益生菌胞外泌体及其用途的制作方法

1.本公开涉及一种微生物分泌的胞外泌体及其用途；更具体地，本公开涉及一种益生菌分泌的胞外泌体及其用于抑制致病菌生长及改善免疫相关疾病的用途。


背景技术：

2.细胞与细胞间、细胞与微生物间及微生物与微生物间的沟通方式主要可通过细胞或微生物分泌的胞外泌体(extracellular vesicles，evs)中所携带的信息分子，包含蛋白质、小片段rna(small rna)、微小rna(microrna)、dna、脂质等进行交互作用来达成(th
é
ry et al.，2002；toyofuku et al.，2017；brown et al.，2015)。
3.用以调节肠道菌相及肠道功能的益生菌也会分泌胞外泌体。由肠道菌群所产生的胞外泌体携带有许多消化酶及多样的化合物，可借以改变肠道屏障(intestinal barrier)的信息分子，进而影响器官功能(et al.，2016)。另有研究指出，与对照组相较，以葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，dss)所诱导肠炎小鼠粪便中的微生物群(microbiota)组成与胞外泌体组成均有显著性改变，包含来自艾克曼嗜粘蛋白菌(akkermansia muciniphila)及产酸拟杆菌(bacteroides acidifaciens)的胞外泌体数量下降，而来自特定细菌的胞外泌体则增加(kang et al.，2013)，此显示肠道次世代益生菌所产生的胞外泌体具有调控肠道免疫平衡的潜力。然而，目前仅有极为少数研究对益生菌的胞外泌体进行功能评估。


