一种智力障碍疾病相关的ATRX基因的突变位点及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种智力障碍疾病相关的atrx基因的突变位点及检测试剂盒。

背景技术：

智力障碍(intellectualdisability，id)疾病是指患者在18岁之前，认知功能和社会适应能力明显缺陷，表现为智力测试iq值小于70。id患者临床表型多样，既有表现为智力障碍，也可能伴发先天性畸形或其他神经系统异常如自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd)、癫痫等。在全球范围内，id发病率约为1～3％。据相关研究报道，一位智力障碍患者终身的医疗花费可达100万美元。id主要分为遗传因素和非遗传因素，遗传因素约占id病因2/3，可见，id的临床表型复杂且存在显著的遗传异质性。所以如果能及早地对疾病精准诊断，并及时地进行治疗康复干预，尽可能地减少智力障碍的发生。

现有研究已经发现700个以上与id相关的基因，其中包括atrx基因，但总体上看，目前关于atrx基因突变的id患者报道数量仍比较少，且主要以外显子突变为主，尚无atrx基因内含子突变的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种智力障碍疾病相关的atrx基因的突变位点及检测试剂盒，有利于推动开展该类疾病的分子诊断。

第一方面，提供了如下技术方案，包括一种突atrx基因的突变位点，所述atrx基因的突变位点导致智力障碍疾病发生，所述突变位点位于所述atrx基因的24号内含子，所述突变位点的突变信息为：c.5786+4(ivs24)a>g(nm_000489.6)。

其他优化的技术方案中，所述突变位点的基因组核苷酸序列如seqidno:1所示。

第二方面，提供了一种用于辅助诊断智力障碍疾病dna检测试剂盒，所述dna检测试剂盒用于对上述第一方面中任一方案中所述的突变位点进行检测。

在其他优化的技术方案中，所述dna检测试剂盒包括所述突变位点的扩增引物，所述突变位点的扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:3所示。

第三方面，提供了一种用于辅助诊断智力障碍疾病的mrna检测试剂盒，所述mrna检测试剂盒用于对上述第一方面中任一方案中所述的atrx基因转录的mrna进行检测。

在其他优化的技术方案中，所述mrna检测试剂盒包括所述突变atrx基因的外显子的扩增引物，所述外显子包括exon23～25，所述exon23～25的扩增引物均包括上游引物和下游引物。

在其他优化的技术方案中，所所述mrna检测试剂盒用于检测exon24的是否缺失。

在其他优化的技术方案中，所述mrna检测试剂盒用于检测exon24是否整体缺失。

在其他优化的技术方案中，所述exon23～25的上游引物的核苷酸序列如seqidno:18所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:19所示。

在其他优化的技术方案中，所述外显子还包括exon1～22和exon26～35，所述exon1～22和exon26～35的扩增引物均包括上游引物和下游引物，

所述exon1～5的上游引物的核苷酸序列如seqidno:4所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:5所示；

所述exon6～8的上游引物的核苷酸序列如seqidno:6所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:7所示；

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:8所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:9所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:26所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:27所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:28所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:29所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:30所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:31所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:32所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:33所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:34所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:35所示；或，所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:36所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:37所示；

所述exon10～12的上游引物的核苷酸序列如seqidno:10所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:11所示；

所述exon13～15的上游引物的核苷酸序列如seqidno:12所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:13所示；

所述exon16～18的上游引物的核苷酸序列如seqidno:14所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:15所示；

所述exon19～22的上游引物的核苷酸序列如seqidno:16所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:17所示；

所述exon26～29的上游引物的核苷酸序列如seqidno:20所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:21所示；

所述exon30～33的上游引物的核苷酸序列如seqidno:22所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:23所示；

所述exon34～35的上游引物的核苷酸序列如seqidno:24所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:25所示。

本发明的有益效果是：

第一方面，在本发明的技术方案中，首次发现了atrx基因中新的突变位点c.5786+4(ivs24)a>g(nm_000489.6)，该突变位点位于atrx基因的24号内含子中，丰富了atrx基因的致病突变谱。

在第二和第三方面，使用本发明提供的检测试剂盒，可以直接通过一代测序，检测第一方面中所述的突变位点及atrx基因转录所得的mrna，可用于atrx基因相关智力障碍疾病的精准诊断；相较于现有的检测技术，减少了繁琐的程序，可跳过高通量筛选，直接针对目的基因外显子全长测序，从而清楚地获知atrx基因突变及mrna转录的情况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中患儿atrx基因存在c.5786+4(ivs24)a>g半合子突变示意图；

