IL23A和/或IL12B基因人源化非人动物的构建方法及应用与流程

il23a和/或il12b基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑的il23a和il12b基因改造人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.白介素23(interleukin 23，il23)是2000年由birgit oppmann发现并命名的细胞因子(oppmann,b.et al.immunity.2000nov；13(5):715
‑
25.)，属于il12分子家族，主要由活化的树突状细胞、巨噬细胞及单核细胞等产生。il23由il23a(p19)亚基和il12b(p40)亚基耦合而成，与白介素12共用il12b亚基。亚基单独存在不具有生物学功能，只有相互连接形成二聚体才能发挥生物学功能(yannam,g.r.et al.j neuroimmunepharmacol,2012,7(1):95
‑
112.)。il23a与il12b分别与其受体il23r和il12rβ1相互作用，主要激活stata3下游信号通路发挥生物学功能。例如，激活的stat3可以活化相耦联的jak及其相关的pi3k/akt通路、jak/stat3通路和nf
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κb信号通路，调控相关基因表达，调节th17细胞的增殖和分化，并能促进th17细胞分泌il17a、il17f和il22等细胞因子，引起免疫应答的级联效应，引发一系列自身免疫性疾病。此外，激活的stat3可进一步触发髓系来源的抑制性细胞(mdsc)和肿瘤相关的巨噬细胞调控许多免疫抑制效应和促肿瘤效应。
3.大量的研究已经证实il23的异常表达与多种自身免疫性疾病密切相关。lee e等在银屑病患者中检测到il23的过度表达(lee e.et al.j esp med 2004；199(1):125
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130)；过表达il23a的转基因小鼠表现出多组织炎症、矮小综合征、不育、成熟前死亡，受β
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actin启动子调控广泛表达il23a的转基因小鼠有严重的生长和发育方面的缺陷，并且表现出淋巴细胞和巨噬细胞浸润为特征的多组织炎症(wiekowski mt,et al.j immunol,2001,166(12):7563
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7570.)。此外，近年来的研究发现，il23与一些肿瘤的发生有一定的相关性。例如，rahul purwar等人发现，il23可以通过抑制t细胞il9的产生和分泌以及降低cd8+t细胞的数量而促进黑色素瘤的生长(purwar,r.et al.natmed 18,1248
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1253.)；在结直肠癌中，il23激活的stat5通路增强了肿瘤细胞的迁移(zhang,l.et al.carcino genesis 35,1330
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1340.)；在人肝癌肿瘤微环境中，il23可以通过nf
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κb途径诱导mmp9的表达而促进肝癌细胞的转移(li,j.et al.plos one7,e46264.)。目前，全球范围内已经有四款靶向抗体药物获批上市，分别为靶向il12b的ustekinumab(商品名stelara)以及靶向il23a的guselkumab(商品名tremfya)、tildrakizumab(商品名ilumya)、risankizumab(商品名skyrizi)，但目前的适应症非常有限，主要为银屑病，更多靶向该信号通路的新型药物正在或已经进入临床研究。考虑到il23信号通路广泛的免疫调节功能，以及现有的少数几款上市药物远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向il23通路的药物。
4.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
5.随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(scheer n.et al.drug discov today；18(23
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24):1200
‑
11,2013)。
6.鉴于il23信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发涉及il23信号通路上相关基因改造的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的第一方面提供了一种il23a基因人源化非人动物的构建方法，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的全部或部分，所述的il23a基因人源化非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
8.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物体内的il23a基因通过内源调控元件进行调控。
9.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物体内的内源il23a蛋白表达降低或缺失。
10.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的全部或部分。
11.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的至少一个外显子。
12.更优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子到4号外显子核苷酸序列中的任一种或两种或三种或四种的组合。
13.更进一步优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子到4号外显子中的连续两个或连续三个或连续四个外显子的组合的全部或部分。
14.再进一步优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分。
15.再更进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为10
‑
1060个长度的核苷酸序列与人il23a基因相同，且il23a基因人源化非人动物体内产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为至少10、
30、60、90、160、320、570、723、830、960或1060个长度的核苷酸序列与人il23a基因相同，且il23a基因人源化非人动物体内产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
16.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子部分、2号外显子、3号外显子、4号外显子的部分。优选地，非人动物基因组中还包括1
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2号内含子、2
‑
3号内含子、3
‑
4号内含子。其中，所述的1号外显子的部分为从1号外显子atg编码序列开始至1号外显子最后一个核苷酸，所述的4号外显子的部分为从4号外显子第一个核苷酸至taa终止。
17.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含编码人或人源化il23a蛋白的嵌合il23a基因的核苷酸序列。
18.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
19.优选的，所述的非人动物体内不表达内源il23a蛋白，或非人动物体内内源il23表达水平降低。
20.优选的，所述的构建方法中使用基因编辑技术进行il23a基因人源化非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
21.优选的，所述的构建方法包括用人il23a基因插入和/或替换非人动物il23a基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白；进一步优选的，所述的构建方法包括用人il23a基因的1号外显子至4号外显子插入和/或替换在非人动物il23a基因基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白；更进一步优选的，所述的构建方法包括用编码人il23a蛋白的核苷酸序列插入和/或替换在非人动物il23a基因的基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
22.优选的，所述的替换在内源非人动物il23a基因座处，并且包含所述人il23a基因序列的一个或多个外显子的经改造的il23a基因序列可操作地连接至內源1l23a基因座的调节元件。
23.优选的，保留非人动物的il23a基因的内源调控序列(5’utr)，确保il23a基因正常表达。
24.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用编码人il23a蛋白的核苷酸序列原位替换非人动物il23a基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
25.优选的，所述非人动物使用靶向载体进行构建，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il23a基因的全部或部分，进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的至少一个外显子的全部或部分；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合的全部或部分；再更进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分；特别优选的，所述的供体dna序列包含编码人il23a蛋白的核苷酸序列。
26.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂(5’同源臂)，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述的5’臂核
苷酸序列如seq id no：5所示。
27.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂(3’同源臂)，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：6所示。
28.优选的，所述的内源il23a蛋白表达缺失或者内源il23a蛋白不表达。
29.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用编码人il23a蛋白的核苷酸序列替换在内源il23a基因座处，使得所述的非人动物表达人或人源化il23a蛋白，且使得内源il23a蛋白不表达。
30.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用编码人il23a蛋白的核苷酸序列插入非人动物il23a基因座，并破坏内源il23a基因的编码框，使得所述的非人动物表达人或人源化il23a蛋白。
31.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
32.优选的，所述的非人动物在内源il12b基因座处包含用人il12b基因的全部或部分替换在非人动物il12b基因座处；优选的，所述的用人il12b基因的2号外显子至8号外显子替换在非人动物il12b基因座处；更进一步优选的，所述的用人il12b蛋白的核苷酸序列替换在非人动物il12b基因的基因座处。其中所述的经替换的il12b基因的表达处于所述内源il12b基因座的调节元件的控制下。
33.本发明的第二方面，提供了一种根据上述il23a基因人源化非人动物的构建方法构建的il23a基因人源化非人动物。
34.本发明的第三方面，提供了一种il23a基因人源化非人动物，所述的il23a基因人源化非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
35.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的全部或部分。
36.优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的至少一个外显子。
37.更优选的，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分。
38.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因人源化非人动物的基因组中包含编码人或人源化il23a蛋白的嵌合il23a基因的核苷酸序列。
39.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
40.优选的，所述的非人动物体内不表达内源il23a蛋白，或者内源il23a表达水平降低。
41.本发明所述的人或人源化il23a蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
42.a)为seq id no：4所述氨基酸序列的全部或部分；
43.b)与seq id no：4所示氨基酸的序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
44.c)与seq id no：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过
1个氨基酸；或
45.d)具有seq id no：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
46.优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的全部或部分，所述的人il23a基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
47.a)为seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列的全部或部分；
48.b)与seq id no：7所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
49.c)与seq id no：7所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
50.d)具有seq id no：7所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
51.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il23a基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
52.a)转录的mrna序列为seq id no：9所示的核苷酸序列的全部或部分；
53.b)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列的同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
54.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：9所示的核苷酸序列杂交；
55.d)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
56.e)转录的mrna序列具有seq id no：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
57.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
58.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
59.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
60.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分为具有seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
