一种基于细菌群落鉴定水中尸体死因的方法与流程

本发明属于法医学鉴定技术领域。更具体地，涉及一种基于细菌群落鉴定水中尸体死因的方法。

背景技术：

法医学鉴定实践中，常涉及水中尸体的死因鉴定。受我国水域数量多、水域环境复杂以及尸体腐败等因素的影响，水中尸体的死因鉴定一直是法医学鉴定中的难点问题。尽管硅藻检验作为鉴定水中尸体死因的重要辅助手段，已得到普遍认可，但检材易受尸检、取材和检验过程污染，且单从水中尸体的肺部检出硅藻不足以鉴定溺死，多器官未检出硅藻亦不能排除溺死，故硅藻检验的作用受到一定限制。目前，国内外专家学者提出了其他辅助鉴定水中尸体死因的方法，如叶绿素(a)、组织化学、血液生物化学等检验技术，但这些方法均存在一定的局限性。因此，提供一种具有高灵敏度、高检出率，并能够广泛应用于水中尸体死因鉴定的检测方法，对当前法医学鉴定实践有重要意义。

与传统的硅藻形态学检验方法相比，通过分析微生物对水中尸体的死因进行鉴定主要有以下优点：①可用于推断死因是否真正为溺死；②检测范围广，除可应用于藻类分类及鉴定外，还可用于小微型浮游生物及不能用显微镜进行形态辨别的浮游生物检验；③灵敏度高，所需样本量明显小于传统硅藻检验法。利用水体细菌的保守序列从dna中分离出各种类的变异序列，可以在定性的同时揭示群落特征，如进一步建立不同水域和同一水域不同时间浮游生物群落特征变化监控系统。该诊断方法与传统硅藻检验法相结合，对溺死鉴定有重要的实用价值。

中国专利cn106119384a公开了一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及其在法医检测中的应用。其通过在水中尸体脏器中提取嗜水气单胞菌核酸并进行pcr扩增后，与水样中的嗜水气单胞菌核酸进行对比，分析并判断水中尸体是否为溺亡。但该方法可能受样本影响，而检测不出嗜水气单胞菌核酸，进而无法对水中尸体死因进行鉴定，因此具有一定的局限性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有水中尸体死因鉴定技术及方法的缺陷和不足，提供一种基于细菌群落鉴定水中尸体死因的方法。

本发明的目的是提供一种基于细菌群落鉴定水中尸体死因的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

溺亡尸体与非溺亡尸体的特征在于，溺亡者从溺水开始至死亡的过程中，会对溺水地点的水体进行吸入、吞入等，因此，水中溺亡尸体样本的微生物群落结构会与溺亡地点的水体微生物群落结构趋同，并可在尸体样本中检出溺亡水体中的特异性微生物，而非水中溺亡的尸体样本中的微生物不会出现这种特征。

本发明通过对水中尸体组织和水体样本中的细菌进行测序，分析比对二者中细菌群落以及特异性细菌，以此推断水中尸体是否为溺亡，该方法包括以下步骤：

s1.对尸体发现点的水体和尸体组织进行取样；

s2.对步骤s1所取水体样本中的细菌进行富集，分别提取水体样本中细菌和尸体组织的总dna；

s3.根据细菌保守区序列设计引物并连接测序接头，以提取的总dna为模板，分别进行pcr扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，对质检合格的文库进行测序；

s4.对测序结果进行分析，通过比对水样与水中尸体组织中的细菌群落是否趋同，以及是否含有共同的特异性细菌来鉴定水中尸体是否为溺亡。

优选地，步骤s1中水体取样量为1～2l。

优选地，步骤s1中所取尸体组织为水中尸体的肺部组织块。

更优选地，取出的肺部组织块迅速放入预冷的冻存管内并置于液氮中速冻1h，随后转入-80℃冰箱保存。

优选地，步骤s2中通过抽滤装置对水体样本细菌进行富集，至滤膜表面有可见覆盖物，转入-80℃冰箱保存。

更优选地，抽滤所用滤膜孔径为0.22μm。

优选地，步骤s3所述细菌保守区序列为16srdna。16srdna是编码原核生物核糖体小亚基rrna(16srrna)的dna序列，目前细菌多样性研究主要是于编码16srrna的核酸序列保守区进行。

