一种复制缺陷型犬细小病毒包装载体、复制缺陷型重组犬细小病毒及制备与应用

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种复制缺陷型犬细小病毒包装载体、复制缺陷型重组犬细小病毒及制备与应用。

背景技术：

犬细小病毒2型(canineparvovirustype2，cpv-2)可引起犬科动物病毒性肠炎，以出血性肠炎和心肌炎为特征的高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率，其中幼犬更易感。该病于上个世纪八十年代开始在我国暴发流行，给我国犬科动物造成极大的威胁。目前虽有疫苗用于犬病毒性肠炎的预防，但在动物养殖中该病仍较为多发，严重危害犬科动物健康。

反向遗传技术是一种从生物的遗传物质入手，通过对其进行直接改造来研究基因的功能，阐释生命发生的本质规律和现象的方法。它是开展病毒学研究有效的分子生物学手段，在阐明病毒致病机制和疫苗的研制中发挥着重要的作用。目前有很多dna病毒反向遗传操作平台都已经建立，如圆环病毒、疱疹病毒和腺病毒等。利用反向遗传技术构建cpv-2感染性克隆，使得在病毒的任意位点引入突变成为可能，方便对病毒的致病机制进行更加精细、准确的研究，从而在基因层面上对该病毒有更为深入的研究和了解，同时也是研制cpv-2疫苗的一个有效途径。cpv-2基因组为单股dna链，约5200nt，其包含两个开放阅读框：靠近病毒核酸3’端的开放阅读框，编码dna转录与复制所需要的非结构蛋白ns1和ns2；靠近基因组5’端的开放阅读框，编码病毒的结构蛋白如衣壳蛋白vp1和vp2，两个开放阅读框均处在同一dna链上，而结构蛋白和非结构蛋白均由1条mrna分子通过不同起始位点翻译并经过不同的剪切方式产生。cpv-2基因组两端各有一个反向末端重复序列(invertedterminalrepeat,itr)，3’端itr长约120nt，为一个“y”型的发夹结构，5’端itr长约190nt，形成“u”型发夹结构。两端的itr结构很难通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)获得，也很难克隆至质粒载体上。它的存在严重影响了cpv-2全基因组的克隆和反向遗传学操作平台的建立。但是itr对于病毒复制和包装很重要，利用反向遗传操作系统拯救病毒时必须保留itr完整的二级结构。所以，构建cpv-2反向遗传操作系统的关键是如何在克隆病毒基因组时保留其两端的itr序列。

目前，基于cpv-2基因组全长的感染性克隆的构建已有文献报道，早期构建cpv-2感染性克隆时，需纯化病毒，获得cpv-2复制型(replicative-form，rf)dna中间体，并通过复杂的酶切连接的方式构建(m.horiuchietal.,archivesofvirology,1993,130:227-236)，技术难度较大。随着dna合成技术的发展，近年来，已有研究人员通过人工合成itr以及无缝连接的方法构建成功了cpv-2全长感染性克隆(yuetal.,virusgenes,2017,53:876-882)。虽然现在已有技术方法虽然能够构建出cpv-2的感染性克隆，拯救出重组的活病毒，但迄今该病毒未被用作载体来表达外源基因。其原因主要是cpv-2的基因组较小，基因表达调控的元件紧凑，很难找到位置插入外源基因。另一方面，cpv-2的病毒粒子较小，其衣壳无法容纳超过5500nt的基因组片段，这就意味着如果要在原来病毒基因组的基础上再插入外源基因，那么外源基因的大小需要限制在500nt左右，这大大限制了cpv-2病毒载体在疫苗领域的实际应用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体。

本发明的另一目的在于提供上述复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种复制缺陷型重组犬细小病毒。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体，包括载体itr质粒和辅助质粒，其中，载体itr质粒包含核心元件itr-p-egfp-ts-itr，其核苷酸序列如seqidno.1所示，辅助质粒包含核心蛋白基因ns-vp，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述的载体itr质粒和辅助质粒的起始载体可以为质粒载体(如pbluescriptiisk(+)等)或者病毒载体(如腺病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体等)；

