一种近缘毛壳菌、应用和筛选方法

1.本发明涉及生物防治技术领域，尤其是涉及一种近缘毛壳菌、应用和筛选方法。


背景技术：

2.人参(panax ginseng meyer)是五加科人参属多年生药用草本植物，是我国传统珍贵的中药材，人参药用部位为多年生宿根，因生长周期长，土壤病害多，导致人参的品质和产量受到严重制约。目前，在生产上人参病害防治主要依靠化学农药，但农药的不合理使用会引起病原菌抗药性增强、药物残留、食品安全和环境污染等问题。
3.生物防治具有环保、安全、无残留、特异性强等优点，目前用于人参根腐病生物防治的菌种有很多，例如钟嘉丽等(钟嘉丽,张苏宏,魏书琴,等.防治人参根腐病的生物制剂筛选[j].湖北农业科学,2015,54(21):5296
‑
5298.)报道了枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、em菌肥、解磷菌、嗜热性侧孢霉、哈茨木霉菌等六种菌株对人参根腐病病菌具有显著抑制作用，且枯草芽孢杆菌效果最好，勾长龙等(doi：10.7506/spkx1002
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6630
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201519025)报道了从根际土中筛选得到淀粉芽孢杆菌对于人参根腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用。李晓雯等(李晓雯,王继红,王柯坛.人参病原拮抗菌的筛选及抑菌活性的鉴定[j].东北林业大学学报,2019,v.47(09):93
‑
97.)从根际土中筛选得到34株菌，其中华氏链球菌对根腐病菌的抑制效果最为明显。
[0004]
但是，人参根腐病的发病部位为植物组织，从根际土中筛选得到的拮抗菌，由于作用部位的差异，是否能够正常发挥对根腐病病菌的抑制作用并不明确，而且枯草芽孢杆菌等强势菌具有广谱抑菌作用，对土壤微生物群落破坏严重，因此，目前急缺对于多年生药用草本植物的病害能够实现有效生物防治的微生物，尤其是对于人参的生物防治。
[0005]
鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种对人参属多年生药用草本植物具有生物防治效果的微生物。
[0007]
本发明的第二目的在于提供一种菌剂，该菌剂包括上述具有生物防治作用的微生物。
[0008]
本发明的第三目的在于提供一种上述具有生物防治作用的微生物或菌剂在植物生物防治中的应用。
[0009]
本发明的第四目的在于提供一种植物生物防治产品。
[0010]
本发明的第五目的在于提供上述具有生物防治作用的微生物的筛选方法，以满足目前人参属多年生药用草本植物对于生物防治微生物的需求，特别是人参防治对于微生物的需求。
[0011]
为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：
[0012]
第一方面，本发明提供一种近缘毛壳菌，所述近缘毛壳菌(c.subaffine)于2021年
1月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.21452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，分类名为近缘毛壳chaetomium subaffine。
[0013]
第二方面，本发明提供一种菌剂，包括第一方面所述的近缘毛壳菌。
[0014]
第三方面，本发明提供第一方面所述的近缘毛壳菌或第二方面所述菌剂在植物生物防治中的应用。
[0015]
在可选的实施方式中，所述植物包括药用草本植物。
[0016]
优选地，所述植物包括人参属多年生药用草本植物。
[0017]
优选地，所述植物包括人参。
[0018]
在可选的实施方式中，所述植物生物防治的病害包括植物根腐病。
[0019]
优选地，所述植物根腐病包括人参属多年生药用草本植物根腐病。
[0020]
优选地，所述植物根腐病包括人参根腐病。
[0021]
人参根腐病是人参根部重要的真菌病害之一，其病原菌是半知菌亚门的腐皮镰刀菌，主要危害3～6年老龄参，常从芦头或支根处开始发病，向主根蔓延，病部呈黄褐色至灰褐色，人参根部分或全部腐烂，病株枯萎，低年生参苗受害后发生苗腐。土壤和种苗带菌，病残株堆制的肥料也能传病。用农田栽参，土质黏重，地势低洼，排水不良，根系生长不良或伤口等均有利于发病。
[0022]
第四方面，本发明提供一种植物生防产品，包括第一方面所述的近缘毛壳菌和/或第二方面所述的菌剂。
[0023]
第五方面，本发明提供前述实施方式所述近缘毛壳菌的筛选方法，所述筛选方法包括将植物根腐病的病原菌与植物内生真菌进行对峙培养，得到对病原菌抑菌率大于60％的植物内生真菌，而后进行形态学鉴定和/或分子学鉴定，得到所述近缘毛壳菌；所述植物根腐病的病原菌包括人参根腐病菌。本发明从植物内生菌中进行拮抗菌的筛选，与从根际土中进行拮抗菌筛选相比较，本发明提供的近缘毛壳菌能够与植物内生，对于已经感染的植物同样能发挥抑菌效力，而从根际土中筛选得到的拮抗菌对于已经感染的植物，由于不能内生则不具有抑菌作用。
[0024]
在可选的实施方式中，所述植物内生真菌的获得方法包括健康植物根组织分离培养获得菌群落后，经纯化、分离得到内生真菌。
[0025]
