鉴别玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的引物及方法与流程

鉴别玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的引物及方法
(一)技术领域
1.本发明涉及一种快速鉴别香榧品种鉴别香榧品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的分子特征性荧光ssr标记引物及方法。
(二)

背景技术：

2.香榧隶属红豆杉科(taxaceae)榧树属(torreya)植物，是榧树种 (torreya grandis)中的优良变异经人工选育后嫁接繁殖栽培的优良品种，也是目前榧树中唯一进行人工规模栽培的变种。香榧是我国特有的珍贵经济树种，具有食用、药用、材用、绿化等多种用途。
3.香榧至今已有1300多年的栽培历史，主要分布于长江流域以南的浙江、江苏、安徽、福建、江西、湖南、湖北、四川、云南和贵州等10省。香榧的实生嫁接繁殖产生了丰富的变异类型，历经多年的优株选育和大批量繁殖试验，浙江省林业育种工作者选育出了多个香榧品种。2011年，良种
‘
细榧’(t.grandis
‘
xifei’)通过国家林业局林木品种审定委员会审定。近年来，浙江省审(认)定了
‘
珍珠榧’、
‘
大长榧’、
‘
象牙榧’、
‘
东白珠’、
‘
脆仁榧’、
‘
朱岩榧’、
‘
丁山榧’、
‘
东榧1 号’、
‘
东榧2号’、
‘
东榧3号’、
‘
大叶种细榧’、
‘
磐安长榧’、
‘
玉山鱼榧’、
‘
磐大榧’等新品种。随着榧树新品种的不断选育和香榧产业的发展壮大，这些新品种的鉴定与知识产权保护也急需相应的分子技术手段跟进。
4.香榧品种的鉴别一直是基于传统的形态学上的分类，即根据盛果期香榧果实或种子的性状分为圆籽型(大、中、小圆榧等)和长籽型(细榧、芝麻榧、米榧、茄榧、撩牙榧、旋纹榧等)。这一鉴别方法需要在一年中的果实成熟后才能鉴定选种，无法进行早期鉴别。自2000年以来，一些基于pcr的分子标记技术如rapd(random amplified polymorphicdna，随机扩增多态性dna)、issr(inter
‑
simple sequence repea，简单序列重复区间扩增多态性)和srap(sequence
‑
related amplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性)相继用于了香榧品种分类、遗传变异和居群遗传多样分析。
5.然而这些分子标记所采用的均为通用型引物，其pcr扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，需经过大量的筛选工作，因此并不适合于品种鉴别。ssr(simple sequence repeat，简单重复序列；或 microsatellite，微卫星)为共显性标记，能区分纯合子和杂合子，能检测复等位基因，且具有多态性丰富、操作简单、结果可靠、重复性好等优点。近年来，有基于榧树转录组测序开发ssr标记的报道，但这些ssr标记的可用性是基于传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对条带的人工判读误差较大，难以准确区别出ssr位点上等位基因在几个碱基上的差异；而且这些ssr标记也尚未进行多态性筛选工作，因此是否可用于香榧品种的准确快速鉴别不得而知。
6.荧光ssr标记的开发是基于dna测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如fam、hex、tamra等)来标记一对ssr 引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。因此，利用荧光ssr标记技术开发香榧新品
种或优良、特色品种的特征ssr指纹(基因型)，揭示品种间的基因型差异，对于品种的鉴别与知识产权保护具有重要意义。但迄今为止，国内外尚无利用荧光ssr标记技术开发特征ssr指纹鉴别香榧品种的报道。
(三)