所述的载体itr质粒的起始载体可以为pbluescriptiisk(+)；

所述的辅助质粒的起始载体可以为pbluescriptiisk(+)；

所述的载体itr质粒优选为将核心元件itr-p-egfp-ts-itr插入到起始载体中得到；

所述的辅助质粒优选为将核心蛋白基因ns-vp插入到起始载体中得到；

所述的复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体，包括载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr和辅助质粒pcpv-ns-vp，其中载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr是将核心元件itr-p-egfp-ts-itr插入到pbluescriptiisk(+)中得到，辅助质粒pcpv-ns-vp是将核心蛋白基因ns-vp插入到pbluescriptiisk(+)中得到；

所述的载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr的制备方法，包含如下步骤：

(1)将犬细小病毒3’端itr、多克隆位点区和犬细小病毒5’端itr序列依次连接并基因合成，然后将其通过酶切位点插入到起始载体pbluescriptiisk(+)中，得到pbluescript-itr；

(2)以质粒pcdna3.1为模板，利用引物promoter-f和promoter-r进行pcr扩增，得到cmv增强子和启动子片段；然后将其通过酶切位点插入到pbluescript-itr中，得到pitr-p-itr；

(3)以pcdna3.1为模板，利用引物ts-f和ts-r进行pcr扩增，得到ts(转录终止)片段；然后将其通过酶切位点插入到pitr-p-itr中，得到pitr-p-ts-itr；

(4)以pcdna3.1-egfp为模板，利用引物itr-egfp-f和itr-egfp-r进行pcr扩增，得到egfp片段；然后将其通过酶切位点插入到pitr-p-ts-itr中，得到载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr；

所述的辅助质粒pcpv-ns-vp的制备方法，包含如下步骤：

以犬细小病毒感染f81猫肾细胞48h后提取的dna为模板，采用引物cpv2-nsvp-f和cpv2-nsvp-r进行pcr扩增，得到ns-vp基因片段；然后将其通过酶切位点插入到pbluescript-itr中，得到辅助质粒pcpv-ns-vp；

所述的复制缺陷型犬细小病毒(cpv-2)包装载体在制备犬用疫苗中的应用；

一种复制缺陷型重组犬细小病毒，由上述复制缺陷型犬细小病毒包装载体共同转染动物细胞得到；

所述的复制缺陷型重组犬细小病毒的制备方法，包含如下步骤：

(1)采用含10％fbs的dmem培养动物细胞至汇合度为70～80％；

(2)将opti-memmedium、lipofectamine3000reagent混合，得到溶液a；将opti-memmedium、p3000reagent、复制缺陷型犬细小病毒包装载体混合，得到溶液b；按照体积比1:1的比例将溶液b加入到溶液a中，混匀后得到脂质体/dna混合物并静置15min；

(3)弃去步骤(1)中培养基，更换为不含抗生素的无血清dmem培养基，逐滴加入步骤(2)静置后的脂质体/dna混合物，混匀；转染成功后，裂解细胞，离心，收集细胞上清即为复制缺陷型重组犬细小病毒；

所述的步骤(2)中复制缺陷型犬细小病毒包装载体中载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr和辅助质粒pcpv-ns-vp的质量比为80:47；

所述的复制缺陷型重组犬细小病毒在制备犬用疫苗中的应用；

本发明的原理：

本发明将cpv-2病毒基因组的基因和元件序列拆分，分别构建到两个质粒上，其中含itr序列的质粒中可以插入和表达外源基因，它和辅助质粒pcpv-ns-vp共同转染细胞后，pcpv-ns-vp表达出的蛋白可以形成病毒衣壳，将itr和外源基因包装在一起，最后包装出的重组病毒只能感染一次细胞，能够将外源基因转导入被感染的细胞中进行表达，但是不会形成子代病毒，所以很安全。因此该重组病毒可以作为一种复制缺陷型的病毒载体应用于疫苗的研制。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)为了解决上述cpv-2病毒载体难以插入外源基因的应用瓶颈，本发明将cpv基因组中约4700nt的ns和vp蛋白的基因表达区替换成只有1700nt左右的cmv增强子和启动子、外源基因egfp和终止序列，同时保留cpv-2基因组两端的itr区作为包装元件，获得的重组质粒与表达病毒ns和vp蛋白的辅助质粒共同转染细胞，成功拯救包装出复制缺陷型的cpv-2病毒。

