酶突变体的信号强度分别高于对应未突变的萤火虫萤光素酶信号约50％、35％和25％(图3)。

k357e萤火虫萤光素酶突变体的信号强度分别高于对应未突变的萤火虫萤光素酶信号约100％、85％和60％(图4)。

p394a萤火虫萤光素酶突变体的信号强度对应高于未突变的萤火虫萤光素酶信号约70％、55％和40％(图5)。

实施例5、萤火虫萤光素酶用于atp标准品和hela细胞活力的检测

根据bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫萤光素酶配制细胞活力检测试剂(配方为：10μg/ml萤火虫萤光素酶，50mmhepes，ph7.5，150mmnacl，0.2％gelatin，0.2％tritonx-100，10mmmgso4，200μmd-luciferin)测定atp标准品和hela细胞的活力。

结果显示，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体都较未突变的萤火虫萤光素酶具有更高的检测灵敏度和活力。对于atp标准品和hela细胞的检测，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体的rlu值分别高于未突变萤火虫萤光素酶信号45％、100％和65％，atp标准品在1nm-10μm浓度范围内线性良好，hela细胞在10-10万个细胞范围内有良好的线性关系，当细胞数目为10个时，三个萤火虫萤光素酶突变体的信号与空白对照的信号差值即可达1000rlu(图6-图11)。

实施例6、针对atp标准品和hela细胞活力产生的信号稳定性检测

根据bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度结果，用纯化得到的萤火虫萤光素酶配制细胞活力检测试剂(配方为：20μg/ml萤火虫萤光素酶，200mm磷酸二氢钾，ph6.8，200mmnacl，0.2％gelatin，0.5％tritonx-100，20mmmgso4，0.5mmd-luciferin)测定1μmatp标准品和2.5万个hela细胞的发光信号稳定性。

结果显示，对atp标准品和hela细胞的检测，d34v、k357e和p394a萤火虫萤光素酶突变体的信号稳定性均明显优于未突变的重组萤火虫萤光素酶。d34v萤火虫萤光素酶突变体的发光信号在60min内的变动不到10％，k357e和394a萤火虫萤光素酶突变体的发光信号在60min内基本恒定，三个突变体的信号半衰期均约5h，而未突变的萤火虫萤光素酶的信号60min内下降了约20％，信号半衰期约2.5h(图12-图17)。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海碧云天生物技术有限公司

<120>一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用

<130>211212

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>544

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(544)

<223>萤火虫萤光素酶146-1h2

<400>1

metalaasplysasnileleutyrglyprogluprophetyrproleu

151015

gluaspglythralaglygluglnmetpheaspalaleuserargtyr

202530

alaalaileproglycysilealaleuthrasnalahisthrlysglu

354045

asnvalleutyrgluglupheleulysleusercysargleualaglu

505560

serphelyslystyrglyleulysglnasnaspthrilealavalcys

65707580

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<211>544

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>variant

<222>(34)..(34)

<400>2

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>variant

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225230235240

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245250255

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