柑橘黄龙病抗性相关蛋白及其编码基因和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及柑橘黄龙病抗性相关蛋白及其编码基因和应用。


背景技术：

2.病原生物和害虫造成的损失占世界农作物总产量损失的20％以上，是农业生产中防治的最主要对象。大多数病原体，包括细菌、真菌和病毒在内的80％都是通过昆虫媒介传播的，植物常受到昆虫和病原体的双重胁迫，对其产量和品质造成极大损失，是制约我国农作物及经济作物高产稳产的主要影响因素之一。昆虫传播的病原体引起超过300种毁灭性的主要农作物病害，比如柑橘木虱传播的柑橘黄龙病、灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病、蓟马传播的番茄斑萎病等。由于在大多数作物品种中很少有针对昆虫传播的病原体的抗性基因，因此在农业实践中控制昆虫传播的疾病在很大程度上依赖于通过施用化学农药破坏昆虫媒介介导的病原体传播，但长期施用化学农药导致了昆虫的抗药性和环境污染。因此，基于农业绿色发展和可持续发展的需求，了解植物防御网络如何应对双重胁迫，寻找有效的抗性基因并通过遗传改良作物来实现植物抗逆性和高产目的具有十分重要的意义。
3.柑橘黄龙病，又称柑橘绿化病、黄梢病、黄枯病，已经成为危害世界柑橘产业的“头号杀手”，目前所有已知的商业柑橘品种均易感黄龙病。在田间，黄龙病通过介体昆虫柑橘木虱进行传播。黄龙病的典型病症包括叶片斑驳状黄化、叶片皮革化并增厚、叶脉出现木栓黄化、果实着色倒转(花梗附近先变黄)且早熟掉落，导致柑橘产量下降、风味变差。由于黄龙病在田间容易同其它缺素症混淆，并且潜伏期长，因此在感染前期较难发现，防治难度很大，没有耐受品种和有效的抗病基因，现在的主要防控措施有：无菌苗木组培脱毒、一旦发现立即砍除病树，导致防控柑橘黄龙病成本巨大。此外，单一施用化学农药导致柑橘木虱抗药性增强、果品安全和生态环境恶化等诸多风险聚积。因此，黄龙病防控形势依然严峻，提高植物抗虫能力对遏制黄龙病的扩散十分重要。
4.克隆和鉴定新的抗病相关基因可为培育抗病虫植物新品种提供重要的基因资源，有助于植物抗病虫育种，具有较好的潜在应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗虫性。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了提高植物抗虫性的蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
7.d1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗虫性或提高植物抗虫性中的应用；
8.d2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗虫性或提高植物抗虫性的产品中的应用；
9.d3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗虫植物中的应用；
10.d4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗虫植物的产品中的应用；
11.d5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
12.所述蛋白质名称为myc2，为如下a1)、a2)或a3)：
13.a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；
14.a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有抗虫功能的蛋白质；
15.a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
16.为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
17.表1：标签的序列
18.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
19.上述a2)中的myc2蛋白质，为与seq id no.1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
20.上述a2)中的myc2蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
21.上述a2)中的myc2蛋白质的编码基因可通过将seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连上表1所示的标签的编码序列得到。
22.其中，seq id no.2所示的dna分子编码seq id no.1所示的myc2蛋白质。
23.上述应用中，所述蛋白质来源于柑橘。
24.上述应用中，所述植物为下述任一种：
25.f1)单子叶植物或双子叶植物；
26.f2)芸香目植物；
27.f3)芸香科植物；
28.f4)柑橘属植物；
29.f5)柑橘。
30.本发明还提供了与myc2蛋白质相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
31.d1)与myc2蛋白质相关的生物材料在调控植物抗虫性或提高植物抗虫性中的应用；
32.d2)与myc2蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗虫性或提高植物抗虫性的产
品中的应用；