在可选的实施方式中，所述对峙培养的方法包括将内生真菌和植物根腐病病菌在同一固体培养基的相对位置上共同培养。
[0026]
优选地，所述内生真菌和植物根腐病病菌以均以菌饼的形式进行培养。
[0027]
优选地，所述固体培养基包括平板培养基。
[0028]
优选地，所述固体培养基包括pda培养基。
[0029]
在可选的实施方式中，所述分子学鉴定包括对所述内生真菌进行基因测序后，进行同源物种分析。
[0030]
优选地，所述基因测序的方法包括its序列分析方法。
[0031]
优选地，所述同源物种分析的方法包括构建内生真菌的系统发育树。
[0032]
优选地，所述同源物种分析使用的数据的获得方法包括将内生真菌基因测序结果和ncbi的数据库进行序列比对。
[0033]
优选地，所述序列比对使用的软件包括blast。
[0034]
本发明采用形态学鉴定和分子学鉴定相结合的方法对从健康人参植株中分离筛选到的内生真菌进行了分析，从人参根中分离到一株具有生防潜力的内生真菌，该菌株对人参根腐病菌具有良好的抑制作用。将形态学特征及分子生物学相结合分析，并根据已报道中所描述的各种毛壳菌的形态特征，将该菌株鉴定为毛壳菌属chaetomium中的近缘毛壳菌c.subaffine。
[0035]
本发明提供的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.21452的近缘毛壳菌对腐皮镰刀菌具有拮抗作用，能够用于人参根腐病的生物防治中，仅引入一种微生物，最大程度减少了对土壤微生态的破坏，既保持了土壤微生态平衡又实现了病害的防治。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1为本发明实施例2对峙培养的结果；
[0038]
图2为本发明实施例3中1号菌株发酵液的抑菌结果；
[0039]
图3为本发明实施例4构建的1号菌株的系统发育树；
[0040]
图4为本发明实施例5中1号菌株回接后人参根块的腐烂实验结果；
[0041]
图5为本发明实施例6中1号菌株的盆栽防治效果。
具体实施方式
[0042]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
[0043]
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0044]
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
[0045]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“相对位置”指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，例如平板培养基的直径两端即属于本发明所述的“相对位置”，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0046]
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的
实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0047]
实施例1
[0048]
本实施例提供了采用组织分离法分离和纯化人参根部内生菌的方法，具体包括先用水冲洗采集到的新鲜人参根，去除根部的泥土，用无菌水冲洗两次，再用75％乙醇消毒1min，0.1％升汞消毒30s，无菌水冲洗3遍，之后用灭过菌的滤纸吸去根部表面剩余的水分，温室晾干备用。将待分离的组织用无菌手术刀切成0.5mm
×
0.5mm的薄片,置于pda平板上，于25℃培养箱中培养6d，获得的菌株再次在pda平板上纯化，4℃保存备用，得到4株真菌，分别命名为1～4号菌株，分别命名为ms
‑
01～ms
‑
04。
[0049]
实施例2
[0050]
本实施例提供了采用对峙培养法筛选具有生防能力的人参内生菌的方法，具体包括在实施例1得到的4株内生真菌的菌落边缘打取直径5mm的内生菌菌饼接入pda平板左侧，同时在pda平板右侧同一直径的相对位置接入一个同样大小的腐皮镰刀菌菌饼，设只接种腐皮镰刀菌的培养皿为对照，每个处理重复三次，而后一起置于25℃条件下培养7d，观察菌落的生长情况，7d后采用十字交叉法测定只接种腐皮镰刀菌菌落半径(rc)和对峙培养的趋向半径(rp)，并计算抑菌率，计算公式为：抑菌率＝(rc－rp)/rc
×
100％。
[0051]
实施例1得到的4株内生真菌的抑菌率如表1所示：
[0052]
表1实施例1得到的4株内生真菌的抑菌率
[0053][0054][0055]
1号菌株和腐皮镰刀菌菌株之间出现了拮抗线，腐皮镰刀菌的生长受到了明显的抑制(如图1中a所示)，在两株菌株交界处，通过显微镜观察发现腐皮镰刀菌菌丝出现了明显的溶解(如图1中b所示)和断裂(如图1中c所示)，由表1可以看出，仅有1号菌株的抑菌率超过60％，更加有利用于人参根腐病的生物防治。
[0056]
实施例3
[0057]
本实施例提供了实施例2筛选得到的1号菌株进行抑菌特性评价，具体包括在pda平板上活化筛选到的1号菌株，培养7d后将菌株接入pdb培养基中，于25℃、120r
·
min