图2为实施例1中母亲为携带者c.5786+4(ivs24)a>g杂合突变示意图；

图3为实施例1中父亲为野生型示意图；

图4为实施例2中atrx基因转录的rna标准序列和先证者序列中exon7段的对比示意图；

图5为实施例2中atrx基因转录的rna标准序列和先证者序列中exon9段的对比示意图；

图6为实施例2中atrx基因转录的rna标准序列和先证者序列中exon24段的对比示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

首先，对下述实施例中所使用的试剂、仪器、分析软件等做一说明。

1.本发明实施例中所使用的试剂来源如下：

kapa2grobμsthotstartpcrkit试剂盒购于kapabiosystems公司(货号kk551707961073001)；

dna/rna共提试剂盒盒(货号dp422)、rnalock血液rna稳定剂(货号dp440)、高效血液总rna提取试剂盒(货号dp443)和dl2000dnamarker均购于天根生化科技(北京)有限公司；

thermoscientificrevertaid第一链cdna合成试剂盒(货号k1622)购于thermofisher公司；

takarataqtm(r001a)pcr溶液相关试剂购自takara公司；

sap(1u/μl，货号70092y)、exoi(10u/μl，货号70073z)均购自usb公司；

bigdye3.1(货号4337455，thermofisherscientific公司)、hi-diformamide(货号4404307，abi公司)；去rnase酶与dnase酶水(货号10977015)，购自thermofisherscientific公司。

2.本发明实施例中所使用的仪器为：hema-9600基因扩增仪，abi3730xl基因测序仪。

3.本发明实施例中所使用的分析软件为chromas软件。

4.本发明实施例中涉及的扩增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

5.其他实验用品：agaroseregular、tris-acetate-edtabuffer(tae)50×powder(ph8.3)、6×loadingbuffer、nucleicacidgelstain、200μlep管(rnase-free)、微波炉、三角瓶、玻璃瓶、量筒、称量器、移液枪、凝胶成像系统。

实施例1：

第一步，获取样本；

收集1例患儿，男性，3岁，临床表现为运动发育迟缓，语言发育迟缓，重度智力障碍，面容异常。遗传代谢、头颅mri、脑电图、甲功未见异常，未见贫血。现患儿追声、追视引出缓慢，逗引会笑，偶会无意识发音，双手主动抓物意识欠佳，竖头稳，不会主动翻身，双下肢负重欠佳，不会扶站扶走，肌力4级，肌张力低，胃肠道功能异常。疑诊：脑性瘫痪。

所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书，获得患者及相关家属的外周血。

第二步，全基因组测序；

本实施采用全基因组测序技术，包括外周血样本采集、全基因组dna提取、dna片段化、文库构建与测序、测序结果分析等流程，针对上述智力低下患者核心家庭进行了全基因组测序，结合生物信息学分分析发现智力低下患儿atrx基因存在半合子突变c.5786+4(ivs24)a>g(nm_000489.6)，其中，c.表示编码区即外显子的序列，c.5786表示外显子区域序列第5786位；生物一般都是一个外显子一个内含子交替出现，因此，这里的+4表示，上述外显子5786后面顺次排列的24号内含子的第四位碱基发生了改变。

该突变位点的基因组核苷酸序列如seqidno:1所示。

第三步，sanger测序验证；

基于第二步的结果，采用传统pcr基础上的sanger测序分析，对atrx基因c.5786+4(ivs24)a>g半合子突变进行验证。具体实施如下：

(1)pcr引物的设计

采用oligo7软件设计特异性扩增引物，该扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示，下游引物的核苷酸序列为seqidno:3所示，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)pcr反应

以dna为模板，采用kapa2grobμsthotstartpcrkit试剂盒对实验样本进行pcr扩增。pcr反应体系为25μl，其中包括：5μl5xkapa2gbuffera/5xkapa2gbufferb/5xkapa2ggcbuffer，5μl5xkapaenhancer1，0.5μl10mmkapadntpmix，pcr扩增引物1.25μl，0.1μl5u/μlkapa2grobusthotstardnapolymerase，根据需求添加dna模板，pcr-grade水补足至25μl。

采用hema公司9600基因扩增仪进行降落pcr扩增，pcr反应条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15-60s/kb，循环次数30-40次；最后，72℃终延伸1min/kb。

(3)pcr产物纯化

pcr纯化体系为20μl，其中包括：pcr产物8μl，1u/μlsap酶1μl，10u/μlexoi酶1μl，去rnase与dnase水10μl。

(4)sanger测序反应

dna测序反应的体系为10μl，包括4μlbigdye，3.2pmol/l测序引物2μl，5～20ng纯化的pcr物，用去rnase与dnase水补足至10μl。

