一种分级提取小球藻胞外聚合物的方法

本发明涉及小球藻胞外聚合物的分级提取方法，特别是一种分级提取小球藻胞外聚合物的方法。

背景技术：

胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，eps)存在于细胞外部，是一种由多糖、蛋白质、核酸、腐殖质和其他存在于微生物聚集体内部的聚合物组成的高分子聚合物。eps作为高分子混合物，具有多种性质，如吸附性、亲/疏水性、生物降解性等，并且能够和环境中的其他物质相互作用，从而对微生物聚集体自身、地球化学以及人类的生产生活造成影响，胞外聚合物可以保护藻类或细菌免受外部干扰，在环境毒理学研究领域起着重要的作用。胞外聚合物可以分为结合型胞外聚合物(boundextracellularpolymericsubstances，b-eps)和可溶性胞外聚合物(solubleextracellularpolymericsubstances，s-eps)，其中，结合型胞外聚合物一般由内层的紧密结合型胞外聚合物(tightly-boundextracellularpolymericsubstances，tb-eps)和外层的松散结合型胞外聚合物(loosely-boundextracellularpolymericsubstances，lb-eps)构成。

关于藻类整体胞外聚合物和各级胞外聚合物与所处环境中物质的相互作用虽有不少研究，但不同研究者所得结果的可比性较差，其中一个重要原因就是胞外聚合物的分级操作条件差异大和相应的表征缺少。同时传统的分级分离胞外聚合物的方法存在操作复杂、富集困难，难以准确定量以及长期保存的缺点，采用传统的分离方法难以获得足量的分级胞外聚合物，且耗时较长，工艺流程复杂，这些都使得研究不同组分的胞外聚合物在藻类与污染物之间的相互作用受到阻碍。因此，研究开发一种快速分级提取小球藻胞外聚合物的方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速分级提取小球藻胞外聚合物的方法，现有的藻类胞外聚合物提取方法较多，且多是将小球藻胞外聚合物作为一个整体进行提取操作，无法获得具有特定组分及功能特征的胞外聚合物，上述缺陷不利于深入开展胞外聚合物在藻类及污染物之间相互作用的研究，旨在解决上述缺陷，本发明提供一种详细的分级提取小球藻胞外聚合物，并且通过切向流超滤技术、透析等可对三种不同组成和性质的胞外聚合物进行高效快速纯化，富集保存的操作方法。并且减少了对藻液酸碱度的调控，省去化学药品的使用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种分级提取小球藻胞外聚合物的方法，包括如下步骤：

(1)、培养小球藻并用细胞计数仪获得对数生长期的小球藻生物量；

(2)、小球藻胞外聚合物分级提取：

将步骤(1)获得的小球藻悬浮液离心并收集上清液一，即上清液一中含小球藻可溶性胞外聚合物，同时得沉淀物一；沉淀物一加入nacl溶液使其重新悬浮至原体积，涡旋使其分散均匀，随后低温中高速离心，收集上清液二，即上清液二中含小球藻松散结合型胞外聚合物，同时得沉淀物二；沉淀物二加入nacl溶液使其重新悬浮至原体积，涡旋使其分散均匀，随后水浴加热，再次涡旋后低温高速离心并收集上清液三，即上清液三中含小球藻紧密结合型胞外聚合物。

(3)、小球藻胞外聚合物的纯化与富集：

将步骤(2)中获得的三种上清液过滤，分别得到含各级胞外聚合物的滤液，取滤液进行胞外聚合物的切向流超滤-浓缩富集，收集浓缩液进行透析。

(4)将透析好的浓缩液进行真空干燥，即得到纯化的小球藻胞外聚合物固体。

所述步骤(1)小球藻置于光照培养箱中培养，培养条件：采用无菌的bg-11培养基培养，培养箱温度设置为25℃，光照强度为10000lux,黑暗：光照时间比为12h:12h。