优选地，步骤s4所述分析为对测序结果进行菌群柱状图、braycurtis分析和lefse分析。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种基于细菌群落鉴定水中尸体是否为溺亡的方法，该方法灵敏度高，所需组织样本量小，且能避免针对单一细菌核酸进行pcr可能检测不出的情况。本发明所提供方法可用于法医学检测中，对溺亡的鉴定有重要的实用价值。

附图说明

图1为溺亡大鼠的肺部组织、胃内容物、十二指肠内容物和水样的菌群柱状图(a：肺部组织；b：胃内容物；c：十二指肠内容物；d：水样)。

图2为溺亡大鼠肺部组织、胃内容物、十二指肠内容物和水样的菌群braycurtis分析(a：肺组织；b：胃内容物；c：十二指肠内容物；d：水样)。

图3为溺亡与非溺亡大鼠尸体的肺部组织菌群柱状图(a：陆地死亡；b：死后入水；c：溺亡；d：水样)。

图4为溺亡与非溺亡大鼠尸体的肺部组织菌群lefse分析(无显著差异的物种着黄色，差异显著的物种biomarker跟随组别进行着色；其中a：陆地死亡；b：死后入水；c：溺亡；d：水样)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1最优检材的选取分析

用12周的成熟sd大鼠模拟溺亡，分别提取溺亡大鼠的肺部组织、胃内容物、十二指肠内容物和溺亡水体样本，提取细菌总dna后，利用细菌16srrna(v3+v4)区域引物进行pcr扩增。

使用mobio公司所生产的土壤微生物dna强力提取试剂盒提取细菌总dna，具体步骤按说明书进行，提取的dna样品置于-20℃保存。以提取的dna为模板，使用细菌16srrna(v3+v4)区域引物，按表1所示配制好体系后置于pcr仪中，照表2所示反应条件进行pcr反应。

16srrna(v3+v4)区域引物序列如下：

vnf：5'-actcctacgggaggcagca-3'

vnr：5'-ggactachvgggtwtctaat-3'

表1pcr反应体系(50μl)

表2pcr反应条件

对扩增产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，对建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用illuminahiseq2500进行测序。，依据测序结果绘制菌落柱状图并进行braycurtis分析。

菌落柱状图如图1所示，肺部组织和水样中的菌群物种更丰富，相似度更高，十二指肠次之，胃内容最低，说明溺亡的时候，胃内容受溺液的影响较小。braycurtis分析结果如图2所示，肺部组织和水样的菌群有一定的差异，但是距离较近。综合上述结果可知，溺亡尸体的肺部组织和其他组织器官比，其细菌群落特征与溺亡地点水体的最为接近，是鉴定水中尸体死因时从尸体提取的最优检材。

实施例2溺亡与非溺亡大鼠的尸体肺部组织细菌群落特征分析

分别用12周的成熟sd大鼠模拟溺亡、死后入水和陆地死亡，对不同死因的大鼠尸体肺部组织和溺亡水体进行取样。

水体样本取样：使用经过灭菌的排空式采样器，分别取1～2l溺亡水样，使用抽滤装置对水体样本中的细菌进行富集，所用滤膜的孔径为0.22μm，抽滤至滤膜表面有可见覆盖物即可。富集完成后用一次性镊子将滤膜取出，放入冻存管内，与-80℃冰箱保存。

排空式采样器灭菌：将排空式采样器用水和洗涤剂清洗灰尘、油污后，用自来水冲洗干净，再用10％的硝酸浸泡8h。取出后用自来水冲洗3～5次，用蒸馏水充分淋洗干净。后用锡箔纸包裹，放入高压蒸汽灭菌锅内，在103.4kpa、121.3℃条件下灭菌15～30分钟，灭菌完成后于120℃烘箱中过夜。

肺部组织样本取样：使用一次性无菌镊子和无菌手术刀取体大小为0.5cm*0.5cm*0.5cm的水中尸体的肺部组织块，迅速放入预冷的写好编号的螺纹口耐-192℃冻存管内，立即置于液氮中速冻1小时后转入-80℃冰箱保存。

细菌总dna的提取、pcr扩增、测序等步骤同实施例1。

测序结果分析：依据测序结果绘制菌群柱状图并进行lefse分析。菌群柱状图如图3所示，c组即肺部组织的细菌群落更为丰富，与水体样品中的细菌菌落趋同，这可能是溺水时吸入大量的水体导致的，而b组与a组的细菌群落更趋同。lefse分析结果如图4所示，c组即肺部组织的细菌群落中有一些特异性的物种，可以将c组与其他组区别出来。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。