反应条件为：96℃10s，50℃5s，60℃4min，共28个循环反应。

pcr循环完并冷却到4℃，取下并马上进行短时间离心。

上述测序反应结束后将反应产物中加入2.5μl0.125m的edta溶液，然后加入30μl无水乙醇，颠倒混匀后室温放置15min。在12000g离心10min后，移除上清。加入60μl体积百分比浓度为70％的乙醇溶液，4℃12000g离心15min后，移除上清，重复一次后，待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlhi-di甲酰胺。

95℃变性4min后采用abi3130xl测序仪进行测序分析。

(5)测序结果分析

测序结果ab1文件可用chromas软件打开，与atrx基因参考序列进行比对。

(6)实验结果

全基因组测序与sanger测序验证结果一致，证明患儿atrx基因存在c.5786+4(ivs24)a>g半合子突变，如附图1所示，该突变后的基因组核苷酸序列如seqidno.1所示；母亲为携带者c.5786+4(ivs24)a>g杂合突变如附图2所示，父亲为野生型如附图3所示。

实施例2

本实施例提供了一种用于辅助诊断智力障碍疾病dna检测试剂盒与mrna检测试剂盒。

其中，该dna检测试剂盒包括实施例1中的atrx基因突变位点的扩增引物，该突变位点的扩增引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示，下游引物的核苷酸序列为seqidno:3所示，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

上述dna检测试剂盒还包括pcr试剂、pcr产物纯化试剂、sanger测序试剂。

其中，pcr试剂为kapa2grobμsthotstartpcrkit试剂盒，包括：5xkapa2gbuffera/5xkapa2gbufferb/5xkapa2ggcbuffer，5xkapaenhancer1，10mmkapadntpmix，5u/μlkapa2grobusthotstardnapolymerase，pcr-gradewater。pcr体系中各组分的工作浓度为：1xkapa2gbuffera/1xkapa2gbufferb/1xkapa2ggcbuffer，1xkapaenhancer1，0.2mmkapadntpmix，pcr扩增上下游引物各0.5μm，0.5u/μlkapa2grobusthotstardnapolymerase，可根据需求添加dna模板。

pcr产物纯化试剂包括：1u/μlsap酶，10u/μlexoi酶，去rnase与dnase水。pcr产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05u/μlsap酶，0.5u/μlexoi酶；pcr产物与pcr纯化体系的体积比为2:5。

sanger测序试剂包括：bigdye3.1混合液、0.125medta溶液、无水乙醇、体积百分比为75％的乙醇溶液，去rnase与dnase水、hi-di甲酰胺溶液。sanger测序体系中各组分的工作浓度为：bigdye混合液1×，测序引物浓度为0.64pmol/l，样品0.5～2ng/μl。

该mrna检测试剂盒包括实施例1中的突变atrx基因各个外显子的扩增引物，包括外显子exon1～35，该exon1～35的扩增引物均包括上游引物和下游引物，其中，在本实施例中：

所述exon1～5的上游引物的核苷酸序列如seqidno:4所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:5所示；

所述exon6～8的上游引物的核苷酸序列如seqidno:6所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:7所示；

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:8所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:9所示；

所述exon10～12的上游引物的核苷酸序列如seqidno:10所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:11所示；

所述exon13～15的上游引物的核苷酸序列如seqidno:12所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:13所示；

所述exon16～18的上游引物的核苷酸序列如seqidno:14所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:15所示；

所述exon19～22的上游引物的核苷酸序列如seqidno:16所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:17所示；

所述exon23～25的上游引物的核苷酸序列如seqidno:18所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:19所示；

所述exon26～29的上游引物的核苷酸序列如seqidno:20所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:21所示；

所述exon30～33的上游引物的核苷酸序列如seqidno:22所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:23所示；

所述exon34～35的上游引物的核苷酸序列如seqidno:24所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:25所示。

在其他优选的实施例中，上述exon9的扩增引物也可以使用以下任一方案替代：

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:26所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:27所示；或，

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:28所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:29所示；或，

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:30所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:31所示；或，

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:32所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:33所示；或，

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:34所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:35所示；或，