(2)本发明获得的重组病毒基因组内部含有多克隆位点，可方便地插入外源基因，也可将其他外源基因直接替换掉egfp基因；在复制缺陷型的cpv-2病毒基因内部可插入基因片段大小可达4200nt，能够满足大多数外源基因的需要，可作为一种病毒载体使用。

(3)本发明提供了一种适用性非常广的cpv-2重组病毒载体，为犬用新型疫苗的研制奠定重要基础。

(4)cpv-2是一种肠道感染病毒，本发明获得的复制缺陷型的cpv-2重组病毒作为病毒载体有望开发出一种可以口服免疫的疫苗；而且该重组病毒是一种复制缺陷型病毒，只能一次感染，既能转导入外源基因进行表达，又不会复制出子代病毒，具有很高的安全性。

(5)本发明中载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr和辅助质粒pcpv-ns-vp中的核心元件和核心蛋白基因组合十分重要，将它们组装到其他质粒载体或者病毒载体如腺病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体等，都有可能替代本方案，序列的微弱差异也可能达到相同的效果。

附图说明

图1是载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr的构建示意图。

图2是辅助质粒pcpv-ns-vp的构建示意图。

图3是载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr转染f81猫肾细胞的免疫荧光检测(×100)结果图。

图4是辅助质粒pcpv-ns-vp转染细胞后的免疫荧光检测(×100)结果图。

图5是辅助质粒pcpv-ns-vp转染f81猫肾细胞后的western-blot检测结果图，其中，m：蛋白质marker；1：重组质粒pcpv-ns-vp感染细胞；2：cpv-bm感染细胞；3：正常细胞。

图6是载体itr质粒和辅助质粒共转染细胞的上清感染细胞的结果图，其中，a：载体itr质粒和辅助质粒共转染细胞的上清；b：未转染细胞上清。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的核心是要利用质粒dna包装出复制缺陷型cpv-2重组病毒，所以首先要构建2种质粒：载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr和辅助质粒pcpv-ns-vp，其构建方法可分别见图1和图2。

实施例1载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr的构建方法

(1)提取从广州地区分离的犬细小病毒newcpv-2a亚型毒株cpv-bm(钱鹏.广州地区犬、猫细小病毒的分离鉴定、遗传进化分析及taqman探针荧光定量方法的建立[d].华南农业大学,2018.)的dna，将获得的dna样品送至华大基因科技有限公司进行全基因组测序及拼接；从全基因组中获得基因组两端的itr序列，其中3’端itr和5’端itr序列如下所示，在两者中间加入多克隆位点区：ctcgaggggcccgcggccgcggatcc；将序列交由金唯智生物科技有限公司进行人工合成，两端分别加入酶切位点kpni和saci，插入质粒pbluescriptiisk(+)(质粒由金唯智生物科技有限公司提供)中，构建得到重组质粒pbluescript-itr；

3’端itr的核苷酸序列：

attctttagaaccaactgaccaagttcacgtacgtatgacgtgatgacgcgcgctgcgcgcgctgcctacggcagtcacacgtcatacgtacgctccttggtcagttggttctaaagaatgataggcggtttgtgtgtttaaacttgggcgggaaaagg；

5’端itr的核苷酸序列：

ccttaccataagtatcaatctgtctttaaggggggggtgggtgggagatgcacaacatcagtagactgactggcctggttggttgcgcttaatcaaccagaccgctatgcggtctggttgattaagcagagcaaccaaccaggccagtcagtctactgatgttgtgcatctcccacccaccccccccttaaagacagattga；

