大麦条纹病致病性基因Pgr07060及其应用

本发明属于分子生物工程领域，具体涉及大麦条纹病菌致病性基因pgr07060的生物信息学分析及其调控菌丝生长速率；干扰该基因可降低大麦条纹病的致病性的应用。

背景技术：

大麦条纹病(barleyleafstripe)属系统侵染性真菌病害，主要引起大麦叶部病害。该菌属半知菌亚门真菌(deuteromycotina)，是一种通过种子传播的病原菌，在受感染的大麦植株中系统性传播，受到感染的大麦植株整株均可发病。该病原菌主要有有性阶段和无性阶段，有性阶段为麦类核腔菌[pyrenophoragraminea(rabenk.)itoetkurib.]，无性阶段为禾内脐蠕孢[drechsleragraminea(rabenh.exsch1.)shoemaker，在自然界中常见到的是其无性阶段，有性阶段比较少见。大麦条纹病主要通过种子带菌进行传播，主要危害植物的叶片、叶鞘和茎秆部位，大麦种子萌发时，菌丝在种皮与内颖之间或在种皮内存活，有时在种皮和蛋白质层中形成菌丝，在幼苗中建立系统感染。

本研究以大麦条纹病强致病力菌株qwc为材料，以基因组测序结果为基础，筛选出与大麦条纹病菌效应基因pgr07060，并对其分离克隆，通过基因干扰的方法研究其功能，并从菌丝的形态、显微结构和致病性方面验证其相关功能，明确效应蛋白pgr07060在大麦条纹病菌中致病性的功能机制，为阐明大麦条纹病菌的致病机理、丰富植物病原菌的基因功能、大麦抗病新防治策略和抗病育种提供理论和现实意义。

现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病(麦类核腔菌)pgr07060基因及rna干扰该基因应用的报道。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgr07060，以应对该病害靶标基因的需求，运用rna干扰技术获得pgr07060干扰突变体，并从菌丝的形态、显微结构和致病性方面验证其相关功能，明确效应基因pgr07060在大麦条纹病菌中致病性的功能机制为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

1.一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgr07060，该基因全长序列如seqidno：1所示。

2.一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgr07060获取方法，包括：

(1)大麦条纹病菌株的培养

制备pda培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成2cm²的小方块，称取重量200g，加1.2l蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1l，高压蒸汽灭菌，倒平板；将4℃保存的大麦条纹病菌菌株qwc用直径为5-10mm的打孔器在边缘打取菌饼置于pda培养基平板上生长7d。

(2)pgr07060基因的克隆

以qwc基因组的cdna为模板克隆pgr07060基因，使用引物pgr07060-f/pgr07060-r(附图1)通过pcr扩增获得pgr07060基因的序列，pcr产物经切胶、胶回收、连接载体pmd19-tvector：pmd19-tvector(simple)1μl、目的片段4μl、solutionⅰ5μl，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接14h、转化trans1-t1感受态细胞：制备含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lba固体培养基平板，将80μlx-gal和20μliptg混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的trans1-t1感受态细胞，冰上溶解，每50μl感受态细胞加入5μl过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5ml离心管加入650μllb液体培养基，37℃200rpm振荡培养1.5h；取200μl菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。