所述exon9的上游引物的核苷酸序列如seqidno:36所示，所述下游引物的核苷酸序列为seqidno:37所示。

接下来，说明atrx基因的mrna序列的检测过程。

准备工作：配制琼脂糖凝胶；

1)清洗2个1l玻璃瓶，100ml三角瓶，100ml和1l玻璃量筒，烘干备用。

1)50×tae母液：将tris-acetate-edtabuffer(tae)50×powder干粉倒进1l玻璃

瓶中，加入1l超纯水，混匀后做好标记。

2)1×tae溶液：量取20ml50×tae母液于1l玻璃量筒中，并用超纯水定容至1l，倒入新的1l玻璃瓶中，混匀后做好标记。

3)6×loadingbuffer中加入0.5μlnucleicacidgelstain，涡旋混匀后做好标记。

4)制胶：平衡好制胶板，插好梳子后，称取agaroseregular0.8g于三角瓶中，加入1×tae溶液80ml，微波炉打热完全溶解后倒入制胶板中。

正式实验部分：

第一步，在edta抗凝血样本和正常对照的抗凝血样本中提前加入rnalock血液rna稳定剂(货号dp440，天根生化科技(北京)有限公司)；

第二步，采用高效血液总rna提取试剂盒(货号dp443，天根生化科技(北京)有限公司)分别提取实验样本和正常对照样本的rna，具体方法如下：

1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液h(例如待处理的血液样品体积为200μl，则取140μl10×红细胞裂解液h)，用rnase-freeddh2o稀释至1×红细胞裂解液h。

2)向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液h(需自备合适的干净管子)。

注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液h的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液h的使用体积也要进行相应调整。

3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。

4)4℃2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。

5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液h(加入1×红细胞裂解液h的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。

6)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除。

注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的rna与膜的结合，导致最后rna产率降低。

7)向白细胞沉淀中加入裂解液rlh(使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表进行，涡旋或使用移液器混匀。

注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液rlh的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。

裂解液rlh(μl)健康人类全血(ml)白细胞数量

350多至0.5多至2×106

6000.5-1.52×106至1×107

8)将溶液转移至过滤柱cs中(过滤柱cs放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃去过滤柱cs，收集滤液。

注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。

9)向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350或600μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr4中(吸附柱cr4放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr4放回收集管中。

注意：配制70％乙醇时请使用rnase-freeddh2o，如果滤液体积有所损失，请相应减少70％乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱cr4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。

10)如果不进行dnasei消化，可以直接向吸附柱cr4中加入700μl去蛋白液rw1h(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。dnasei消化：向吸附柱cr4中加入350μl去蛋白液rw1h，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr4放回收集管中。

11)dnasei工作液的配制：取10μldnasei储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μlrdd溶液，轻柔混匀。

12)向吸附柱cr4中央加入80μl的dnasei工作液，室温放置15min。

13)向吸附柱cr4中加入350μl去蛋白液rw1h，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr4放回收集管中。

14)向吸附柱cr4中加入500μl漂洗液rw(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr4放回收集管中。

15)重复步骤14。

16)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr4置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：离心后将吸附柱cr4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。

17)将吸附柱cr4转入一个新的rnase-free离心管中，加入30-50μlrnase-freeddh2o室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到rna溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna溶液请于-70℃保存。

第三步，将rna反转录为cdna，操作方法如下：

1)将0.1ng-5μg的rna和1μl的oligo(dt)prime加入到冰浴过的无菌无核酸酶的离心管中，用无核酸酶水补足至12μl。轻轻混合，短暂离心，并在65℃孵育5min，存储与冰中。

2)依次加入4μl5xreactionbuffer、1μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)、2μl10mmdntpmix、1μlrevertaidm-mulvrt(200u/μl)至总体积为20μl。

3)轻轻混匀，短暂离心。在42℃孵育60min后70℃加热5min进行终止反应，获得cdna产物。

第四步，设计目标基因引物；

采用oligo7软件设计atrx基因的上述各个外显子的特异性引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

第五步，目标基因扩增；

以cdna为模板，采用kapa2grobμsthotstartpcrkit试剂盒分别对实验样本和正常人对照样本的指定目标区域进行pcr扩增。pcr反应体系为25μl，其中包括：5μl5xkapa2gbuffera/5xkapa2gbufferb/5xkapa2ggcbuffer，5μl5xkapaenhancer1，0.5μl10mmkapadntpmix，pcr扩增引物1.25μl，0.1μl5u/μlkapa2grobusthotstardnapolymerase，根据需求添加dna模板，pcr-grade水补足至25μl。

采用hema公司9600基因扩增仪进行降落pcr扩增，pcr反应条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15-60s/kb，循环次数30-40次；最后，72℃终延伸1min/kb。

第六步，电泳；

将制好的琼脂糖凝胶放入电泳仪中，吸取步骤(5)中pcr反应液2μl，与3μl6×loadingbuffer混匀后点进孔中，最后点marker。120v，20min。