(2)以质粒pcdna3.1(购于天一辉远生物科技有限公司)为模板，利用引物promoter-f和promoter-r进行cmv增强子和启动子片段的pcr扩增，反应体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntps5μl，20μm引物各1μl，dna模板1μl，kod高保真酶(购于东洋纺生物科技有限公司)1μl，ddh2o36μl；pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸30s，32个循环；68℃终延伸5min；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后切下胶上约700bp的特异条带，利用胶回收试剂盒回收扩增产物片段，将其与上述pbluescript-itr质粒分别用xhoi、bamhi核酸限制性内切酶进行酶切处理，之后再进行琼脂糖凝胶电泳和切胶回收；利用t4dna连接酶将纯化获得的cmv增强子和启动子、pbluescript-itr的酶切片段在16℃进行连接；将连接产物转化至dh5α感受态细胞中，涂在含氨苄抗性lb平板，12小时后从平板上挑取可疑的单菌落，接种于含氨苄抗性的lb液体培养基中，置于37℃，200r/min恒温振荡培养箱中，培养12～16h后，以菌液作为模板进行菌液pcr鉴定，阳性菌送至测序公司进行测序确认，确认测序正确后得到重组质粒命名为pitr-p-itr；引物promoter-f和promoter-r的核苷酸序列如下所示：

引物promoter-f：ccgctcgagtacgcgttgacattgattattg；

引物promoter-r：cgggatccgagctcggtaccaa；

(3)以质粒pcdna3.1(购于天一辉远生物科技有限公司)为模板，利用引物ts-f和ts-r进行转录终止序列(ts)的pcr扩增，反应体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntps5μl，20μm引物各1μl，dna模板1μl，kod高保真酶1μl，ddh2o36μl；pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸15s，32个循环；68℃终延伸5min；pcr产物电泳后得到约300bp的条带，产物电泳、回收同步骤(2)；将得到的ts片段与上述重组质粒pitr-p-itr分别用hindiii、bamhi核酸限制性内切酶进行酶切处理；之后的酶切产物电泳、回收以及连接、转化、阳性克隆筛选同步骤(2)；阳性菌送至测序公司进行测序确认，确认测序正确后得到重组质粒命名为pitr-p-ts-itr；其中，引物ts-f和ts-r的核苷酸序列如下所示：

引物ts-f：ccccggaattccgtctagagggcccgtttaaacc；

引物ts-r：cgtttccgcctcagaagccatag；

(4)以pcdna3.1-egfp(购于天一辉远生物科技有限公司)为模板，利用引物itr-egfp-f和itr-egfp-r进行绿色荧光蛋白基因egfp的pcr扩增，反应体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntps5μl，20μm引物各1μl，dna模板1μl，kod酶1μl，ddh2o36μl；pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸25s，32个循环；68℃终延伸5min；pcr产物电泳后得到约700bp的条带，产物电泳、回收同步骤(2)；将得到的egfp片段与上述重组质粒pitr-p-ts-itr分别用hindiii、ecori核酸限制性内切酶进行处理；之后的酶切产物电泳、回收以及连接、转化、阳性克隆筛选同步骤(2)；阳性菌送至测序公司进行测序确认，确认测序正确后得到重组质粒命名为pitr-p-egfp-ts-itr(图1)，其中，引物itr-egfp-f、itr-egfp-r和重组载体的核心元件itr-p-egfp-ts-itr的核苷酸序列如下所示：