(3)pgr07060基因序列及生物信息学分析

本试验提取野生株qwc的rna并反转录成cdna，经过pcr扩增(附图2a)，连接pmd19-tvector(simple)载体，转化大肠杆菌感受态细胞后，测序获得pgr07060基因的cdna序列，成功克隆到麦类核腔菌(p.graminea)的pgr07060基因。将pgr07060基因进行生物信息学分析，并运用在线软件进行预测分析，结果得出：根据orffinder软件分析pgr07060基因全长1119bp，expasy软件翻译出pgr07060编码372个氨基酸，protparam软件对其理化性质预测分析得出：pgr07060编码蛋白的等电点约为8.40，该蛋白为碱性蛋白；蛋白分子量mw是39.79kd，组成的氨基酸中苏氨酸(thr)占比最多为11.8％，其次是脯氨酸(pro)占11.6％；亲水性平均值(gravy)是-0.419；带正电荷残基总数(arg+lys)为25，带负电荷残基总数(asp+glu)为22；脂肪指数(aliphaticindex)为64.84；分子式是c1762h2743n473o555s11，原子总数为5544；不稳定性指数(instabilityindex，ii)为51.96，得出该蛋白质为不稳定的(ii<40，即为不稳定蛋白)。利用sopma工具预测分析其蛋白二级结构，无规卷曲(randomcoil，cc)占比最多为56.18％，最少的是β-转角(betaturn，tt)，其比率为8.33％，α-螺旋(alphahelix，hh)占到12.10％，延伸链(extendedstrand，ee)的占比为23.39％(附图2b)；用protscale软件进行亲疏水性分析，0以上的峰值表示蛋白为疏水性，以下的峰值表示蛋白为亲水性，同时结合脂肪指数(aliphaticindex)和亲水性平均值(gravy)推断得出，pgr07060编码的蛋白为亲水性蛋白(附图2c)；netphos3.1server软件预测分析磷酸化位点得出：pgr07060基因编码蛋白存在络氨酸(tyrosine，tyr)，苏氨酸(threonine，thr)和丝氨酸(serine，ser)磷酸化位点(附图2d)；tmpred软件预测蛋白质跨膜区得出pgr07060编码的蛋白存在跨膜区，预测其属于跨膜蛋白(附图2e)。

3.pgr07060基因在麦类核腔菌生长分化和致病性的应用，包括如下步骤：

(1)干扰载体psilent-1pgr07060的构建

以菌株qwc的dna为模板，使用引物pgr07060-1-f1、pgr07060-1-r1和pgr07060-2-f1、pgr07060-2-r1(附图1)分别扩增获得片段pgr07060-1(498bp)和pgr07060-2(498bp)。用kpnⅰ和bglii双酶切片段pgr07060-1和载体psilent-1，用t4连接酶将片段psilent-1连接到载体psilent-1上。然后将片段pgr07060-2和psilent-1pgr07060-1用xhoⅰ和hindiii双酶切，用t4连接酶将片段pgr07060-2连接到载体psilent-1-pgr07060-1上，得到pgr07060基因的干扰载体psilent-1-pgr07060(附图3)。

(2)遗传转化与转化株的筛选

将野生株qwc菌株置于酶解液(10mg/ml溶壁酶+20mg/ml纤维素酶r-10，以1.2mol/lnacl稳渗剂配制)30℃温育3h，过滤无菌溶液后重悬，悬浮液在30℃下80rpm/min摇3-4h，将悬浮液过滤到10m离心管中，室温1996rpm/min离心5min，用1.2mol/lnacl清洗两次，最后重悬在ntc(1.2mnacl+10mmtris-hcl(ph＝7.5)+10mmcacl2)溶液中保存。通过peg4000介导进行转化：取100μlntc重悬沉淀，加入25μlpsilent-1-pgr07060的质粒dna混合，混合液在室温下培养20min，200μl、200μl、800μlpeg4000按顺序添加(逐滴加入)，混合后的悬浮液室温培养20min，将原生质体转化混合物在25℃静置24h后，取100μl原生质体转化混合物，加入20ml再生培养基(rpd，含有0.7mol/l蔗糖的pd)，混匀后倒入平板，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10-15ml含有50μg/ml潮霉素b的pda培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有50μg/ml潮霉素b的pda培养基平板中，连续培养3代，获得能稳定生长的转化子3株(pgr07060-1、pgr07060-5和pgr07060-6)，用潮霉素b特异性引物hyg-1/hyg-2进行pcr鉴定筛选，进行荧光定量pcr分析得出干扰率分别为：45.17％、65.38％和68.09％，所需引物如附图1所示。