33.d3)与myc2蛋白质相关的生物材料在培育抗虫植物中的应用；
34.d4)与myc2蛋白质相关的生物材料在制备培育抗虫植物的产品中的应用；
35.d5)与myc2蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；
36.所述生物材料可为下述b1)至b7)中的任一种：
37.b1)编码myc2蛋白质的核酸分子；
38.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
39.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
40.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
41.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
42.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
43.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。
44.上述应用中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：
45.b1)编码序列(cds)是seq id no.2所示的dna分子或cdna分子；
46.b2)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子或cdna分子；
47.b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码myc2蛋白质的dna分子或cdna分子；
48.b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码myc2蛋白质的dna分子或cdna分子。
49.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码myc2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的myc2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码myc2蛋白质且具有myc2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
50.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
51.上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
52.上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
53.上述应用中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
54.本文中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质myc2。
55.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
56.所述调控基因表达的物质具体可为b1)-b3)中任一所述的生物材料。
57.上述应用中，b2)所述表达盒(myc2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达myc2的dna，该dna不但可包括启动myc2基因转录的启动子，还可包括终止myc2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
58.可用现有的表达载体构建含有所述myc2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3
′
端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3
′
端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3
′
端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便
于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
59.上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体可为病毒诱导的基因沉默(vigs)载体，所述病毒诱导的基因沉默(vigs)载体具体可为pstrv1或pstrv2，所述质粒具体可为pentr-3c或pba-6myc。
60.上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等。
61.本发明还提供了一种培育抗虫植物的方法，包括提高或增加目的植物中myc2蛋白质的含量和/或活性，得到抗虫性高于所述目的植物的抗虫植物。
62.上述方法中，所述提高或增加目的植物中myc2蛋白质的含量和/或活性通过提高或增加目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。
63.上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：