‑1振荡培养7d，培养的菌液经双层无菌纱布过滤除去菌丝，将得到的发酵液均分成两份，一份用高压灭菌锅进行灭菌处理，另一份未做任何处理。将以上灭菌和未灭菌的1号菌株发酵液分别与冷却至45℃的pda培养基以1：4的体积比混合，制成含生防菌发酵液的固体平板，以不含发酵液的pda平板作为对照，接种直径5mm的腐皮镰刀菌菌饼于平板中央，于培养箱中25℃条件下培养7d，记录菌株生长直径大小，计算抑菌率，每处理重复3次，结果如图2所示。
[0058]
1号菌株发酵液在未灭菌和灭菌情况下对人参根腐病菌均可产生抑菌圈，菌落直径法测定的灭菌的1号菌株发酵液对人参根腐病菌的抑菌率为(47.22
±
0.39)％，未灭菌的1号菌株发酵液对人参根腐病菌的抑菌率为(79.92
±
0.77)％，图2中a图为灭菌的发酵液，b图为未灭菌的发酵液，c图为对照。
[0059]
实施例4
[0060]
对实施例3验证得到的具有显著生防功能的1号菌株进行形态学鉴定和系统发育
树的构建，具体包括：
[0061]
4.1形态学鉴定
[0062]
使用倒置相差显微镜观察菌的形态特征，具体方法为在载玻片中央滴加1滴无菌水，用盖玻片刮取少许菌丝，将其含有菌丝的一端在载玻片上的无菌水中轻轻敲打，让菌丝浸入无菌水中，然后将盖玻片置于无菌水上，轻轻按压，且尽量不要让菌丝堆叠，以免影响观察，在显微镜下观察菌丝和孢子形态并拍照。结果说明：1号菌株在pda平板上菌落呈浅黄色，气生菌丝棉絮状，生长松散、茂盛，菌丝具有明显的隔膜，孢子呈卵形，两侧平滑，两端突起。与近缘毛壳菌chaetomium subaffine的形态特征相符，初步推断1号菌株可能是近缘毛壳菌chaetomium subaffine。
[0063]
4.2系统发育树的构建
[0064]
利用真菌通用引物its1(5'
‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑
3')，如seq id no.1所示和its4(5'
‑
tccgcttattgatatgc
‑
3')，如seq id no.2所示，对提取的真菌dna进行pcr扩增。扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果为taaccattgtgaacgttacctaaaccgttgcttcggcgggcggccccggggtttaccccccgggcgcccctgggccccaccgcgggcgcccgccggaggtcaccaaactcttgataatttatggcctctctgagtcttctgtactgaataagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccatcaagccccgggcttgtgttggggacctgcggctgccgcaggccctgaaaagcagtggcgggctcgctgtcacaccgagcgtagtagcatacatctcgctctgggcgtgctgcgggttccggccgttaaaccccctttaacccaaggttgacctcggatcaggtaggaagacccgctgaacttaagcatatcaataggccggaggaa，如seq id no.3所示，长度为526bp的序列。将测序结果与nucleotide blast数据库进行序列比对，获取同源物种的信息，选取相似率大于99％的同源序列，利用mega 7.0软件以邻接法构建系统发育树，如图3所示，由图3可以看出1号菌株与近缘毛壳菌chaetomium subaffine亲缘关系最近。
[0065]
实施例5
[0066]
本实施例采用实施例3筛选得到的1号菌株回接于人参根块中，对人参根块的抗腐烂能力进行了评价，具体包括取人参根块放于灭菌的空培养皿中间，分4组处理，第一组没有任何处理，作为对照组，命名为ck组，第二组在人参根块上接种10ul含菌量为106cfu的腐皮镰刀菌的菌悬液，命名为腐皮镰刀菌组，第三组接种10ul含菌量为106cfu的腐皮镰刀菌后添加10ul含菌量为106cfu的1号菌株的菌悬液，命名为腐皮镰刀菌+ms
‑
01组，第四组单独加有10ul含菌量为106cfu的1号菌株的菌悬液，命名为ms
‑
01组。将得到的培养皿放入25℃的培养箱中培养3d后，观察人参根块的腐烂情况，结果如图4所示。由图4可以看出，在人参根块中，1号菌株的菌悬液可以显著抑制腐皮镰刀菌的生长，同时单独1号菌株菌悬液的人参根块正常生长，没有腐烂，说明1号菌株对人参根块没有破坏的现象，因而1号菌株能够用于人参根腐病的生物防治。
[0067]
实施例6
[0068]
本实施例考察实施例3筛选得到的1号菌株的盆栽防治效果。将1号菌株和人参根腐病病原菌，分别配制成孢子悬液浓度为1
×
108个/ml的菌悬液，而后取4株长势一致的盆栽人参，分别做以下处理：(1)分别灌根接种近缘毛壳菌菌悬液与人参根腐病病原菌菌悬液150ml，命名为mk+ld组，(2)灌根接种人参根腐病病原菌菌悬液300ml，命名为ld组，(3)灌根
接种近缘毛壳菌菌悬液300ml，命名为mk组，(4)以300ml无菌水做出对照组，命名为ck，每组处理进行3次重复，每7天重复一次接种，并定期观察人参植株的生长情况与发病情况，结果如图5所示，接种20天后，人参根腐病病原菌处理的人参叶片微黄，其他处理组地上部分叶片呈嫩绿色，长势较好，地下部分人参根腐病病原菌处理的人参根部有明显病原菌侵染的病斑，而其他处理组未见明显病斑，说明近缘毛壳菌对人参无害，且对人参根腐病具有一定的防效。
[0069]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。