技术实现要素：

7.本发明目的是提供一种快速鉴别香榧品种鉴别香榧品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的分子特征性荧光ssr标记引物及方法。
8.本发明采用的技术方案是：
9.用于鉴别香榧品种鉴别香榧品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的一对分子特征性荧光ssr引物，其核苷酸序列如下：
10.上游引物tg_u971f：5
′‑
fam
‑
tgtcctcctgctctgggtag
‑3′
；
11.下游引物tg_u971r：5
′‑
ggccttaccaaacgaaatca
‑
3。
12.该引物对是基于荧光ssr标记技术，经过对大量自主开发的ssr引物在待测香榧品种间进行多态性筛选试验后获得的。利用该引物对对9 个香榧品种进行荧光ssr检测，4个香榧新品种(玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧)可稳定获得4种不同的ssr特征指纹(基因型)，而其他香榧品种均不具备这4种特征，因此该引物可用于快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧。需要说明的是，本发明分子特征性荧光ssr引物仅限于香榧品种的鉴别(鉴别其是否为玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧)，即待测样品仅限于香榧品种。
13.本发明还涉及一种快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的方法，所述方法包括：提取待测香榧品种针叶的基因组dna作为模板，以分子特征性荧光ssr引物对tg_u971f和tg_u971r作为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若毛细管电泳峰图上出现的基因型为195/195、201/216、192/216或192/213，则待测香榧品种分别为玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧，反之则否；
14.所述分子特征性荧光ssr标记引物核苷酸序列如下：
15.上游引物tg_u971f：5
′‑
fam
‑
tgtcctcctgctctgggtag
‑3′
；
16.下游引物tg_u971r：5
′‑
ggccttaccaaacgaaatca
‑
3。
17.本发明方法关键在于扩增ssr引物的选择，dna提取、pcr反应体系及反应条件确定、荧光毛细管电泳检测以及数据统计分析，均可按照本领域常规方法进行。
18.优选的，所述pcr扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性 10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。
19.优选的，所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将pcr扩增产物稀释后于96℃变性5min，将变性后的稀释产物在
‑
20℃下迅速冷冻2min后置入abi 3730xl genetic analyzer(abi,ca,usa)，与内标genescan
tm
‑
500 liz size standard(abi)同步进行毛细管电泳检测，用data collection 3.0 软件(abi)收集数据。
20.具体的，所述方法如下：
21.(1)取取待测香榧品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取香榧的基因组 dna；
22.(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以所述分子特征性ssr 引物作为扩增引物，进行pcr扩增：
23.pcr反应体系每20μl组成如下：
[0024][0025][0026]
pcr反应条件如下：
[0027]
98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃；
[0028]
(3)内标配制：取10mlhi
‑
di和80μlgenescan
tm
‑
500lizsizestandard混匀，离心，以每孔10μl分装于96孔内标板，离心；将pcr扩增产物稀释，离心；取稀释产物按0.5μl/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入pcr仪，于96℃变性5min，之后在
‑
20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的pcr产物；将变性后的pcr产物与内标同步置入abi3730xlgeneticanalyzer进行毛细管电泳检测，用datacollection3.0软件收集数据；
[0029]
(4)数据分析：用genemapper4.1软件(abi)对datacollection3.0软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标genescan
tm
‑
500lizsizestandard进行比较，直接读出目标ssr片段的准确峰值(bp数)，纯合位点的等位变异数据记录为x/x，杂合位点的等位变异数据记录为x/y或x/y/z/...(多倍体)；
[0030]