61.j)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
62.k)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
63.l)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的序列差
异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
64.m)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为具有seq id no：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或
65.n)包含seq id no：8所示的核苷酸序列。
66.本发明的第四方面提供了一种il12b基因人源化非人动物的构建方法，所述的il12b基因人源化非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
67.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物体内包含嵌合il12b基因，所述的嵌合il12b基因通过内源调控元件进行调控。
68.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的内源il12b蛋白表达降低或缺失。
69.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的全部或部分。
70.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的至少一个外显子。
71.进一步优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的任一种或两种以上的组合。所述的两种以上包括两种、三种、四种、五种、六种、七种。
72.再进一步优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的连续两个以上外显子的组合。所述的两个以上包含两个、三个、四个、五个、六个、七个。
73.更进一步优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
74.再更进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为10
‑
12000个长度的核苷酸序列与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为至少10、60、90、160、320、640、830、1200、1500、2305、4630、6270、8235或12000个长度的核苷酸序列与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
75.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子的全部。
76.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含编码人或人源化il12b蛋白的嵌合il12b基因的核苷酸序列。
77.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
78.优选的，所述的非人动物体内不表达内源il12b蛋白，或内源il12b蛋白表达降低。
79.优选的，所述的构建方法中使用基因编辑技术进行il12b基因人源化非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的dna基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
80.优选的，所述的构建方法包括用人il12b基因插入和/或替换在非人动物il12b基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白；进一步优选的，所述的构建方法包
括用人il12b基因的2号外显子至8号外显子插入和/或替换在非人动物il12b基因的全部或部分，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白；更进一步优选的，所述的构建方法包括用编码人il12b蛋白的核苷酸序列插入和/或替换非人动物il12b基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
81.优选的，所述的替换在内源il12b基因座处包含用人il12b基因的全部或部分替换在非人动物il12b基因座处；优选的，所述的用人il12b基因的2号外显子至8号外显子替换在非人动物il12b基因座处；更进一步优选的，所述的用人il12b蛋白的核苷酸序列替换在非人动物il12b基因的基因座处。其中所述的经替换的il12b基因的表达处于所述内源il12b基因座的调节元件的控制下。
82.并且包含所述人il12b基因序列的一个或多个外显子的经改造的il12b基因序列可操作地连接在內源1l12b基因座的调节元件或序列，替换序列从atg开始编码蛋白。
83.优选的，保留非人动物的il12b基因的内源调控序列(5’utr)，确保il12b基因正常表达。
84.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用编码人il12b蛋白的核苷酸序列替换非人动物il12b基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
85.优选的，使用靶向载体实现上述的插入和/或替换，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il12b基因的全部或部分；优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的至少一个外显子；进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部；特别优选的，所述的供体dna序列包含编码人il12b蛋白的核苷酸序列。
86.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述5’臂核苷酸序列如seq id no：33所示。
87.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：34所示。
88.优选的，所述的内源il12b蛋白表达降低或者所述的内源il12b蛋白不表达。
89.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用编码人il12b蛋白的核苷酸序列替换内源il12b基因座处，使得所述的非人动物表达人il12b蛋白，且使得内源il12b蛋白不表达。
90.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人il12b蛋白的核苷酸序列插入非人动物il12b基因座，并破坏内源il12b基因的编码框，使得所述的非人动物表达人il12b蛋白。
91.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
92.优选的，所述的非人动物的内源il23a基因座处包含用人il23a基因的全部或部分替换在非人动物il23a基因基因座处；优选的，所述的用编码人il23a基因的1号外显子至4
号外显子的全部或部分替换在非人动物il23a基因的基因座处；进一步优选的，所述的用编码人il23a蛋白的核苷酸序列替换在非人动物il23a基因的基因座处。其中所述的经替换的il23a基因的表达处于内源il23a基因座的调节元件的控制下。
93.本发明的第五方面，提供了一种根据上述il12b基因人源化非人动物的构建方法构建的il12b基因人源化非人动物。
94.本发明的第六方面，提供了一种il12b基因人源化非人动物，所述的il12b基因人源化非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
95.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的全部或部分。
96.优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的至少一个外显子。
97.更优选的，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
98.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因人源化非人动物的基因组中包含编码人或人源化il12b蛋白的核苷酸序列。
99.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
100.优选的，所述的非人动物体内不表达内源il12b蛋白，或内源il12b蛋白表达降低。
101.本发明所述的人或人源化il12b蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
102.a)为seq id no：32所述氨基酸序列的部分或全部；
103.b)与seq id no：32所示氨基酸的序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
104.c)与seq id no：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
105.d)具有seq id no：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
106.优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的全部或部分，所述人il12b基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
107.a)为seq id no：31或seq id no：35所示的核苷酸序列的全部或部分；
108.b)与seq id no：35所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
109.c)与seq id no：35所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
110.d)具有seq id no：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
111.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il12b基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
112.a)转录的mrna序列为seq id no：36所示的核苷酸序列的全部或部分；
113.b)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列的同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
114.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：36所示的核苷酸序列杂交；
115.d)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
116.e)转录的mrna序列具有seq id no：36所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
117.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
118.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
119.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
120.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分为具有seq id no：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
121.j)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
122.k)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
123.l)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
124.m)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为具有seq id no：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
125.本发明的第七方面提供了一种il23a基因和il12b基因人源化非人动物的构建方法，所述的人源化il23a基因和il12b基因表达人或人源化il23a蛋白和人或人源化il12b蛋白。
126.优选的，上述的构建方法构建的il23a基因人源化非人动物或上述的il23a基因人源化非人动物与上述的构建方法构建的il12b基因人源化非人动物或上述的il12b基因人源化非人动物进行交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到il23a基因和il12b基因人源化非人动物。
127.本发明的第八方面提供了一种il23a基因和il12b基因人源化非人动物，所述的il23a基因和il12b基因人源化非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白和人或人源化il12b蛋白。
128.优选的，所述的il23a基因和il12b基因人源化非人动物的基因组中包含人il23a
基因和人il12b基因的全部或部分，进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子和人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部或部分；更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含至少一个人il23a基因和一个人il12b基因的外显子；特别优选的，所述的非人动物的基因组中包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子和人il12b基因的2号外显子至8号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；更特别优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人或人源化il23a蛋白和人或人源化il12b蛋白的核苷酸序列。
129.本发明的第九方面提供了一种il23a基因经遗传修饰的细胞，所述的细胞表达人或人源化il23a蛋白。
130.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
131.优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的全部或部分。
132.优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的至少一个外显子。
133.进一步优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的1号外显子到4号外显子中的任一种或两种或三种或四种的组合。
134.再进一步优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的1号外显子到4号外显子中的连续两个或连续三个或连续四个外显子的组合。
135.更优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分。
136.更进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为10
‑
1060bp与人il23a基因相同，且il23a基因经遗传修饰的细胞产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为至少10、30、60、90、160、320、570、723、830、960或1060个与人il23a基因相同，且il23a基因经遗传修饰的细胞产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
137.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的1号外显子部分、2号外显子、3号外显子、4号外显子的部分。其中，所述的1号外显子的部分为从1号外显子atg编码序列开始，所述的4号外显子的部分为从4号外显子第一个核苷酸开始至taa终止。