所述步骤(2)中提取可溶性胞外聚合物的参数为：温度为4℃、离心转速为2800～3000g、离心时间为15～20min；

所述步骤(2)中提取松散结合型胞外聚合物的参数为：温度为4℃、离心力为8000～8500g、离心时间为10～15min；

所述步骤(2)中的提取紧密结合型胞外聚合物的参数为：温度为4℃、离心力为11000～12000g、离心时间为20～25min。

所述步骤(2)的nacl溶液为质量浓度0.05％的nacl溶液。

所述步骤(2)的涡旋时间均为2min。

所述步骤(2)的热浴条件为：温度55～65℃，加热时间为28～30min。

所述步骤(3)采用孔径为0.45μm的玻璃纤维滤膜进行过滤。

所述步骤(3)采用切向流超滤技术提取浓缩小球藻各级胞外聚合物。

其中，切向流超滤离心管的截留分子量为10kda,聚醚砜滤膜(eps)材质。使用切向流超滤离心管的参数为：温度4℃、离心力为4000g、离心时间为15min。切向流超滤膜包的截留分子量为5kda,聚醚砜滤膜(eps)材质。使用切向流超滤膜包的参数为：蠕动泵的转速为100～120ml/min。

所述步骤(3)最终将100ml胞外聚合物溶液浓缩为5ml浓缩液。

所述步骤(3)透析袋的截留分子量为5～6kda，透析袋置于含超纯水的1l烧杯中，在磁力搅拌器上搅拌24h，搅拌速度为120rpm/min，每隔8h换一次水。

所述步骤(4)真空浓缩仪的条件为：离心转数为2000rpm/min，冷阱温度为-45℃，离心运行时间为7h。最后真空浓缩后的胞外聚合物固体保存于-20℃。

本发明的技术进步表现如下：该方法能实现胞外聚合物的分级提取操作，从而获得具有不同有机组分及含量的小球藻胞外聚合物。从而克服胞外聚合物的分级操作条件差异大和相应的表征缺少的缺陷。同时也很好地解决了传统的分级分离胞外聚合物的方法存在操作复杂、富集困难，难以准确定量以及长期保存问题，采用不同于传统的分离方法，获得足量的分级胞外聚合物，且耗时较短，工艺流程相对比较简单。

1.通过小球藻胞外聚合物的分级提取操作及组分测定，可加深对小球藻胞外聚合物絮体结构的理解。

2.本发明提取效率较高，55～65℃热浴条件不仅能保证胞外聚合物的脱落，还能最大程度上保持小球藻细胞的完整性。

3.通过切向流超滤管浓缩，可以做到快速浓缩提取多级胞外聚合物，大大减少工作量。

附图说明

图1是本发明小球藻胞外聚合物分级提取的操作方法示意图。

图2是本发明小球藻胞外聚合物的三维荧光图：

a、b、c、d分别对应组分一、组分二、组分三、组分四；

e、f、g、h分别对应组分一、组分二、组分三、组分四；

i各层胞外聚合物的组分含量图；

j为紫外全扫描图。

图3是本发明小球藻胞外聚合物的红外光谱图。

图4是小球藻可溶性及松散结合型胞外聚合物浓度与紫外吸光光度值(od200)的标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

本发明的实施例选取小球藻，购买于中国科学院淡水水藻种库(fachb)，藻种编号为fachb-8。

方法使用的设备主要有高压灭菌锅、光照培养箱、高速离心机、细胞计数仪、磁力搅拌器、真空浓缩仪、紫外分光光度计、红外光谱仪和荧光光谱仪等。

实施例1

(1)小球藻培养

小球藻藻种(fachb-8)加入灭菌后的bg-11培养基中在光照培养箱中培养，培养温度为25℃，光照强度为10000lux，光照：黑暗时间比为12h：12h，利用细胞计数仪计算藻类的生长量。小球藻藻液的原始浓度为1.4×10⁷个/ml，属于对数生长期。

(2)小球藻可溶性及松散结合型胞外聚合物的提取

取100ml的小球藻藻液在4℃条件下以2934g离心转速离心操作15min，上清液即为s-eps粗提液；离心沉淀物一加入0.05％nacl溶液加以2min涡旋，使其重新悬浮至原体积，在4℃条件下以8000g离心力离心操作10min，上清液即为lb-eps粗提液。