第七步，看胶；

将跑好的胶放入凝胶成像系统中，打开紫外后观察凝胶，出现特异性扩增产物。

第八步，sanger测序反应；

sanger测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

第九步，测序结果分析；

测序结果ab1文件可用chromas软件打开，与atrx基因参考序列进行比对。

atrx的mrna测序结果及比对如下：

发明人发现正常人和患者的atrx基因的mrna都存在exon7缺失(aga)如图4；

exon9缺失(attaaatcaaaaactacagctaaagtaacaaaagaattatatgttaaactcactcctgtttccctttctaattccccaattaaaggt)，如图5；

但是，只在患儿的atrx基因的mrna存在exon24整个外显子缺失，如图6。

一般内含子的突变不会对外显子造成影响，但是在本实施例中，在仅改变atrx基因位于24号内含子上的碱基的前提下，即导致了dna转录成mrna的时候，整个24号外显子缺失了，可见，正是该处内含子的突变，引起了外显子转录的异常发生，从而引发了智力障碍疾病。

atrx基因突变导致的疾病有三种，分别是智力障碍-低张力面容综合征，x-连锁，1型(mrxhf1)、α地中海贫血伴骨髓增生异常综合征、α地中海贫血伴智力障碍综合征。根据临床表型，该患者atrx基因突变导致的疾病为智力障碍-低张力面容综合征，x-连锁，1型(mrxhf1)；mrxhf1的临床表型有进行性智力障碍，婴儿肌张力低下，面容异常，隐睾，阴囊发育不全，尿道下裂，先天性小阴茎，膀胱输尿管反流，肾发育不全，性腺功能减退，阵发性爆发性笑声，多动，短指综合征，锥形手指，细手指，癫痫发作，反射亢进，仰趾外翻足，呕吐，便秘，胃食管反流，流涎，脊柱后侧凸，膝外翻，身材矮小，鼻梁凹陷，人中发育不全，下肢肌张力高，小耳畸形等。

在本实施例中，患儿尚未表现出疾病的全部表型，这是由于疾病遗传存在异质性。

与正常对照相比，患儿mrna检测结果表明，患儿atrx基因c.5786+4(ivs24)a>g半合子突变，形成异常mrna，进而影响蛋白质翻译，产生异常蛋白质，从而无法发挥正常的atrx蛋白质功能。atrx蛋白质是一种atrx蛋白为酵母交换型转换/蔗糖不发酵(yeastswitchinmatingtype/sucrosenonfermentation，swi/snf)家族成员之一，作为atp依赖性染色质重塑因子，其在基因表达、dna修复、复制、重组、维持端粒完整性等过程中发挥重要作用。因此突变会导致神经前体细胞的有丝分裂缺陷，影响染色体分离的准确性，可导致细胞凋亡增加使脑组织(大脑皮质、海马等)神经元数目减少和前脑体积减小，从而影响智力的发育。

综上可见，本发明首次发现了atrx基因的一个半合子c.5786+4(ivs24)a>g(nm_000489.6)以及由该突变产生的异常mrna表达，明确了该突变致病性，揭示了该突变引起智力障碍的发病机制，同时丰富了atrx基因的致病突变谱，明确了基因型与表型之间的相互关系，可以用于临床诊断与基础研究。同时设计出直接检测该突变位点及atrx基因mrna检测试剂盒，可用于atrx基因相关智力障碍疾病的辅助检测与分子诊断。

具体的，如本实施例提供的检测试剂盒，其可以直接通过一代测序，减少繁琐程序，跳过高通量筛选，直接针对目的基因外显子全长测序，能清楚知道外显子的情况。其中，所提供的引物设计，pcr扩增加上一代测序对基因外显子突变进行检测，操作简单，技术成熟，成本极低，不受突变大小(20bp)影响，可对外显子纯合缺失及大片断缺失插入进行检测，且该试剂盒实用范围广，所检测的dna可以提取自新鲜组织、外周血以及石蜡切片样本。

实施例3

本实施例提供一种mrna，该mrna是由实施例1中的突变atrx基因转录所得，该mrna存在如上述实施例2中提及的exon7、exon9和exon24的缺失；

其中，exon7缺失(aga)；

exon9缺失

(attaaatcaaaaactacagctaaagtaacaaaagaattatatgttaaactcactcctgtttccctttctaattccccaattaaaggt)；

exon24缺失整个外显子。

实验验证了atrx基因内含子突变产生异常mrna，明确了该突变的致病性，揭示了该突变引起智力障碍的发病机制。

接下来，在此附上上述实施例1～3中涉及到扩增引物的核苷酸序列以及对应获得的扩增产物的长度如下表所示：

最后需要说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>义乌市妇幼保健院

<120>一种智力障碍疾病相关的突变atrx基因的突变位点及检测试剂盒

<160>37

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