138.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含编码人或人源化il23a蛋白的核苷酸序列。
139.优选的，所述的细胞不表达内源il23a蛋白。
140.优选的，所述的细胞表达人或人源化il23a蛋白。
141.优选的，所述的细胞来源于啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；特别优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
142.本发明的第十方面提供了一种il12b基因经遗传修饰的细胞，所述的细胞表达人或人源化il12b蛋白。
143.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
144.优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的全部或部分。
145.优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的至少一个外显子。
146.进一步优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的任一种或两种以上的组合。所述的两种以上包括两种、三种、四种、五种、六种、七种。
147.再进一步优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的连续两个以上外显子的组合。所述的两个以上包含两个、三个、四个、五个、六个、七个。
148.更优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
149.更进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为10
‑
12000个长度的核苷酸序列与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为至少10、60、90、160、320、640、830、1200、1500、2305、4630、6270、8235或12000个长度的核苷酸序列与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
150.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子的全部。
151.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含编码人或人源化il12b蛋白的核苷酸序列。
152.优选的，所述的细胞不表达内源il12b蛋白。
153.优选的，所述的细胞表达人或人源化il12b蛋白。
154.优选的，所述的细胞来源于啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；特别优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
155.本发明的第十一方面提供了一种il23a基因经遗传修饰的细胞的构建方法，所述的细胞表达人或人源化il23a蛋白。
156.优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的部分。
157.优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的至少一个外显子。
158.更优选的，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分。
159.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含编码人或人源化il23a蛋白的嵌合il23a基因的核苷酸序列。
160.优选的，所述的细胞不表达内源il23a蛋白。
161.优选的，所述的细胞表达人或人源化il23a蛋白。
162.优选的，所述的细胞来源于啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；特别优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
163.优选的，所述的构建方法包括用人il23a基因插入和/或替换在非人动物细胞的il23a基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白；进一步优选的，所述的构建方法包括用人il23a基因的1号外显子至4号外显子插入和/或替换在非人动物细胞il23a基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白；更进一步优选的，所述的构建方法包括用编码人il23a蛋白的核苷酸序列插入和/或替换非人动物细胞il23a基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
164.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用编码人il23a蛋白的核苷酸序列原位替换非人动物细胞il23a基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il23a蛋白。
165.优选的，使用靶向载体实现上述的插入和/或替换，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il23a基因的全部或部分，更优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的至少一个外显子的全部或部分；进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分；特别优选的，所述的供体dna序列包含编码人il23a蛋白的核苷酸序列。
166.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂核苷酸序列如seq id no：5所示。
167.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：6所示。
168.按照本发明所述的构建方法构建的il23a基因经遗传修饰的细胞或者本发明所述的il23a基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含嵌合il23a基因，所述的嵌合il23a基因编码人或人源化il23a蛋白，所述的嵌合il23a基因编码的氨基酸序列选自下列组中的一种：
169.a)为seq id no：4所述氨基酸序列的部分或全部；
170.b)与seq id no：4所示氨基酸的序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
171.c)与seq id no：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
172.d)具有seq id no：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
173.优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的全部或部分，所述的人il23a基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
174.a)为seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列的全部或部分；
175.b)与seq id no：7所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
176.c)与seq id no：7所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
177.d)具有seq id no：7所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
178.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il23a基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
179.a)转录的mrna序列为seq id no：9所示的核苷酸序列的全部或部分；
180.b)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列的同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
181.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：9所示的核苷酸序列杂交；
182.d)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
183.e)转录的mrna序列具有seq id no：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
184.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
185.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
186.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
187.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分为具有seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
188.j)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
189.k)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
190.l)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
191.m)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为具有seq id no：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或
192.n)包含seq id no：8所示的核苷酸序列。
193.本发明的第十二方面提供了一种il12b基因经遗传修饰的细胞的构建方法，所述
的细胞表达人或人源化il12b蛋白。
194.优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的部分。
195.优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的至少一个外显子。
196.更优选的，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
197.在本发明的一个具体实施方式中，所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含编码人或人源化il12b蛋白的核苷酸序列。
198.优选的，所述的细胞不表达内源il12b蛋白。
199.优选的，所述的细胞表达人或人源化il12b蛋白。
200.优选的，所述的细胞来源于啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；更进一步优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；特别优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
201.优选的，所述的构建方法包括用人il12b基因插入或替换非人动物细胞il12b基因，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白；进一步优选的，所述的构建方法包括用人il12b基因的2号外显子至8号外显子核苷酸序列插入或替换非人动物细胞il12b基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白；更进一步优选的，所述的构建方法包括用编码人il12b蛋白的核苷酸序列插入或替换非人动物细胞il12b基因座处，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
202.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人il12b蛋白的核苷酸序列替换非人动物il12b基因的内源调控元件之后，使得所述非人动物体内表达人或人源化il12b蛋白。
203.优选的，使用靶向载体实现上述的插入和/或替换，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il12b基因的全部或部分，更优选的，所述的供体dna序列包含至少一个人il12b基因的外显子的全部或部分；进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部；特别优选的，所述的供体dna序列包含编码人il12b蛋白的核苷酸序列。
204.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述5’臂核苷酸序列如seq id no：33所示。
205.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；更优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：34所示。
206.按照本发明所述的构建方法构建的il12b基因经遗传修饰的细胞或者本发明所述的il12b基因经遗传修饰的细胞的基因组中包含嵌合il12b基因，所述的嵌合il12b基因编
码人或人源化il12b蛋白，所述的嵌合il12b基因编码的氨基酸序列选自下列组中的一种：
207.a)为seq id no：32所述氨基酸序列的全部或部分；
208.b)与seq id no：32所示氨基酸的序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
209.c)与seq id no：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
210.d)具有seq id no：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
211.优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的全部或部分，所述的人il12b基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
212.a)为seq id no：31或seq id no：35所示的核苷酸序列的全部或部分；
213.b)与seq id no：35所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
214.c)与seq id no：35所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
215.d)具有seq id no：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
216.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il12b基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
217.a)转录的mrna序列为seq id no：36所示的核苷酸序列的全部或部分；
218.b)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列的同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
219.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：36所示的核苷酸序列杂交；
220.d)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
221.e)转录的mrna序列具有seq id no：36所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
222.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
223.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
224.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
225.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分为具有seq id no：29所示的，