64.b1)编码序列(cds)是seq id no.2所示的dna分子或cdna分子；
65.b2)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子或cdna分子；
66.b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码myc2蛋白质的dna分子或cdna分子；
67.b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码myc2蛋白质的dna分子或cdna分子。
68.上述方法中，所述植物为下述任一种：
69.f1)单子叶植物或双子叶植物；
70.f2)芸香目植物；
71.f3)芸香科植物；
72.f4)柑橘属植物；
73.f5)柑橘。
74.本发明中，所述抗虫植物理解为不仅包含将所述myc2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗虫植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
75.本发明还提供了培育抗虫植物的方法在创制抗虫植物和/或植物育种中的应用。
76.上述蛋白质及其相关生物材料也属于本发明保护的范围。
77.本发明所述植物可为双子叶植物。所述双子叶植物可为芸香科植物或十字花科植物。所述芸香科植物可为柑橘，所述十字花科植物可为拟南芥。所述抗虫植物可为抗木虱植
j*.2014.virulence factors of geminivirus interact with myc2 to subvert plant resistance and promote vector performance.the plant cell26:4991-5008.公众可从中国科学院微生物研究所获得。
95.拟南芥品种为哥伦比亚生态型(col-0)，arabidopsis biological resource center(abrc)。拟南芥生长的温室环境维持在：12h光照/12h黑暗，日间温度23℃、夜间温度22℃，相对湿度50％。
96.柑橘品种为瓦伦西亚甜橙，来自中国农业科学院柑橘所王雪峰老师馈赠，可市购。甜橙生长的温室环境维持在：12h光照/12h黑暗，日间温度28℃、夜间温度25℃，相对湿度60％-70％。
97.下述实施例中所用的柑橘木虱来自赣南师范大学卢占军老师馈赠，后在九里香上扩大繁殖用于后续实验，养植室内温度为25℃-27℃，相对湿度50％，光照周期为12h光照/12h黑暗。
98.实施例1、myc2基因的克隆及myc2基因表达载体的构建
99.一、myc2基因的克隆
100.设计上游引物f：5
’‑
cgcggatccatgacggactaccggttaccttc-3’(带下划线的核苷酸序列为bamhi的识别位点)和下游引物r：5
’‑
ccgctcgagtgttgggtatctccaactttggctg-3’(带下划线的核苷酸序列为xhoi的识别位点)，从瓦伦西亚甜橙的转录本中扩增myc2基因的cdna,得到含有长度为2058bp的myc2基因的pcr扩增产物。myc2基因编码氨基酸序列是序列表中的seq id no.1所示的蛋白质myc2。序列表中的seq id no.2为编码序列(cds)。
101.二、表达载体35s:myc2-6myc的构建
102.1.将pentr-3c载体用限制性内切酶bamhi和xhoi切开，然后将步骤一得到的扩增产物与切开的载体用t4 dna连接酶连接得到中间载体pentr-3c-myc2。
103.2.利用重组酶(gateway lr clonase ii)将中间载体pentr-3c-myc2和表达载体pba-6myc通过lr反应进行连接，得到重组质粒35s:myc2-6myc。经测序验证，该重组质粒包含序列表中seq id no.3所示的myc2 cdna序列。将重组质粒命名为35s:myc2-6myc。35s:myc2-6myc中，由camv35s启动子驱动myc2基因表达。
104.三、病毒诱导的基因沉默(vigs)载体的构建
105.pstrv2-csmyc2重组沉默载体的构建
106.设计正向引物f:gctctagattggtaacagtccggtttggg和反向引物r：cgcggatccaccagcaccaccacttgatt以pentr-3c-myc2中间载体为模板扩增得到800bp的pcr产物，然后用t4 dna连接酶与载体pstrv2连接，得到病毒诱导的基因沉默载体pstrv2-csmyc2。
107.病毒诱导的基因沉默载体pstrv2-csmyc2是将pstrv2载体的xbai和bamhi识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中seq id no.2的第601-1389位所示的dna片段，保持pstrv2载体的其他序列不变，得到的pstrv2-csmyc2重组沉默载体。
108.实施例2、myc2转基因拟南芥在植物抗虫性中的应用
109.一、myc2稳定转基因株系的获得
110.1.将实施例1的重组质粒35s:myc2-6myc电击转化到根癌农杆菌eha105中，挑取正确的克隆，在5ml lb液体培养基中震荡过夜培养，保存菌株。
111.2.蘸花法转化拟南芥。挑取保存的农杆菌在2ml lb培养基(25μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平)28℃，200rpm过夜培养，第二天转接到200ml lb培养基中继续培养，直至od
600