引物itr-egfp-f：cccaagcttgccaccatggtgagcaagg；

引物itr-egfp-r：cgttacttgtacagctcgtccatgc；

itr-p-egfp-ts-itr的核苷酸序列(2094bp)：

其中，划线部分为3’端itr，双划线部分为5’端itr序列，虚下划线部分为cmv增强子和启动子序列，虚下划线+加粗部分为egfp序列，波浪线为转录终止序列；

实施例2辅助质粒pcpv-ns-vp的构建方法

以犬细小病毒newcpv-2a亚型毒株cpv-bm感染f81猫肾细胞(购于武汉普诺赛生命科技有限公司)48h后提取的dna为模板，利用引物cpv2-nsvp-f和cpv2-nsvp-r进行ns-vp基因的pcr扩增，pcr反应体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntps7μl，20μm引物各1μl，dna模板1μl，kod高保真酶1μl，ddh2o34μl；pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min30s，32个循环；68℃终延伸5min；pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后切下胶上约4700bp的特异条带，利用胶回收试剂盒回收扩增产物片段，将其与质粒pbluescriptiisk(+)(购于金唯智生物科技有限公司)分别用xhoi、bamhi核酸限制性内切酶进行酶切处理，之后再进行琼脂糖凝胶电泳和切胶回收；利用t4dna连接酶将纯化获得的ns-vp基因和质粒pbluescriptiisk(+)的酶切片段在16℃进行连接；将连接产物转化至dh5α感受态细胞中，涂在含氨苄抗性lb平板，12小时后从平板上挑取可疑的单菌落，接种于含氨苄抗性的lb液体培养基中，置于37℃，200r/min恒温振荡培养箱中，培养12～16h后，以菌液作为模板进行菌液pcr鉴定，阳性菌送至测序公司进行测序确认，得到的重组质粒命名为pcpv-ns-vp(图2)，其中，引物cpv2-nsvp-f、cpv2-nsvp-r和插入载体的核心蛋白基因ns-vp的核苷酸序列如下所示：