包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
226.j)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
227.k)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
228.l)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
229.m)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为具有seq id no：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
230.本发明的第十三方面提供了一种il23a基因的靶向载体，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il23a基因的全部或部分。
231.优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的至少一个外显子；进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含编码人il23a蛋白的核苷酸序列；再进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分；特别优选的，所述的供体dna序列包含人il23a基因的cdna序列。
232.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；特别优选的，所述5’臂核苷酸序列如seq id no：5所示。
233.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自il23a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；更进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；特别优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：6所示。
234.优选的，所述的供体dna序列包含seq id no：7。
235.优选的，所述的待改变的转换区位于il23a基因的1号外显子至4号外显子上。
236.优选的，所述的靶向载体还包括可选择的基因标记。
237.优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
238.优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
239.优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
240.本发明的第十四方面提供了一种il12b基因的靶向载体，所述的靶向载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人il12b基因的全部或部分。
241.优选的，所述的供体dna序列包含至少一个人il12b基因的外显子；进一步优选的，
所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的任意两个以上外显子的组合或连续两个以上外显子的组合；再进一步优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部；更进一步优选的，所述的供体dna序列包含编码人il12b蛋白的核苷酸序列；特别优选的，所述的供体dna序列包含人il12b基因的cdna序列。
242.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；特别优选的，所述5’臂核苷酸序列如seq id no：33所示。
243.优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自il12b基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸；特别优选的，所述3’臂核苷酸序列如seq id no：34所示。
244.优选的，所述的供体dna序列包含seq id no：35。
245.优选的，所述的待改变的转换区位于il12b基因的2号外显子至8号外显子上。
246.优选的，所述的靶向载体还包括可选择的基因标记。
247.优选的，所述的靶向载体包含人3’utr。
248.优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
249.优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
250.优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
251.本发明的第十五方面提供了一种包含il23a基因的靶向载体和/或il12b基因的靶向载体的细胞。
252.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
253.本发明的第十六方面提供了一种构建il23a基因人源化非人动物或il23a基因经遗传修饰的细胞的靶向载体。
254.本发明的第十七方面提供了一种构建il12b基因人源化非人动物或il12b基因经遗传修饰的细胞的靶向载体。
255.本发明的第十八方面提供了一种构建上述的靶向载体的方法，所述方法包括如下步骤：
256.1)采用常规方法进行载体构建，如酶切连接等；
257.2)载体经酶切进行初步验证后，再经测序验证，获得载体；
258.3)将载体电穿孔转染入胚胎干细胞中；
259.4)利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot检测(分别用ecorv或asei或hindiii消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)，筛选获得阳性靶向载体。
260.本发明的第十九方面提供了一种上述的细胞、上述的靶向载体在基因编辑il23a和/或il12b基因中的应用。
261.本发明的第二十方面提供了一种il23a基因人源化非人动物的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
262.(1)按照上述的靶向载体构建的步骤1)
‑
4)，获得阳性靶向载体；
263.(2)将阳性靶向载体导入已分离好的非人动物囊胚中，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体雌性非人动物的输卵管中发育，可生产f0代非人动物；
264.(3)将f0代动物利用pcr技术进行检验，验证细胞中人源化il23a基因非人动物；
265.优选的，所述步骤(3)中验证细胞中的人源化il23a基因的pcr引物如seq id no：22
‑
24。
266.本发明的第二十一方面提供了一种il12b基因人源化非人动物的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
267.(a)按照上述的靶向载体构建的步骤1)
‑
4)，获得阳性靶向载体；
268.(b)将阳性靶向载体导入已分离好的非人动物囊胚中，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体雌性非人动物的输卵管中发育，可生产f0代非人动物；
269.(c)将f0代动物利用pcr技术进行检验，验证细胞中人源化il12b基因非人动物；
270.优选的，所述步骤(c)中验证细胞中的人源化il12b基因的pcr引物如seq id no：47
‑
49。
271.本发明的第二十二方面提供了一种制备多基因修饰的人源化非人动物的方法，包括如下步骤：
272.a)制备上述的非人动物或按照上述的构建方法构建的非人动物；
273.b)将步骤a)制备获得的非人动物与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的人源化非人动物。
274.所述的其他基因人源化的非人动物选自tnf
‑
α、il17等细胞因子和/或pd
‑
1、pd
‑
l1、ox40l等免疫检查点基因人源化的非人动物中的一种或两种以上的组合。
275.优选的，所述的多基因修饰的人源化非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
276.本发明的第二十三方面提供了一种上述的方法制备的非人动物或其后代。
277.本发明的第二十四方面提供了一种动物的荷瘤或自身免疫性疾病模型，所述的模型包括通过上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或者上述的非人动物或其后代。
278.优选的，所述的自身免疫性疾病为实验性变态反应性脑脊髓炎和银屑病。
279.本发明的第二十五方面提供了一种动物疾病模型的制备方法，所述的模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建的非人动物、上述的方法制备的非人动物或其后代的步骤。
280.优选的，所述疾病模型是荷瘤或自身免疫性疾病模型。
281.更优选的，所述的自身免疫性疾病为实验性变态反应性脑脊髓炎和银屑病。
282.本发明的第二十六方面，提供了上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或者上述的非人动物或其后代在制备动物的荷瘤或自身免疫性疾病模型中的应用。
283.优选的，所述的自身免疫性疾病为实验性变态反应性脑脊髓炎和银屑病。
284.本发明的第二十七方面提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的方法获得的多基因修饰的人源化非人动物、上述的非人动物或其后代、上述的制备方法获得荷瘤或自身免疫性疾病模型或者上述荷瘤或自身免疫性疾病模型。
285.优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育成动物个体。
286.本发明的第二十八方面提供了一种组织或器官或其培养物，所述的组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的方法获得的多基因修饰的人源化非人动物、上述的非人动物或其后代、上述的制备方法获得的荷瘤或自身免疫性疾病模型或者上述的荷瘤或自身免疫性疾病模型。优选的，所述的组织为胸腺组织、脾组织、表皮组织或肠组织。
287.优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育成动物个体。
288.本发明的第二十九方面提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的方法获得的多基因修饰的人源化非人动物、上述的制备方法获得的荷瘤或自身免疫性疾病模型、上述的非人动物或其后代或上述的荷瘤或自身免疫性疾病模型。
289.优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育成动物个体。本发明的第三十方面提供了一种嵌合il23a基因，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的部分。
290.优选的，所述的嵌合il23a基因是纯合或杂合的。
291.优选的，所述的嵌合il23a基因包含非人动物il23a基因的部分。
292.优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的至少一个外显子。
293.进一步优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子中的任一种或两种或三种或四种的组合。
294.再进一步优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的1号外显子至4号外显子中的连续两个或连续三个或连续四个外显子的组合。
295.更优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的1号外显子的部分至4号外显子的部分。
296.再进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为10
‑
1060bp与人il23a基因相同，且il23a基因人源化非人动物体内产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的1号外显子至4号外显子的部分为至少10、30、60、90、160、320、570、723、830、960或1060个长度的核苷酸序列与人il23a基因相同，且il23a基因人源化非人动物体内产生的il23a蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
297.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的1号外显子部分、2号外显子、3号外显子、4号外显子的部分。其中，所述的1号外显子的部分为从1号外显子atg编码序列开始，所述的4号外显子的部分为从4号外显子的第一个核苷酸开始至taa终止。
298.优选的，所述的嵌合il23a基因编码人或人源化il23a蛋白，所述的嵌合il23a基因编码的氨基酸序列选自下列组中的一种：
299.a)为seq id no：4所述氨基酸序列的全部或部分；
300.b)与seq id no：4所示氨基酸的序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
301.c)与seq id no：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
302.d)具有seq id no：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
303.优选的，所述的嵌合il23a基因包含人il23a基因的全部或部分，所述的人il23a基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
304.a)为seq id no：3或seq id no：7所示的核苷酸序列的全部或部分；
305.b)与seq id no：7所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
306.c)与seq id no：7所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
307.d)具有seq id no：7所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
308.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il23a基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
309.a)转录的mrna序列为seq id no：9所示的核苷酸序列的全部或部分；
310.b)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列的同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
311.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：9所示的核苷酸序列杂交；
312.d)转录的mrna序列与seq id no：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
313.e)转录的mrna序列具有seq id no：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
314.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
315.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
316.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分与seq id no：1所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
317.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il23a的部分为具有seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
318.j)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的核苷酸序列同一性至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
319.k)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分在严格条件下，与seq id no：3所示的核苷酸序列杂交；