＝1.5；收集菌液以4000rpm的速度离心20min，弃去上清，加入等体积的、含有0.02％silwet-77的5％蔗糖溶液重悬菌体；将还未开花的哥伦比亚生态型(col-0)拟南芥花序完全浸入溶液，并保持45s-1min；用塑料膜包覆浸花后的拟南芥，在植物房避光过夜，第二天揭开覆膜；在长日照(16h光照/8h黑暗)的条件下养植，约一个月后，收种得到t1代转基因植物种子(简称t1代植物种子)。
112.二、转基因植物鉴定
113.1.抗性筛选
114.用70％酒精、2.6％naclo对t1代植物种子进行表面消毒，铺在含有50mg/ml羧苄抗生素的ms固体培养基上，置于4℃春化两天；抗性培养皿中正常生长，幼苗不变黄的可能是转基因植株，14天后移栽到营养土中。
115.2.蛋白免疫印迹法(western blot)检测转基因植物蛋白表达情况
116.(1)提取植物总蛋白。1.5ml离心管中加入两颗钢珠，将每单株植物取样0.05g放入其中，然后迅速在液氮中冷冻；将样品研磨机用液氮预冷，以60hz，90s的模式将样品研磨成粉末；在离心管中加入200μl 2
×
sds(含2.5％β-巯基乙醇)提取植物总蛋白，充分混匀；沸水中煮样10min，使蛋白充分变性，最后12000rpm，10min离心，使变性后的蛋白中的杂质沉淀下来。
117.(2)myc2蛋白表达检测。配置10％sds-page蛋白胶，取10μl植物总蛋白上清上样，100v稳压进行电泳，直至指示带到达分离胶的底部；在100v，60min条件下，将蛋白转移到pvdf膜上；商业化抗体anti-c-myc检测植物中myc2蛋白的表达情况，western blot结果如图1所示，t1代植物中，12#和14#株系的表达量较高，以下又称csmyc2-12 oe和csmyc2-14 oe。
118.3.获得纯合的myc2转基因株系
119.将上述两个株系(12#和14#株系)进行繁代种植，并在每一代进行抗性筛选，直至在t3代中筛选到完全能正常生长的纯合株系(myc2-oe)。
120.三、myc2转基因拟南芥对柑橘木虱的抗性检测
121.1.柑橘木虱的存活率测定。t3代转基因拟南芥纯合株系(myc2-oe)、野生型拟南芥(col-0)从ms培养基移栽到土壤一个月后进行生测实验。首先，将拟南芥除叶片外的其它地方用封口膜覆盖，放入大小适宜的玻璃罐中，一个玻璃罐1株拟南芥；将20头柑橘木虱放入玻璃罐中，然后用透气的纱网把玻璃管口封住；每24h对玻璃罐中的柑橘木虱进行计数，持续5天；每个株系4株植物，实验重复3次，统计柑橘木虱存活率见表1。
122.表1柑橘木虱存活率(％)
[0123][0124]
结果取平均值，采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标
准偏差表示，采用t-test检验，p＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异。
[0125]
结果如图3所示，在前期1-2天，myc2-oe植物的柑橘木虱存活率显著低于对照组col-0；随着时间的推移，由于缺少食物，柑橘木虱的数量大大减少，myc2-oe与col-0上的柑橘木虱的存活率没有显著性差异，说明myc2过表达对柑橘木虱的生存不利，myc2的过表达能提高植物的抗虫性。
[0126]
2.柑橘木虱嗅觉选择实验。植物的挥发性气味在昆虫的选择定位中发挥重要的作用，昆虫选择有利于自己生存、产卵的环境。为比较不同的植物对柑橘木虱的吸引作用，通过y形管检测装置对柑橘木虱的偏好性进行统计。在进行选择前，拟南芥用100μm meja预先处理。检测装置如图7所示，装置由大气采样仪、活性炭过滤装置、空气加湿装置、气体流量计、y形管以及橡皮管组成；维持100ml/min的恒定气流，两侧烧瓶分别放入待选择的植物，柑橘木虱由y形管左侧进入，从柑橘木虱开始进入一侧y形管的1/2处开始计时，停留1min以上记一次数，如超过5min没有选择迹象，则认为不选择；每20头柑橘木虱为一组，统计木虱选择两个不同处理的概率(柑橘木虱选择率(％)；一组过后，洗净y形管并将植物的位置调换，排除无关因素的影响，继续下一组；完成六组后，取平均数，采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用卡方x2检验，p＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，p＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。
[0127]
结果如图2所示，柑橘木虱选择myc2-oe植株的数量显著低于对照col-0植株，嗅觉生测实验结果说明myc2-oe植株对柑橘木虱有趋避作用，不吸引柑橘木虱，进一步证明了myc2过表达植株的抗虫能力增强了。
[0128]
四、myc2基因沉默的植物抗虫性检测和相关基因表达量
[0129]
1.myc2基因沉默
[0130]
(1)将实施例1的载体质粒pstrv2-csmyc2以及pstrv1、pstrv2空载体电击转化到农杆菌eha105中，挑取单克隆对插入基因的质粒用载体引物和序列引物进行菌落pcr确认得到转入pstrv1的重组农杆菌(命名为eha105/pstrv1)、转入pstrv2的重组农杆菌(命名为eha105/pstrv2)转入pstrv2-csmyc2的重组农杆菌(命名为eha105/pstrv2-csmyc2)，分别在5ml lb(25μg/ml卡那霉素、50μg/ml利福平)液体培养基中培养24h，转接到500ml lb培养基至od
600
大于1.5；
[0131]