引物cpv2-nsvp-f：ccgctcgagtggcgggctaattgtgg；

引物cpv2-nsvp-r：cgttagttcaccttatagacagtatacg；

ns-vp的核苷酸序列(4707bp)：

ctcgagtggcgggctaattgtgggcgtggttaaaggtataaaagacaaaccatagaccgttactgacattcgcttcttgtctttgacagagtgaacctctcttactttgactaaccatgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggttaaagaaacatgcagaaaatgaagcattttcgtttgtttttaaatgtgacaacgtccaactaaatggaaaggatgttcgctggaacaactataccaaaccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagcacaaacagcaatggatcaaaccgaagaagaagaaatggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaaagcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtctttttgaagtctttgtttctaaaaatatagaaccaaatgaatgcgtttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaaggctggcattgtcatgttttacttcatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaatatgtattggagtcgatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaagattaagctcagagaaattgcagaagatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggttcattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtggctattttttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacaaattgtcagcacactttacactgaacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaagcgcgggagaattcaaactaaaaaggaagtgtcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagagtaacatcacctgaagactggatgatgttacaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggaggtgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgtactttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaattaatacttgaaaaagcagataatactaaactaactaactttgatcttgcaaattctagaacatgtcaaatttttagaatgcacggatggaattggattaaagtttgtcacgctatagcatgtgttttaaatagacaaggtggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctatcattgctcaagccatagcacaagctgtgggtaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgactgtaccaataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcaatttaaagcaatttgttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggtaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaattatgacaactaatgaaaatataacaattgtgagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaataagagacagaatgttgaacatcaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaagaagaatggcctttaatatgtgcatggttagttaaacatggttatgaatcaaccatggctaactatacacatcattggggaaaagtaccagaatgggatgaaaactgggcggagcctaaaatacaaaaaggtataaattcaccaggttgcaaagacttagagacgcaagcggcaagcaatcctcagagtcaagaccaagttctaactcctctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtactccagatacgcctattgcagaaactgcaaagcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcgagtccaacgtggtccgaaatagaggcagacctgagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagacgacttggattaaggtacgatggcacctccggcaaagagagccaggagaggtaagggtgtgttagtaaggtggggggaggggaaagatttgataacttaactaagtatgtgttttttttataggacttgtgcctccaggttataaatatcttgggcctgggaacagtcttgaccaaggagaaccaactaacccttctgacgccgctgcaaaagaacacgacgaagcttacgctgcttatcttcgctctggtaaaaacccatacttatatttctcgccagcagatcaacgctttatagatcaaactaaggacgctaaagattggggggggaaaataggacattatttttttagagctaaaaaggcaattgctccagtattaactgatacaccagatcatccatcaacatcaagaccaacaaaaccaactaaaagaagtaaaccaccacctcatattttcatcaatcttgcaaaaaaaaaaaaagccggtgcaggacaagtaaaaagagacaatcttgcaccaatgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcagcctgctgtcagaaatgaaagagctacaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatttctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaaatcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattatagaagagtggttgtaaataatttggataaaactgcagttaacggaaacatggctttagatgatacccatgcacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttggtttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagttttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagccaccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaataatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatggaaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaataccatctcatactggaactagtggcacaccaacaaatatataccatggtacagatccagatgatgttcaattttacactattgaaaattctgtgccagtacacttactaagaacaggtgatgaatttgctacaggaacattttattttgattgtaaaccatgtagactaacacacacatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaagctgaaggaggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatgggaaatacaaacattattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatagtgcaccatattattcttttgaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctattgcagcaggacgggggggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaagatatgcatttggtagacaacatggtcaaaaaactaccacaacaggagaaacacctgagagatttacatatatagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggattcaaaatattaactttaaccttcctgtaacaaatgataatgtattgctaccaacagatccaattggaggtaaagcaggaattaactatactaatatatttaatacttatggtcctttaactgcattaaataatgtaccaccagtttatccaaatggtcaaatttgggataaagaatttgatactgacttaaaaccaagacttcatgtaaatgcaccatttgtttgtcaaaataattgtcctggtcaattatttgtaaaagttgcgcctaatttaacaaatgaatatgatcctgatgcatctgctaatatgtcaagaattgtaacttactcagatttttggtggaaaggtaaattagtatttaaagctaaactaagagcctctcatacttggaatccaattcaacaaatgagtattaatgtagataaccaatttaactatgtaccaagtaatattggaggtatgaaaattgtatatgaaaaatctcaactagcacctagaaaattatactaacatacttactatgtttttatgtttattacatattattttaagattaattaaattacagcatagaaatattgtacttgtatttgatataggatttagaaggtttgttatatggtatacaataactgtaagaaatagaagaacatttagatcatagttagtagtttgttttataaaatgtattgtaaaccattaatgtatgttgttatggtgtgggtggttggttggtttgcccttagaatatgttaaggaccaaaaaaatcaataaaagacatttaaaactaaatggcctcgtatactgtctataaggtgaactaaggatcc

实施例3载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr转染细胞实验

将实施例1制得的载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr转染至f81猫肾细胞进行绿色荧光蛋白(egfp)表达分析，细胞瞬时转染具体步骤如下：

①f81猫肾细胞铺板：用5ml含10％(v/v)胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的dmem吹散f81猫肾细胞，取细胞450μl/孔，待细胞生长至汇合度为70～80％时进行转染；

②进行转染时，在加入脂质体/dna混合物之前的短时间内，更换1ml不含抗生素的无血清dmem培养基；

③配溶液a(opti-memmedium62.5μl、lipofectamine3000reagent2.8125μl)和溶液b(opti-memmedium62.5μl、p3000reagent2.5μl、质粒pitr-p-egfp-ts-itr1.25μg)；其中，opti-memmedium、lipofectamine3000reagent、p3000reagent等购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

④按照体积比1:1的比例将溶液b加入到溶液a，混匀，室温静置15min；

⑤在保留原来培养基的前提下，逐滴加入125μl脂质体/dna混合物，边加边轻摇培养板；

⑥放入二氧化碳细胞培养箱，孵育6h后，弃去转染培养基，加入1ml含10％fbs的dmem培养基，之后每隔6小时在倒置荧光显微镜下观察。

结果见图3，载体itr质粒pitr-p-egfp-ts-itr转染f81细胞(12h和24h)后能够观察到明显的绿色荧光，说明该重组质粒的真核cmv启动子能够发挥正常功能，且成功表达了egfp。