320.l)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为与seq id no：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
321.m)转录的mrna序列中来源于人il23a基因的部分为具有seq id no：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或
322.n)包含seq id no：8所示的核苷酸序列。
323.优选的，所述的嵌合il23a基因还包括特异性诱导物或阻遏物。
324.优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
325.本发明所述的非人动物为为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；进一步优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；更进一步优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
326.本发明的第三十一方面提供了一种嵌合il12b基因，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的全部或部分。
327.优选的，所述的嵌合il12b基因是纯合或杂合的。
328.优选的，所述的嵌合il12b基因包含非人动物il12b基因的部分。
329.优选的，所述的嵌合il12b基因包含至少一个人il12b基因的外显子。
330.进一步优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的任一种或两种以上的组合。所述的两种以上包括两种、三种、四种、五种、六种、七种。
331.再进一步优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的2号外显子到8号外显子中的连续两个以上外显子的组合。所述的两个以上包含两个、三个、四个、五个、六个、七个。
332.更进一步优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
333.再更进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为10
‑
12000个与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体；进一步优选的，所述的2号外显子至8号外显子的部分为至少10、60、90、160、320、640、830、1200、1500、2305、4630、6270、8235或12000个长度的核苷酸序列与人il12b基因相同，且il12b基因人源化非人动物体内产生的il12b蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
334.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的2号外显子至8号外显子的全部。
335.优选的，所述的嵌合il12b基因编码人或人源化il12b蛋白，所述的嵌合il12b基因编码的氨基酸序列选自下列组中的一种：
336.a)为seq id no：32所述氨基酸序列的部分或全部；
337.b)与seq id no：32所示氨基酸的序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
338.c)与seq id no：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
339.d)具有seq id no：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
340.优选的，所述的嵌合il12b基因包含人il12b基因的全部或部分，所述的人il12b基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
341.a)为seq id no：31或seq id no：35所示的核苷酸序列的全部或部分；
342.b)与seq id no：35所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
343.c)与seq id no：35所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
344.d)具有seq id no：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
345.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合il12b基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
346.a)转录的mrna序列为seq id no：36所示的核苷酸序列的全部或部分；
347.b)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列的同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
348.c)转录的mrna序列在严格条件下，与seq id no：36所示的核苷酸序列杂交；
349.d)转录的mrna序列与seq id no：36所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
350.e)转录的mrna序列具有seq id no：36所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
351.f)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
352.g)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
353.h)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分与seq id no：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
354.i)转录的mrna序列中来源于非人动物il12b的部分为具有seq id no：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
355.j)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的核苷酸序列同一性至少为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
356.k)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分在严格条件下，与seq id no：31所示的核苷酸序列杂交；
357.l)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为与seq id no：31所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
358.m)转录的mrna序列中来源于人il12b基因的部分为具有seq id no：31所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
359.优选的，所述的嵌合il12b基因还包括特异性诱导物或阻遏物。
360.优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
361.本发明所述的非人动物为啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化改造的非人动物；进一步优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；更进一步优选的，所述的非人动物为小鼠或大鼠。
362.本发明的第三十二方面提供了一种包含上述嵌合il23a基因和/或嵌合il12b基因的构建体。
363.本发明的第三十三方面提供了一种包含上述构建体的细胞。
364.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
365.本发明的第三十四方面提供了一种包含上所述细胞的组织。
366.优选的，所述的组织不能发育成动物个体。
367.本发明的第三十五方面提供了来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的基因经遗传修饰的细胞、上述的方法获得的多基因修饰的人源化非人动物或者上述的非人动物或其后代、上述制备方法制备的荷瘤或自身免疫性疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的细胞或者上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者，在筛选、验证、评价或研究il23a和/或il12b基因功能、针对il23a和/或il12b靶位点的药物、人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
368.优选的，上述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。本发明的第三十六方面提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括给予个体候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较，其中，所述的个体选自上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含人源化il23a基因和/或人源化il12b基因的非人动物、上述的包含人源化il23a基因和/或人源化il12b基因的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或自身免疫性疾病模型。
369.优选的，所述的方法包括向个体体内移植肿瘤细胞，向移入肿瘤细胞的个体给予候选药物。
370.优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
371.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
372.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
373.优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
374.本发明的第三十七方面提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价，其中，所述的个体选自上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含人源化il23a基因和人源化il12b基因的非人动物、上述的包含人源化il23a基因和/或人源化il12b基因的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或自身免疫性疾病模型。
375.优选的，所述干预方案选自car
‑
t、药物治疗。进一步优选的，所述药物为抗体。
376.优选的，所述的评价方法不是治疗方法。该方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
377.本发明制备的il23a基因人源化非人动物、il12b基因人源化非人动物是涉及il23信号通路的非人动物模型，il23信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值。通过上述技术方案，取得了良好的技术效果，得到的人源化改造非人动物体内正常表达人il23a蛋白和/或il12b蛋白。此外，本发明得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
378.本发明所述的il23a基因人源化非人动物即人源化il23a改造非人动物，所述的人源化il12b基因改造非人动物即il12b基因人源化非人动物，所述的il23a基因和il12b基因人源化非人动物即人源化il23a基因和il12b基因改造非人动物。
379.本发明所述的“人源化il23a基因”，包含来源于人il23a基因的部分和非人il23a基因的部分。其中，所述“人il23a基因”为人il23a基因的全长核苷酸序列。所述的“人il23a基因的部分”为连续或间隔的10
‑
1060bp个核苷酸序列与人il23a基因的核苷酸序列一致；优选为10
‑
570bp、10
‑
723bp、10
‑
960bp、570
‑
1060bp、723
‑
1060bp。在本发明的一个具体实施方式中，包括连续或间隔的10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1060bp个核苷酸序列与人il23a基因的核苷酸序列一致。
380.本发明所述的“人源化il12b基因”，包含来源于人il12b基因的部分和非人il12b基因的部分。其中，所述“人il12b基因”为人il12b基因的全长核苷酸序列。所述的“人il12b基因的部分”为连续或间隔的10
‑
12000bp个核苷酸序列与人il12b基因的核苷酸序列一致；优选为10
‑
760bp、10
‑
1400bp、10
‑
5400bp、830
‑
1625bp、1625
‑
6723bp。在本发明的一个具体实施方式中，包括连续或间隔的10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、817、900、
1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000bp个核苷酸序列与人il12b基因的核苷酸序列一致。
381.本发明所述的“人源化il23a蛋白”，包含来源于人il23a蛋白的部分和非人il23a蛋白的部分。其中，所述“人il23a蛋白”为人il23a蛋白的全长氨基酸序列。所述的“人il23a蛋白的部分”为连续或间隔的3
‑
189bp个氨基酸序列与人il23a蛋白的氨基酸序列一致；优选为连续3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、189bp个氨基酸序列与人il23a蛋白的氨基酸序列一致。
382.本发明所述的“人源化il12b蛋白”，包含来源于人il12b蛋白的部分和非人il12b蛋白的部分，其中，所述“人il12b蛋白”为人il12b蛋白的全长氨基酸序列。所述的“人il12b蛋白的部分”为连续或间隔的3
‑
328bp个氨基酸序列与人il12b蛋白的氨基酸序列一致；优选为连续3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、328bp个氨基酸序列与人il12b蛋白的氨基酸序列一致。
383.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如“2号外显子至8号外显子的全部或部分”，“2号外显子至8号外显子的全部”为整体，即2号外显子至8号外显子的全部核苷酸序列；“2号外显子至8号外显子的部分”为整体的局部或整体的个体，即2号外显子至8号外显子中的一个或两个以上连续或间隔的核苷酸序列。
384.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至8号外显子”包含2号外显子、2
‑
3号内含子、3号外显子、3
‑
4号内含子、4号外显子、4
‑
5号内含子、5号外显子、5
‑
6号内含子、6号外显子、6
‑
7号内含子、7号外显子、7
‑
8号内含子、8号外显子的核苷酸序列。
385.本发明所述的“连续两个以上外显子”是指例如外显子2、3连续，外显子3、4连续，外显子4、5连续，外显子5、6连续，外显子6、7连续，外显子7、8连续，外显子2、3、4连续，外显子3、4、5连续，外显子4、5、6连续，外显子5、6、7连续，外显子6、7、8连续，也包括外显子2、3、4、5连续，外显子3、4、5、6连续，外显子4、5、6、7连续，外显子5、6、7、8连续，也包括外显子2、3、4、5、6连续，外显子3、4、5、6、7连续，外显子4、5、6、7、8连续，外显子2、3、4、5、6、7连续，外显子3、4、5、6、7、8连续，外显子2、3、4、5、6、7、8连续。
386.本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
387.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和
人序列。
388.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning:a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.