(2)收集重组农杆菌(4000rpm，15min)，弃上清，用等体积mma(10mm mgcl2、10mm mes、150μm acetosyringone)液体重悬菌体，调od
600nm
值至1.5，室温静置三小时以上，得到如下三种重组农杆菌菌液：eha105/pstrv1菌液、eha105/pstrv2菌液和eha105/pstrv2-csmyc2菌液；
[0132]
(3)实验设两种处理：将eha105/pstrv1菌液和eha105/pstrv2菌液按照1:1的体积比例混匀(作为对照，记为pstrv1+pstrv2处理)，将eha105/pstrv1菌液和eha105/pstrv2-csmyc2菌液按照1:1的体积比例混匀(记为pstrv1+pstrv2-csmyc2处理)，均分别加入万分之二silwet-77，真空泵抽真空；将2-4片完全展开叶片的哥伦比亚生态型(col-0)拟南芥植株浸入重组农杆菌重悬液，3-5min真空泵中抽真空，然后洗净叶片上残留的菌液并擦干，剩余的菌液浇灌根系；处理后的植物在黑暗中放置一夜。
[0133]
2.myc2沉默后基因表达量
[0134]
pstrv1+pstrv2处理(control)和pstrv1+pstrv2-csmyc2处理(myc2-vigs)的柑橘
叶片分别取样，plant rna regent提取叶片的rna，然后用全式金反转录试剂盒将rna反转录得到cdna；以待测柑橘叶片的cdna为模板，以cscox基因作为内参基因，通过实时荧光定量pcr检测myc2基因的相对表达量。每个株系取4株植物，实验重复3次，结果取平均值，采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采t-test检验，p＜0.05(*)表示与野生型拟南芥相比具有显著性差异，p＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。
[0135]
结果如图4中a所示，比较对照(control)和处理样品(myc2-vigs)的myc2基因的表达量，基因扩增引物序列为f:5
’‑
caatcctcgtgcgattactc-3’；r：5
’‑
cacaacctgaattcgccagt-3’。可以看出，pstrv1+pstrv2-csmyc2处理的myc2基因的表达量被显著抑制了。以下将pstrv1+pstrv2-csmyc2处理得到的柑橘称为myc2-vigs柑橘，将pstrv1+pstrv2处理得到的柑橘称为对照柑橘。
[0136]
3.柑橘上的木虱双选择实验
[0137]
根据实时定量pcr结果，将myc2-vigs柑橘，与对照柑橘一同进行柑橘木虱的嗅觉双选择实验，选择前植物预先用1mm meja处理，余下参照上述拟南芥的双选择实验的方法进行。
[0138]
结果如图5所示，当myc2的表达量降低后，相比于对照组，柑橘木虱偏好选择基因沉默株系myc2-vigs的柑橘，说明myc2具有抗虫的作用。
[0139]
4.驱避类萜烯化合物合成基因的表达量
[0140]
萜烯类化合物在调控昆虫的选择行为上有着重要作用，可以为植物提供保护，免受昆虫的影响。萜烯类化合物大多由萜烯合酶(terpene synthase，tps)家族tps基因参与合成，tps基因受到myc2的调控。因此我们检测了myc2被沉默后，这些tps基因的表达情况。同样以cscox作为内参，检测了tps20、tps21、tps22、tps23的基因相对表达量。
[0141]
cstps20-f:tggcaaagaaaagatgcaagagc，cstps20-r:tgatgacgctgttgaaatcttaggg
[0142]
cstps21-f:gaaaccattggcaggctcat，cstps21-r:cgtgcgaaataaagaagccgt
[0143]
cstps22-f:tgacgaatgacgttgaaggca，cstps22-r：taaccttgatacggctctacgg
[0144]
cstps23-f：agtggtttccatgacttctgct，cstps23-r：aggcagtctaatgcaactgtca。
[0145]
结果如图4中b所示，与对照的柑橘相比，myc2-vigs柑橘中萜烯化合物tps20、tps21、tps22、tps23的基因表达量显著下调，更加吸引柑橘木虱。
[0146]
采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用one-way anova检验，p＜0.05(*)表示与对照柑橘相比具有显著性差异，p＜0.01(**)表示与野生型拟南芥相比具有极显著性差异。
[0147]
五、(e)-beta-farnesene((e)-β-法尼烯)趋避柑橘木虱
[0148]
tps20、tps21、tps22、tps23基因的相对表达量在myc2沉默的柑橘中显著降低，经分析预测，它们均为(e)-beta-farnesene合成酶基因。(e)-beta-farnesene是一种倍半萜，作为蚜虫的警戒素广为人知，在农业病虫害防治上有着广泛的应用。为了了解(e)-beta-farnesene对柑橘木虱行为的影响，我们首先将100μg的(e)-beta-farnesene溶于100μl矿油中，溶剂矿油作为负对照，然后利用嗅觉双选择实验来测试柑橘木虱对(e)-beta-farnesene的反应。
[0149]
结果如图6所示，多次实验发现(e)-beta-farnesene对木虱有趋避作用。
[0150]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。