(3)突变菌株致病性的鉴定

选取干扰率最大的菌株pgr07060-6和qwc(ck)菌株接种到pda培养基中，25黑暗培养7d后，采用“三明治法”将大麦种子用qwc和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况。菌株侵染离体大麦叶片，野生株qwc菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。野生株qwc和干扰株pgr07060-6的发病率分别为：100％和44.22％(附图4)，干扰株pgr07060-6的发病率与对照比较显著降低。综上所述，大麦条纹病菌菌株pgr07060基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。

附图说明

图1为本发明所用引物序列。

图2为pgr07060基因生物信息学分析图。

其中a为pgr07060基因扩增结果及序列对比图，b为pgr07060基因的蛋白二级结构预测图，c为pgr07060基因的亲疏水性图，d为pgr07060基因的磷酸化位点图，e为pgr07060基因的跨膜区预测图。

图3为pgr07060基因干扰载体示意图。

图4为干扰株与野生株的相对表达量、发病率及形态图。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因pgr07060，该基因cds序列如序列表1所示。

实施例2

本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgr07060基因克隆及其rna干扰转化子获得的方法，包括如下步骤：

1、pgr07060基因的克隆及其生物信息学分析

制备pda培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成2cm²的小方块，称取重量200g，加1.2l蒸馏水煮沸20-30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1l，高压蒸汽灭菌，倒平板；将4℃保存的大麦条纹病菌菌株qwc用直径为5-10mm的打孔器在边缘打取菌饼置于pda培养基平板上生长7d。

以qwc基因组的cdna为模板克隆pgr07060基因，使用引物pgr07060-f/pgr07060-r通过pcr扩增获得pgr07060基因的序列，pcr产物经切胶、胶回收、连接载体pmd19-tvector：pmd19-tvector(simple)1μl、目的片段4μl、solutionⅰ5μl，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接14h、转化trans1-t1感受态细胞：制备含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lba固体培养基平板，将80μlx-gal和20μliptg混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出-80℃保存的trans1-t1感受态细胞，冰上溶解，每50μl感受态细胞加入5μl过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5ml离心管加入650μllb液体培养基，37℃200rpm振荡培养1.5h；取200μl菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。

通过提取野生株qwc的rna并反转录成cdna，经过pcr扩增(附图2a)，连接pmd19-tvector(simple)载体，转化大肠杆菌感受态细胞后，测序获得pgr07060基因的cdna序列，成功克隆到麦类核腔菌(p.graminea)的pgr07060基因。将pgr07060基因进行生物信息学分析，并运用在线软件进行预测分析，结果得出：根据orffinder软件分析pgr07060基因全长1119bp，expasy软件翻译出pgr07060编码372个氨基酸，protparam软件对其理化性质预测分析得出：pgr07060编码蛋白的等电点约为8.40，该蛋白为碱性蛋白；蛋白分子量mw是39.79kd，组成的氨基酸中苏氨酸(thr)占比最多为11.8％，其次是脯氨酸(pro)占11.6％；亲水性平均值(gravy)是-0.419；带正电荷残基总数(arg+lys)为25，带负电荷残基总数(asp+glu)为22；脂肪指数(aliphaticindex)为64.84；分子式是c1762h2743n473o555s11，原子总数为5544；不稳定性指数(instabilityindex，ii)为51.96，得出该蛋白质为不稳定的(ii<40，即为不稳定蛋白)。利用sopma工具预测分析其蛋白二级结构，无规卷曲(randomcoil，cc)占比最多为56.18％，最少的是β-转角(betaturn，tt)，其比率为8.33％，α-螺旋(alphahelix，hh)占到12.10％，延伸链(extendedstrand，ee)的占比为23.39％(附图2b)；用protscale软件进行亲亲水性分析，0以上的峰值表示蛋白为疏水性，以下的峰值表示蛋白为亲水性，同时结合脂肪指数(aliphaticindex)和亲水性平均值(gravy)推断得出，pgr07060编码的蛋白为亲水性蛋白(附图2c)；netphos3.1server软件预测分析磷酸化位点得出：pgr07060基因编码蛋白存在络氨酸(tyrosine，tyr)，苏氨酸(threonine，thr)和丝氨酸(serine，ser)磷酸化位点(附图2d)；tmpred软件预测蛋白质跨膜区得出pgr07060编码的蛋白存在跨膜区，预测其属于跨膜蛋白(附图2e)。