‑
in
‑
chief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
389.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠选自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
390.本发明提供了一种人源化il23a和/或il12b基因改造非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人il23a和/或il2b蛋白的核苷酸序列导入动物基因组中，从而构建出基因修饰人源化动物，该动物体内能正常表达人或人源化il23a和/或il12b蛋白。il23基因信号通路上相关基因改造的非人动物模型可作为抗人抗体、人肿瘤等疾病药物筛选的动物模型，有助于靶点的新药研发，在免疫治疗领域具有巨大应用价值。
391.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
392.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范
围。
附图说明
393.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
394.图1：小鼠il23a基因和人il23a基因对比示意图(非按比例)；
395.图2：人源化il23a小鼠基因示意图(非按比例)；
396.图3：il23a打靶策略示意图(非按比例)；
397.图4：il23a重组后细胞southern blot结果，其中wt为野生型对照；
398.图5：人源化il23a小鼠frt重组过程示意图(非按比例)；
399.图6：人源化il23af1代小鼠鼠尾pcr鉴定体细胞基因型，其中，wt为野生型，h2o为水对照，pc为阳性对照，m为marker；
400.图7：小鼠il12b基因和人il12b基因对比示意图(非按比例)；
401.图8：人源化il12b小鼠基因示意图(非按比例)；
402.图9：il12b打靶策略示意图(非按比例)；
403.图10：il12b重组后细胞southern blot结果，其中wt为野生型对照；
404.图11：人源化il12b小鼠frt重组过程示意图(非按比例)；
405.图12：人源化il12bf1代小鼠鼠尾pcr鉴定体细胞基因型，其中，wt为野生型，h2o为水对照，pc为阳性对照，m为marker；
406.图13：il23a/il12b双重人源化小鼠体内il12b蛋白表达检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/+为il23a/il12b双重人源化杂合子小鼠；
407.图14：il23a/il12b双重人源化小鼠体内il23a蛋白表达检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为il23a/il12b双重人源化纯合子小鼠；
408.图15：脾脏中白细胞亚型检测结果，其中c57bl/6为野生型c57bl/6小鼠，b
‑
hil23/hil12b为il23a/il12b基因人源化小鼠；
409.图16：脾脏中t细胞亚型检测结果，其中c57bl/6为野生型c57bl/6小鼠，b
‑
hil23/hil12b为il23a/il12b基因人源化小鼠；
410.图17：淋巴结中白细胞亚型检测结果，其中c57bl/6为野生型c57bl/6小鼠，b
‑
hil23/hil12b为il23a/il12b基因人源化小鼠；
411.图18：淋巴结中t细胞亚型检测结果，其中c57bl/6为野生型c57bl/6小鼠，b
‑
hil23/hil12b为il23a/il12b基因人源化小鼠；
412.图19：实验结束时对照组(vasline)和模型组(imq)小鼠背部皮肤情况；
413.图20：使用il23a.il12b基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(vasline)、模型组(imq)小鼠的体重(a)、红斑评分(b)、鳞屑评分(c)和综合评分(d)统计图；
414.图21：对照组(vasline)和模型组(imq)he染色结果；
415.图22：对照组(vasline)和模型组(imq)小鼠背部皮肤表皮厚度(a)与组织学评分统计图(b)；
416.图23：使用il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠，在空白对照组(g1)、咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g2)、抗人il23a抗体risankizumab给药组(g3)和抗人il23a抗体
ab1给药组(g4)小鼠的体重统计图；
417.图24：用il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠，在空白对照组(g1)、咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g2)、抗人il23a抗体risankizumab给药组(g3)和抗人il23a抗体ab1给药组(g4)小鼠的银屑病样皮损处红斑评分统计图；
418.图25：用il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠，在空白对照组(g1)、咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g2)、抗人il23a抗体risankizumab给药组(g3)和抗人il23a抗体ab1给药组(g4)小鼠的银屑病样鳞屑评分统计图；
419.图26：用il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠，在空白对照组(g1)、咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(g2)、抗人il23a抗体risankizumab给药组(g3)和抗人il23a抗体ab1给药组(g4)小鼠的综合pasi评分统计图；
420.图27：流式分析策略图。
具体实施方式
421.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
422.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
423.c57bl/6小鼠和flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
424.lipopolysaccharides from escherichia coli o111:b4(lps)购自merck，货号为l2630；
425.ecorv、asei、hindiii、kpni酶购自neb，货号分别为r3195m、r0526m、r3104m、r3142m；
426.legend max
tm
mouse il
‑
23(p19/p40)elisa kit购自biolegend，货号为433707；
427.legend max
tm
human il
‑
23elisa kit购自biolegend，货号为437607；
428.abclonalmouse il
‑
12/il
‑
23p40 elisa kit购自abclonal，货号为rk00017；
429.abclonalhuman il
‑
12/il
‑
23p40 elisa kit购自abclonal，货号为rk00013；
430.brilliant violet 510
tm
anti
‑
mouse cd45购自biolegend，货号103138；
431.pe/cy
tm
7mouse anti
‑
mouse nk1.1购自biolegend，货号552878；
432.fitc anti
‑
mouse cd19购自biolegend，货号115506；
433.percp/cy5.5 anti
‑
mouse tcrβchain购自biolegend，货号109228；
434.apc hamster anti
‑
mouse tcrβchain购自bd pharmingen，货号553174；
435.pe anti
‑
mouse cd8a购自biolegend，货号100708；
436.brilliant violet 421
tm
anti
‑
mouse cd4购自biolegend，货号100438；
437.pe anti
‑
mouse/human cd11b购自biolegend，货号101208；
438.percp anti
‑
mouse ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)antibody购自biolegend，货号108426；
439.brilliant violet 605
tm
anti
‑
mouse cd11c购自biolegend，货号117334；
440.apc anti
‑
mouse/rat foxp3购自ebioscience，货号17
‑
5773
‑
82；
441.fitc anti
‑
mouse f4/80购自biolegend，货号123108；
442.zombie nir
tm
fixable viability kit购自biolegend，货号423106；
443.purified anti
‑
mouse cd16/32购自biolegend，货号101302。
444.实施例1 il23a基因人源化小鼠
445.本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人il23a蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化il23a蛋白。小鼠il23a基因(ncbi gene id：83430，primary source：mgi：1932410，uniprot id：q9eq14，位于10号染色体nc_000076.6的第128296140至128298084位，基于转录本nm_031252.2(seq id no：1)及其编码蛋白np_112542.1(seq id no：2))和人il23a基因(ncbi gene id：51561，primary source：hgnc:15488，uniprot id：q9npf7，位于12号染色体nc_000012.12的第56334159至56340410位，基于转录本nm_016584.3(seq id no：3)及其编码蛋白np_057668.1(seq id no：4))对比示意图如图1所示。
446.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源il23a基因座引入人il23a的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化il23a蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源il23a基因座上用人il23a基因序列替换小鼠il23a基因序列，如将小鼠il23a基因的1号外显子部分序列至4号外显子部分序列的1177bp序列用对应的人dna序列替换，得到人源化il23a基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠il23a基因的人源化改造。
447.如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠il23a基因的上游和下游的同源臂序列(包含内源il23a基因5’utr及其上游的5036bp和3’utr下游的共4422bp的小鼠dna)，以及包含人il23a基因序列的il23a
‑
a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000076.6的第128303008至128297973位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：6)与ncbi登录号为nc_000076.6的第128295600至128291179位核苷酸序列相同；il23a