(5)结果判断：若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为195/195，则待测香榧品种为玉山鱼榧；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为201/216，则待测香榧品种为细香榧；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为192/216，则待测香榧品种为大香榧；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为192/213，则待测香榧品种为磐大榧，反之则否。
[0031]
本发明的有益效果主要体现在：本发明所述的分子特征性荧光ssr引物可利用针叶dna即同时对香榧新品种玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即根据果实形态学特征的鉴别香榧品种所不能替代的分子手段。
(四)附图说明
[0032]
图1为对9个香榧品种dna的pcr扩增后进行荧光毛细管电泳检测结果；a为多眼香榧(玉山鱼榧)(来自磐安县尚湖镇岭干村)，b为细榧(来自磐安县尚湖镇湖口村)，c为磐安长榧(来自磐安县大盘镇长坑村)，d为大香榧(来自磐安县尚湖镇湖口村)，e为大丁香(来自磐安县大盘镇长坑村)，f为獠牙榧(来自磐安县尚湖镇黄岩前村)，g为磐大榧(来自磐安县尚湖板榧村)，h为大圆榧(来自磐安县尚湖板岭干村)，i为中圆榧(来自磐安县尚湖镇湖口村)。
(五)具体实施方式
[0033]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0034]
实施例1：
[0035]
(1)香榧品种基因组dna的提取：
[0036]
取待测9个香榧品种硅胶保存的幼嫩叶片0.03g，加液氮彻底磨碎，基因组dna的提取利用新型快速植物基因组dna提取盒(dp3111，北京百泰克)，以提取获得香榧品种的基因组dna粗提物。
[0037]
dna粗提物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和dna/rna紫外分光光度计(nanodrop technologies，usa)来检测完整性、纯度及浓度。od
260
/od
280
>1.8的dna样品用于后续pcr扩增。dna提取物于
‑
20℃冰箱贮藏备用。
[0038]
(2)分子特征性ssr标记引物，引物对的序列为：
[0039]
上游引物tg_u971f：5
′‑
fam
‑
tgtcctcctgctctgggtag
‑3′
；
[0040]
下游引物tg_u971r：5
′‑
ggccttaccaaacgaaatca
‑3′
。
[0041]
由杭州有康生物科技有限公司合成。
[0042]
(3)pcr扩增，20μl pcr反应体系组成如下：：
[0043]
pcr反应液组成：2
×
t5 super pcr mix(page)(tse006，北京擎科新业生物)10μl，tg_u971f和tg_u971r引物(10μm)各1.5μl，模板dna(20ng/μl)3μl，ddh2o 4μl。
[0044]
扩增反应在life eco型扩增仪(bioer，杭州博日科技)上进行。扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸 10s，共30个循环；最后于72℃补平2min。终止温度为4℃。
[0045]
(4)内标配制：取10ml hi
‑
di和80μl genescan
tm
‑
500liz sizestandard混匀，离心，以每孔10μl分装于96孔内标板，离心。
[0046]
(5)荧光毛细管电泳检测：取步骤(3)pcr扩增产物5μl，稀释 100倍后取0.5μl/孔加入到分配好的内标板中，混匀，离心，放入pcr 仪，于96℃变性5min，之后在
‑
20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的pcr产物。将变性后的pcr产物与内标genescan
tm
‑
500liz sizestandard同步置入abi 3730xl genetic analyzer进行毛细管电泳检测，用data collection 3.0软件收集数据。
[0047]
(6)基因型分析与品种鉴别：用genemapper 4.1软件对datacollection 3.0软件收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标genescan
tm
‑
500liz size standard进行比较，直接给出目标ssr片段的准确峰值(bp)。纯合位点的等位变异数据记录为 x/x，杂合位点的等位变异数据记录为x/y或x/y/z/...(多倍体)。根据等位变异数据的差异性比较可以鉴别不同的香榧品种。上述9个香榧品种的基因型数据见表1。
[0048]
表1：九个香榧品种的基因型
[0049]
香榧品种cultivar基因型genotypea多眼香榧(玉山鱼榧)195/195b细榧201/216c磐安长榧192/192d大香榧192/216e大丁香192/192f獠牙榧192/192g磐大榧192/213
h大圆榧192/192i中圆榧192/192
[0050]
表1显示的9个香榧品种中，玉山鱼榧、细香榧、大香榧和磐大榧的基因型分别为195/195、201/216、192/216或192/213，显然不同于另外5 个品种的192/192，且这4个新品种间的基因型也彼此不同。这表明u971 是在香榧品种间具高度多态性的ssr标记，tg_u971可以作为分子特征性ssr引物来一次性鉴别4个香榧新品种，是香榧品种鉴别与知识产权保护的有力工具。