(3)小球藻紧密结合型胞外聚合物的提取

取离心沉淀物二加入0.05％nacl溶液加以2min涡旋，使其重新悬浮至原体积，再将待提取藻液置于60℃恒温热水加热30min。取出后，再涡旋2min，并于4℃条件下以12000g离心力离心20min，收集的上清液即为tb-eps粗提液。

(4)胞外聚合物的纯化与富集

收集的s-eps,lb-eps,tb-eps粗提液分别经过0.45μm玻璃纤维滤膜过滤后，通过截留分子量为10kda的切向流超滤离心管进行浓缩，将100ml溶液浓缩至5ml。浓缩液经分子量为5kda的透析袋透析24h后，进行真空浓缩，获得较纯化的s-eps，lb-eps，tb-eps干燥固体粉末。

(5)三种胞外聚合物表征与分析：

对提取出三种胞外聚合物进行称重，用高纯水配制10mg/l的eps悬浮液分别用荧光分光光度计和紫外-可见分光光度计对其进行三维荧光-平行因子分析表征和uv-vis扫描(200nm-800nm)，来分析三种胞外聚合物的组分，结果见图2；通过红外光谱仪对三种胞外聚合物的表面官能团进行测定分析，结果见图3。

由图2中a、b、c和d可见，组分一(ex|em:220|350nm)是含有芳环的蛋白类荧光物质；组分二(ex|em:270|(330)550nm)中，ex|em:270|330nm是一种类蛋白质物质，ex|em:270|550nm是一种类腐殖质；组分三(ex|em:290|580nm)与类腐殖质有关；组分四(ex|em:250|500nm)也是一种类腐殖质。由图2中i可见，可溶性胞外聚合物(s-eps)中的蛋白质含量较多，紧密结合型胞外聚合物(tb-eps)含有较多的类腐殖质，松散结合型胞外聚合物(lb-eps)呈现出介于s-eps与tb-eps两者之间的性质组成。由图2中j可见，tb-eps在波长260nm附近有强烈的吸收峰，属于核酸的特征峰，这也与图2中i的组分含量结果相吻合。

由图3可知，在基团特征频率区，各层胞外聚合物均出现了νc＝o伸缩振动(1640cm^-1附近)和νn-h伸缩振动(3500cm^-1附近)，分别属于酰胺ⅰ带特征峰和酰胺ⅱ带特征峰；聚合物在1417cm^-1附近的透射峰来自苯环伸缩振动；聚合物在2916-2927cm^-1处的透射峰来自脂肪类化合物中亚甲基的c-h反对称伸缩振动。

本发明中实施例2至6其他参数同实施例1，关键参数如下表所示：

实施例7

(1)小球藻培养

小球藻藻种(fachb-8)加入灭菌后的bg-11培养基中在光照培养箱中培养，培养温度为25℃，光照强度为10000lux，光照：黑暗时间比为12h：12h，利用细胞计数仪计算藻类的生长量。小球藻藻液的原始浓度为8.7×10⁶个/ml，属于对数生长期。

(2)小球藻可溶性及松散结合型胞外聚合物的提取

取100ml的小球藻藻液在4℃条件下以2934g离心转速离心操作15min，上清液即为s-eps粗提液；离心沉淀物一加入0.05％nacl溶液加以2min涡旋，使其重新悬浮至原体积，在4℃条件下以8000g离心力离心操作15min，上清液即为lb-eps粗提液。

(3)胞外聚合物的纯化与富集

收集的s-eps,lb-eps粗提液分别经过0.45μm玻璃纤维滤膜过滤后，通过截留分子量为5kda的切向流超滤膜包进行浓缩，将100ml溶液浓缩至约5ml。浓缩液经分子量为5～6kda的透析袋透析24h后，进行真空浓缩，获得较纯化的s-eps，lb-eps干燥固体粉末。

通过紫外-可见分光光度计对小球藻可溶性及松散结合型胞外聚合物进行分析，在200nm波长下绘制标准曲线，可以对两类胞外聚合物进行对照，同时实现胞外聚合物溶液的快速定量，结果见图4。