‑
a片段上包含人il23a的1号外显子部分序列至4号外显子部分序列的基因组dna片段(seq id no：7)，该dna片段与ncbi登录号为nc_000012.12的第56339045至56340104位核苷酸序列相同；il23a
‑
a片段中人il23a与鼠3’utr的连接设计为的连接设计为其中序列“cctaa”的最后一个“a”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“g”是小鼠3’utr的第一个核苷酸。
448.改造后的人源化小鼠il23a的mrna序列如seq id no：9所示，表达的蛋白序列与seq id no：4所示的人il23a蛋白相同。靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠基因座的连接设计为计为其中序列“tgtct”的最后一个“t”是小鼠的最后一个核苷酸，序列的“g”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为
其中序列的最后一个“t”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“cagcc”的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。
449.载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用ecorv或asei或hindiii消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)检测，结果见如图4所示，检测结果表明12个经pcr验证为阳性的克隆中，除1
‑
a03、1
‑
a07、1
‑
f03、2
‑
c02之外，其余8个克隆均为阳性克隆且无随机插入，具体阳性克隆编号为1
‑
d08、2
‑
d06、2
‑
e02、2
‑
f02、2
‑
f04、2
‑
g03、2
‑
g05、2
‑
b09。
450.表1：具体探针及目的片段长度
[0451][0452][0453]
其中，pcr测定包括下述引物：
[0454]
il23a
‑
f1：5
’‑
cggaatgccaccggggacaaac
‑3’
(seq id no：12)，
[0455]
il23a
‑
r1：5
’‑
tgaaagctgctggcactgagtc
‑3’
(seq id no：13)；
[0456]
il23a
‑
f2：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga
‑3’
(seq id no：14)，
[0457]
il23a
‑
r2：5
’‑
cccaaactcctccttcatctcctg
‑3’
(seq id no：15)；
[0458]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0459]
il23a
‑5’
探针(il23a
‑5’
probe)：
[0460]
il23a
‑5’
probe
‑
f：5
’‑
ggtttgaaagacccagctaactc
‑3’
(seq id no：16)，
[0461]
il23a
‑5’
probe
‑
r：5
’‑
ggagggtgtgactccggtct
‑3’
(seq id no：17)；
[0462]
il23a
‑3’
探针(il23a
‑3’
probe)：
[0463]
il23a
‑3’
probe
‑
f：5
’‑
tcaatggcaactcctggtcg
‑3’
(seq id no：18)，
[0464]
il23a
‑3’
probe
‑
r：5
’‑
gccagatgtggctagtgcctc
‑3’
(seq id no：19)；
[0465]
il23a
‑
neo探针(il23a
‑
neo probe)：
[0466]
il23a
‑
neo probe
‑
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagatgg
‑3’
(seq id no：20)，
[0467]
il23a
‑
neo probe
‑
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
(seq id no：21)。
[0468]
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化il23a基因纯
合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为f1
‑
01的小鼠为阳性杂合小鼠。
[0469]
表2：引物名称及具体序列
[0470][0471][0472]
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化il23a基因工程小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人il23a蛋白的表达情况，如elisa等。鉴定结果显示，在人源化il23a基因杂合子小鼠中检测到了人il23a和鼠il23a的表达，在野生型c57bl/6小鼠中只检测到鼠il23a的表达。
[0473]
实施例2 il12b基因人源化小鼠
[0474]
本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人il12b蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化il12b蛋白。小鼠il12b基因(ncbi gene id：16160，primary source：mgi：96540，uniprot id：p43432，位于11号染色体nc_000077.6的第44440063至44414677位，基于转录本nm_001303244.1(seq id no：29)及其编码蛋白np_001290173.1(seq id no：30))和人il12b基因(ncbi gene id：3593，primary source：hgnc:5970，uniprot id：p29460，位于5号染色体nc_000005.10的第159314783至159330887位，基于转录本nm_002187.3(seq id no：31)及其编码蛋白np_002178.2(seq id no：32))对比示意图如图7所示。
[0475]
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠il12b基因座引入人il12b的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化il12b蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源il12b基因座上用人il12b基因序列替换小鼠il12b基因序列，如将至少包含小鼠il12b基因的2号外显子至8号外显子的约10kb序列用对应的人dna序列替换，得到人源化il12b基因序列(示意图如图8所示)，实现对小鼠il12b基因的人源化改造。
[0476]
如图9所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠il12b基因的上游内源il12b基因1号外显子及其上游3842bp序列)和下游的同源臂序列(8号外显子下游共4602bp的小鼠dna序列)，以及包含编码人il12b序列的il12b
‑
a片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：33)与ncbi登录号为nc_000077.6的第44400195至44404036位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：34)与ncbi登录号为nc_000077.6的第44414335至44418936位核苷酸序列相同；il12b
‑
a片段含有人il12b的2号外显子序列
至8外显子序列的基因组dna(seq id no：35)，该dna序列与ncbi登录号为nc_000005.10的第159326782至159314313位核苷酸序列相同。
[0477]
改造后的人源化小鼠il12b的mrna序列如seq id no：36所示，表达的蛋白序列与seq id no：32相同。靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒位于人il12b的第8号外显子下游，其5’端与人il12b序列的连接设计为il12b序列的连接设计为il12b序列的连接设计为其中序列“cactc”的最后一个“c”是人的最后一个核苷酸，序列的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒3’端与鼠il12b序列的接合设计为端与鼠il12b序列的接合设计为端与鼠il12b序列的接合设计为其中序列的“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“cataa”的“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。
[0478]
载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用kpni或ecorv或sspi消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)检测，结果见如图10所示，检测结果表明9个经pcr验证为阳性的克隆中，1
‑
b6、1
‑
e5、2
‑
a3、2
‑
d7为阳性杂合克隆且无随机插入。
[0479]
表3：具体探针及目的片段长度
[0480]
限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小kpniil12b
‑5’
probe14.5kb6.0kbecorvil12b
‑3’
probe22.4kb14.8bsspiil12b
‑
neo probe——10.1kb
[0481]
其中，pcr测定包括下述引物：
[0482]
il12b
‑
f1：5
’‑
catcagaccaggcagctcgcagc
‑3’
(seq id no：39)，
[0483]
il12b
‑
r1：5
’‑
cccaagagtcctggcttagaagtg
‑3’
(seq id no：40)；
[0484]
il12b
‑
f2：5
’‑
aactgttcgccaggctcaag
‑3’
(seq id no：41)，
[0485]
il12b
‑
r2：5
’‑
ggggctgcccatattggtcttgc
‑3’
(seq id no：42)；
[0486]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0487]
il12b
‑5’
探针(il12b
‑5’
probe)：
[0488]
il12b
‑5’
probe
‑
f：5
’‑
tatgtctagctcagttcatgctg
‑3’
(seq id no：43)，
[0489]
il12b
‑5’
probe
‑
r：5
’‑
tacagagggaatatagacgtcga
‑3’
(seq id no：44)；
[0490]
il12b
‑3’
探针(il12b
‑3’
probe)：
[0491]
il12b
‑3’
probe
‑
f：5
’‑
cccaacaacttcccacaaagg
‑3’
(seq id no：45)，
[0492]
il12b
‑3’
probe
‑
r：5
’‑
cagctattgccagcgatccgg
‑3’
(seq id no：46)；
[0493]
il12b
‑
neo探针(il12b
‑
neo probe)：
[0494]
il12b
‑
neo probe
‑
f：(seq id no：20)，
[0495]
il12b
‑
neo probe
‑
r：(seq id no：21)。
[0496]