实施例4辅助质粒pcpv-ns-vp的蛋白表达分析

将实施例2制得的辅助质粒pcpv-ns-vp转染至f81猫肾细胞进行蛋白表达分析，具体步骤如下：

(1)细胞瞬时转染

①f81猫肾细胞铺板：用5ml含10％fbs的dmem吹散f81猫肾细胞，取细胞450μl/孔，待细胞生长至汇合度为70～80％时进行转染；

②进行转染时，在加入脂质体/dna混合物之前的短时间内，更换1ml不含抗生素的无血清dmem培养基；

③配溶液a(opti-memmedium62.5μl、lipofectamine3000reagent2.8125μl)和溶液b(opti-memmedium62.5μl、p3000reagent2.5μl、质粒pcpv-ns-vp1.25μg)；

④按照体积比1:1的比例将溶液b加入到溶液a，混匀，室温静置15min；

⑤在保留原来培养基的前提下，逐滴加入125μl脂质体/dna混合物，边加边轻摇培养板；

放入二氧化碳细胞培养箱，孵育6h后，弃去转染培养基，加入1ml含10％fbs的dmem培养基；

(2)细胞间接免疫荧光

①将步骤(1)转染后的f81猫肾细胞做间接免疫荧光，同时，犬细小病毒newcpv-2a亚型毒株cpv-bm感染f81猫肾细胞组作为阳性对照；

②待12孔板的f81猫肾细胞长成单层后，再培养30h；把培养液弃去，每孔加入1ml预冷的体积分数80％的丙酮溶液，-20℃固定30min；

③弃掉丙酮后，每孔用灭菌的pbs洗涤3次；

④再于每孔加入500μl1:100pbs稀释的cpv单克隆抗体(购于自珠海博美生物科技有限公司)，37℃孵育过夜；

⑤用灭菌的pbs洗涤3次，每孔加入300μl1:100pbs稀释的fitc标记的羊抗鼠igg二抗(购于武汉三鹰生物技术有限公司)，37℃孵育1h；

⑥用灭菌的pbs洗涤3次，最后每孔加入1ml灭菌的pbs，置于荧光倒置显微镜下观察；

(3)vp蛋白的western-blot检测

①往步骤(1)转染后的f81猫肾细胞加入100μlripa细胞裂解液(购于自碧云天生物技术公司)和1μlpmsf(购于自碧云天生物技术公司)，作用1min；

②用1.5mlep管收集作用后的f81猫肾细胞样品，然后按比例加入6×loadingbuffer，100℃煮10min；

③煮完后，12000×g离心3min，收集上清液至1.5mlep管中；

④将上述样品在质量体积比为12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)中进行电泳分析，在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，浓缩胶分离时使用电压80v电泳30min，分离胶使用电压120v电泳60min；

⑤sds-page结束后，取出凝胶，按照海绵垫-3层滤纸-凝胶-pvdf膜-3层滤纸-海绵垫的顺序制成聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”；将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电泳仪中进行电转，用200ma恒流转移45min。转移完毕后取下pvdf膜，进行如下操作：洗膜：用pbst洗膜2次，每次5min；封闭：用含有质量分数为10％脱脂奶粉的pbst封闭3h；洗膜：弃去封闭液，用pbst洗膜3次，每次10min；加入一抗：1:1000稀释的cpv单克隆抗体(购于自珠海博美生物科技有限公司)，4℃过夜；洗膜：弃去一抗，用pbst洗膜5次，每次10min；加入二抗：hrp-羊抗鼠igg(购于自武汉三鹰生物技术有限公司)按1:2000稀释作为二抗，置于37℃中孵育1h；洗膜：弃去二抗，用pbst洗膜5次，每次10min；显色：加入适量的tmb显色液，用化学发光成像仪拍照。