2、干扰载体psilent-1-pgr07060的构建

以菌株qwc的dna为模板，使用引物pgr07060-1-f1、pgr07060-1-r1和pgr07060-2-f1、pgr07060-2-r1(附图1)分别扩增获得片段pgr07060-1(498bp)和pgr07060-2(498bp)。用kpnⅰ和bglii双酶切片段pgr07060-1和载体psilent-1，用t4连接酶将片段psilent-1连接到载体psilent-1上。然后将片段pgr07060-2和psilent-1-pgr07060-1用xhoⅰ和hindiii双酶切，用t4连接酶将片段pgr07060-2连接到载体psilent-1pgr07060-1上，得到pgr07060基因的干扰载体psilent-1-pgr07060(附图3)。

3、遗传转化与转化株的筛选

将野生株qwc菌株置于酶解液(10mg/ml溶壁酶+20mg/ml纤维素酶r-10，以1.2mol/lnacl稳渗剂配制)30℃温育3h，过滤无菌溶液后重悬，悬浮液在30℃下80rpm/min摇3-4h，将悬浮液过滤到10m离心管中，室温1996rpm/min离心5min，用1.2mol/lnacl清洗两次，最后重悬在ntc(1.2mnacl+10mmtris-hcl(ph＝7.5)+10mmcacl2)溶液中保存。通过peg4000介导进行转化：取100μlntc重悬沉淀，加入25μlpsilent-1-pgr07060的质粒dna混合，混合液在室温下培养20min，200μl、200μl、800μlpeg4000按顺序添加(逐滴加入)，混合后的悬浮液室温培养20min，将原生质体转化混合物在25℃静置24h后，取100μl原生质体转化混合物，加入20ml再生培养基(rpd，含有0.7mol/l蔗糖的pd)，混匀后倒入平板，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10-15ml含有50μg/ml潮霉素b的pda培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有50μg/ml潮霉素b的pda培养基平板中，连续培养3代，获得能稳定生长的转化子3株(pgr07060-1、pgr07060-5和pgr07060-6)，用潮霉素b特异性引物hyg-1/hyg-2进行pcr鉴定筛选，进行荧光定量pcr分析得出干扰率分别为：45.17％、65.38％和68.09％，所需引物如附图1所示。

实施例3

本实施例提供大麦条纹病致病基因pgr07060参与调控麦类核腔菌致病性的应用，包括：选取干扰率最大的菌株pgr07060-6和qwc(ck)菌株接种到pda培养基中，25黑暗培养7d后，采用“三明治法”将大麦种子用qwc和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况。菌株侵染离体大麦叶片，野生株qwc菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。野生株qwc和干扰株pgr07060-6的发病率分别为：100％和44.22％(附图4)，干扰株pgr07060-6的发病率与对照比较显著降低。综上所述，大麦条纹病菌菌株pgr07060基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。有益效果：本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgr07060，以应对该病害靶标基因的需求，通过rna干扰技术获得pgr07060干扰突变体，进一步提供了该基因在菌丝生长分化及致病性等方面的应用。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110>甘肃农业大学

<120>大麦条纹病致病性基因pgr07060及其应用

<160>1

<210>1

<211>1119bp

<212>dna

<213>大麦条纹病菌-麦类核腔菌（pyrenophoragraminea）

<400>

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