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图11)后，再通过互相交配即可得到人源化il12b基因纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表4所示)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图12，其中，编号为f1
‑
01的小鼠为阳性杂合小鼠。
[0497]
表4：引物名称及具体序列
[0498][0499]
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化il12b基因工程小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人il12b蛋白的表达情况，如elisa等。鉴定结果显示，在人源化il12b基因杂合子小鼠体内检测到了鼠il12b蛋白和人il12b蛋白的表达，在野生型c57bl/6小鼠体内仅检测到鼠il12b蛋白的表达。
[0500]
实施例3双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
[0501]
利用本方法或制得的il23a、il12b小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有il12b、tnf
‑
α、il17、pd
‑
1、pd
‑
l1、ox40l等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化il23a和/或il12b小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得il23a和/或il12b与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的il23a和/或il12b小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化il23a和/或il12b与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人il23a和/或il12b和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0502]
以双重人源化il23a/il12b小鼠为例，由于鼠il23a与il12b基因分别位于10号和11号染色体上，选择人源化il23a小鼠与人源化il12b小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，
最终得到il23a/il12b双重人源化小鼠。
[0503]
可通过常规检测方法确认il23a/il12b双重人源化小鼠体内人il23a蛋白和il12b蛋白的表达情况，如elisa等。
[0504]
il12b蛋白的检测：选择10周龄野生型小鼠和il23a/il12b双重人源化杂合子小鼠各3只，给每只小鼠腹腔注射20μg细菌脂多糖(lps)，2h后取血清，稀释3倍后使用elisa试剂盒(abclonal mouse il
‑
12/il
‑
23p40 elisa kit和abclonal human il
‑
12/il
‑
23p40elisa kit)检测鼠il12b和人il12b蛋白水平，鉴定结果如图13所示。从图中可以看出，在il23a和il12b双重人源化杂合子小鼠体内既能检测到鼠il12b(mil12b)蛋白(图a)，也能检测到人il12b(hil12b)蛋白的表达(图b)；但在野生型c57bl/6小鼠体内仅检测到鼠il12b蛋白的表达，不能检测到人il12b蛋白的表达。
[0505]
il23a蛋白的检测：选择6周龄野生型小鼠和11周龄il23a/il12b双重人源化纯合子小鼠各3只，分离小鼠骨髓细胞，加入含gm
‑
csf(20ng/ml)的培养基培养6天，诱导骨髓细胞分化为树突状细胞(dc)后，加入20μglps刺激24小时，之后用elisa试剂盒(legend max
tm
mouse il
‑
23(p19/p40)elisa kit和legend max
tm
human il
‑
23 elisa kit)进行检测，检测结果如图14所示。从图中可以看出，在野生型c57bl/6小鼠体内只能检测到鼠il23a(mil23a)蛋白的表达(图a)，在il23a/il12b双重人源化纯合子小鼠体内只能检测到人il23a(hil23a)蛋白的表达(图b)。
[0506]
实施例4 il23a/il12b基因人源化小鼠免疫分型
[0507]
可通过流式细胞术检测7周龄雌性野生型c57bl/6小鼠(n＝3)和实施例3制得的il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠(n＝3)脾脏和淋巴结组织中白细胞亚型和t细胞亚型的分化情况，流式分析策略图如图27所示。脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图15和图16所示，淋巴结中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图17和图18所示。
[0508]
从图中可以看出，il23a/il12b基因人源化纯合子小鼠脾脏和淋巴结中t细胞(t，图15、图17)、b细胞(b，图15、图17)、nk细胞(nk，图15、图17)、dc细胞(dc，图15)、粒细胞(gran，图15)、单核细胞(mon，图15)、巨噬细胞(图15)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠基本一致；各t细胞亚型：cd4+t细胞(cd4，图15、图16、图17、图18)、cd8+t细胞(cd8，图15、图16、图17、图18)和tregs细胞(图16、图18)等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠基本一致，表明il23a基因和il12b基因人源化改造没有影响小鼠体内白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。
[0509]
实施例5 il23a/il12b基因人源化小鼠银屑病模型
[0510]
利用上述小鼠可以诱导制备多重人类疾病模型，包括银屑病、多发性硬化等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，il23a和/或il12b基因人源化小鼠可用于评估人特异性il23信号通路药物的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。以银屑病模型的制备为例，选取本发明制备的il23a/il12b基因人源化雌性小鼠(11周龄)，按体重分为空白对照组和模型组，每组5只。实验开始时用剃毛器去除背部毛发，露出2cm
×
3cm的皮肤区域。模型组小鼠使用5％咪喹莫特(imiquimod，imq)乳膏(局部剂量83mg)每天对背部涂抹造模，连续涂抹6天，空白对照组涂抹凡士林(vasline)。
[0511]
每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红斑(erythema)及鳞屑(scales)，每项根据严重程
度分为0
‑
4分，pasi评分标准如下：0
‑
无；1
‑
轻度；2
‑
中度；3
‑
重度；4
‑
极重度，对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。实验结束时(涂抹6天后)，取小鼠背部皮肤标本切片处理后用苏木精和伊红染色(he)。对各组小鼠背部糜烂、棘突出现、角化不全、混合炎细胞浸润情况按照严重程度进行评分(0.5
‑
2分)：0.5
‑
轻微、1
‑
轻度、1.5
‑
中度、2
‑
重度；对基质细胞增生进行评分(0.5
‑
2分)：0.5为2
‑
4层、1为4
‑
6层、1.5为6
‑
8层、2为8
‑
10层；出现痂皮：0.5分。进行结果统计和组间病理学分析评分，并测量表皮厚度。
[0512]
试验结束时对照组和模型组小鼠背部皮肤情况如图19所示，模型组小鼠背部表现出明显的鳞屑表型。从小鼠体重随时间的变化情况(图20a)可知，对照组整个实验周期内体重平稳；模型组从第0天开始先下降，第2天左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异；如图20b、20c、20d所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而模型组表现出明显的银屑病表型。
[0513]
实验结束时，对照组和模型组小鼠背部皮肤he染色结果如图21所示，从图中可以看出，模型组小鼠表皮表现出角质形成细胞增殖和炎性细胞浸润；同时，根据对背部表皮厚度和组织学进行评分统计图(图22)，发现il23a/il12b基因人源化小鼠背部表皮厚度显著增加(图22a)，组织学评分也显著高于对照组(图22b)。
[0514]
以上结果表明，使用本发明的方法制备的基因人源化小鼠可以用于建立稳定的银屑病模型。
[0515]
实施例6 il23a/il12b基因人源化小鼠银屑病模型药效实验
[0516]
使用如实施例3所述的il23a/il12b基因人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特(imq)诱导的方法建立银屑病模型。取雌性小鼠按照体重分为空白对照组g1(凡士林vaseline)、模型组g2(imq)、给药组g3(imq+抗il23a抗体通用名称risankizumab，20mg/kg)、给药组g4(抗人il23a抗体ab1，使用常规方法免疫小鼠得到，参见janeway's immunobiology(9thedition)，20mg/kg)，每组5只实验动物。实验开始时用剃毛器去除各小鼠背部毛发，露出2cm
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3cm的皮肤区域。模型组和给药组使用5％的imq乳膏(局部剂量80mg)每天对背部涂抹造模，连续涂抹6天，g1组小鼠涂抹凡士林作为空白对照。具体造模及给药方案如表5所示。全部实验周期为7天。
[0517]
表5：造模及给药方案
[0518][0519][0520]
从实验开始每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。从小鼠体重情况(图23)可知，对照组整个实验周期内体重平稳；模型组、给药组体重趋势一致，均从第0天开始先下降，第2天左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中三组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图24
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26所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合pasi评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而模型组和给药组
表现出不同程度的疾病。对比模型组和给药组而言，给药组的小鼠皮肤pasi评分明显低于模型组；给药组中，抗人il23a抗体ab1治疗组小鼠背部皮肤红斑、鳞屑和综合pasi评分均低于抗人il23a抗体risankizumab治疗组。
[0521]
以上结果表明，本发明获得的il23a/il12b基因人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估不同的针对人il23a抗体的体内功效。
[0522]
上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病动物模型，以评估针银屑病治疗药物的体内功效。
[0523]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0524]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0525]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。