细胞间接免疫荧光结果见图4，转染辅助质粒pcpv-ns-vp以及感染cpv-bm病毒的f81猫肾细胞都能观察到绿色荧光，说明它们都能被cpv的单克隆抗体特异识别。

western-blot的结果见图5，转染辅助质粒pcpv-ns-vp以及感染cpv-bm病毒的f81猫肾细胞样品能够被cpv的单克隆抗体识别到分子量分别为82和67kda的条带，它们与病毒的vp1和vp2蛋白的分子量相一致。以上结果说明辅助质粒pcpv-ns-vp能够正常表达cpv的vp蛋白。

实施例5复制缺陷型cpv-2重组病毒的包装

(1)细胞转染

①细胞铺板：用5ml含10％fbs的dmem吹散f81猫肾细胞，取细胞450μl/孔，待细胞生长至汇合度为70～80％时进行转染；

②进行转染时，在加入脂质体/dna混合物之前的短时间内，更换1ml不含抗生素的无血清dmem培养基；

③配溶液a(opti-memmedium62.5μl、lipofectamine3000reagent2.8125μl)和溶液b(opti-memmedium62.5μl、p3000reagent2.5μl、质粒pcpv-ns-vp800ng、质粒pitr-p-egfp-ts-itr470ng)；

④按照体积比1:1的比例将溶液b加入到溶液a，混匀后室温静置15min；

⑤在保留原来培养基的前提下，逐滴加入125μl脂质体/dna混合物，边加边轻摇培养板；

⑥放入二氧化碳细胞培养箱，孵育6h后，弃去转染培养基，加入1ml含10％fbs的dmem培养基；

⑦将转染48h后的细胞，放在-80℃冻结，于常温下融化，反复冻融3次，最后一次融化后，将上清液用1.5mlep管分装，4℃，12000r/min，离心10min，将上清液转移1.5mlep管中，于-80℃保存备用。

(2)猪红细胞凝集试验

在96孔v型血凝板中每孔加入25μlpbs稀释液(ph＝6.8)，于第一孔加入25μl待检的步骤(1)制得的转染细胞上清液或阳性对照cpv-bm病毒液，在96孔血凝板上连续作2倍稀释，最后一孔作为阴性对照；每孔再加入25μl1.0％猪红细胞悬液(购于自翔博生物科技有限公司)，于振荡器上振荡混匀1min，之后4℃冰箱放置1～2h，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点沉于孔底时，以出现100％凝集的病毒最大稀释度为该病毒的ha效价，当血凝效价低于1:8时可定为阴性，当ha效价等于或者高于1:8时，则判为阳性。

(3)转染上清液感染f81猫肾细胞

f81猫肾细胞培养24h后，弃去培养皿里的培养液，用2ml高压灭菌的pbs洗一遍细胞后，弃掉，洗2次，加入1ml胰酶，轻轻晃动培养皿，使胰酶充分覆盖单层细胞后，弃掉，加入2.8ml含10％fbs的dmem，将消化后的细胞吹打下来，12孔板每孔加入200μl细胞，然后加入600μl含5％fbs的dmem和200μl步骤(1)制得的转染细胞上清液，放入二氧化碳培养箱中培养，每隔12小时在倒置荧光显微镜下观察。

其中，猪红细胞凝集试验结果见表1，载体itr质粒和复制质粒共转染细胞上清液的血凝价可达1:128，说明这两种质粒共同转染f81细胞能够包装出具有血凝活性的cpv病毒粒子。

转染上清液感染f81猫肾细胞结果见图6，载体itr质粒和复制质粒共转染细胞上清再次感染f81猫肾细胞后，能够观察到绿色荧光，说明这两种质粒的共转包装出的cpv重组病毒可以转导egfp基因的表达。

表1载体itr质粒和辅助质粒共转染细胞上清液的ha效价

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>一种复制缺陷型犬细小病毒包装载体、复制缺陷型重组犬细小病毒及制备与应用

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