技术实现要素：

4.本公开提供一种源自益生菌的胞外泌体，其具有免疫调控作用及抑制致病菌生长的功效。在本公开的一些具体实施例中，该胞外泌体源自于选自由罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)gkr1、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gkm3、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)gkf3、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gks6及乳酸双岐杆菌(bifidobacterium lactis)gkk2所组成的组中的至少一种微生物。
5.在本公开的一些具体实施例中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)gkr1在2018年2月12日保藏于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为bcrc 910827；以及在2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc 15201。植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gkm3在2017年7月14日保藏于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为bcrc 910787；以及在2017年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc 14565。发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)gkf3在2018年2月12日保藏于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为bcrc 910824；以及在2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc 15203。副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gks6在2017年7月14日保藏于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为bcrc 910788；以及在2017年8月
25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc 14566。乳酸双岐杆菌(bifidobacterium lactis)gkk2在2018年2月12日保藏于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为bcrc910826；以及在2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc 15205。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
6.在本公开的一些具体实施例中，益生菌的胞外泌体呈圆球状。在本公开的一些具体实施例中，益生菌的胞外泌体另具有双层膜构造，其粒径大小介于50nm至180nm之间，例如平均粒径约为60nm、约为70nm、约为80nm、约为100nm、约为120nm、约为140nm、约为150nm、约为160nm或约为170nm。
7.在本公开的一些具体实施例中，益生菌的胞外泌体内含浓度介于40ng/μl至180ng/μl的dna、浓度介于35ng/μl至150ng/μl的rna、以及浓度介于55μg/ml至120μg/ml的蛋白质。在本公开的一些具体实施例中，益生菌胞外泌体内含的dna浓度约为50ng/μl、约为60ng/μl、约为70ng/μl、约为80ng/μl、约为90ng/μl、约为100ng/μl、约为110ng/μl、约为120ng/μl、约为130ng/μl、约为140ng/μl、约为150ng/μl、约为160ng/μl或约为170ng/μl。在本公开的一些具体实施例中，益生菌胞外泌体内含的rna浓度约为40ng/μl、约为50ng/μl、约为60ng/μl、约为70ng/μl、约为80ng/μl、约为90ng/μl、约为100ng/μl、约为110ng/μl、约为120ng/μl、约为130ng/μl或约为140ng/μl。在本公开的一些具体实施例中，益生菌胞外泌体内含的蛋白质浓度约为60μg/ml、约为70μg/ml、约为80μg/ml、约为90μg/ml、约为100μg/ml或约为110μg/ml。
8.在本公开的一些具体实施例中，益生菌的胞外泌体所内含的rna中，小片段rna(small rna)的比例介于40％至70％，例如约45％、约50％、约55％、约60％或约65％。
9.本公开还提供上述益生菌的胞外泌体用于制备抑制有其需要的个体中致病菌生长的药物的用途，包括向个体施用有效量的胞外泌体。在本公开的一些具体实施例中，胞外泌体抑制致病菌(例如，金黄色葡萄球菌或艰难梭状杆菌)的生长。
10.本公开还提供上述益生菌的胞外泌体用于制备预防或治疗有其需要的个体中的免疫相关疾病的药物的用途，包括向个体施用有效量的胞外泌体。在本公开的一些具体实施例中，免疫相关疾病为炎症性疾病或过敏，例如气管反应过度或炎症、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻疹、血管性水肿、花粉热、食物过敏、药物过敏及气喘。
11.在本公开的一些具体实施例中，前述的胞外泌体可促进个体内一氧化氮及/或细胞因子的生成，例如，胞外泌体可促进抗炎相关细胞因子及th1相关细胞因子的生成。在本公开的一些具体实施例中，胞外泌体可促进选自tnf-α、il-4、il-6、il-10及il-12p40所组成的组中的至少一种细胞因子。
12.在本公开的一些具体实施例中，胞外泌体经口服或非经肠道的途径施用至个体。在本公开的一些具体实施例中，胞外泌体配制为选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶及胶囊所组成的组中的口服剂型以施用至个体。
13.本公开提供了一种源自益生菌的胞外泌体及其用途，该胞外泌体不仅可抑制致病
菌的生长，还具有免疫调节效果，因而有利于预防或治疗细菌感染及/或免疫相关疾病。
14.本公开的一个或多个具体实施例的细节如下所阐述。本公开的其他特征或优点将从下述附图、具体实施例，以及所附权利要求书的详细描述中而为显而易见。
15.生物材料保藏
16.罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)gkr1：食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，2018年2月12日，编号为bcrc 910827；以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，2018年1月12日，保藏编号为cgmcc 15201。
17.植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gkm3：食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，2017年7月14日，编号为bcrc 910787；以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，2017年8月25日，保藏编号为cgmcc 14565。
18.发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)gkf3：食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，2018年2月12日，编号为bcrc 910824；以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，2018年1月12日，保藏编号为cgmcc 15203。
19.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)gks6：食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，2017年7月14日，编号为bcrc 910788；以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，2017年8月25日，保藏编号为cgmcc 14566。
20.乳酸双岐杆菌(bifidobacterium lactis)gkk2：食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，2018年2月12日，编号为bcrc910826；以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，2018年1月12日，保藏编号为cgmcc 15205。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
21.图1a至图1e显示本公开的益生菌胞外泌体的透射电子显微镜影像图，其中图1a至图1e分别表示源自菌株a至菌株e的胞外泌体。
22.图2a至图2e显示以纳米粒子追踪分析仪测定本公开的益生菌胞外泌体的粒径分布图，其中图2a至图2e分别表示源自菌株a至菌株e的胞外泌体。
23.图3a至图3e显示以纳米粒子追踪分析仪测定本公开的益生菌胞外泌体的布朗运动影像图，其中图3a至图3e分别表示源自菌株a至菌株e的胞外泌体。
24.图4a至图4d显示经本公开不同浓度的益生菌胞外泌体处理的金黄色葡萄球菌的生长曲线，其中图4a至图4d分别表示经源自菌株a、菌株b、菌株c及菌株e的胞外泌体处理。
25.图5a至图5d显示经本公开不同浓度的益生菌胞外泌体处理12小时后的金黄色葡萄球菌的生长情形，其中图5a至图5d分别表示经源自菌株a、菌株b、菌株c及菌株e的胞外泌体处理；*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001。
26.图6a至图6e显示经本公开不同浓度的益生菌胞外泌体处理的艰难梭状杆菌的生长曲线，其中图6a至图6e分别表示经源自菌株a至菌株e的胞外泌体处理。
27.图7a至图7e显示经本公开不同浓度的益生菌胞外泌体处理12小时后的艰难梭状杆菌的生长情形，其中图7a至图7e分别表示经源自菌株a至菌株e的胞外泌体处理；*p《0.05、***p《0.001。
28.图8显示本公开的益生菌胞外泌体对于促进免疫细胞生成一氧化氮(no)的影响，其中a、b及e分别表示源自菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体样品，0为未经胞外泌体处理的对照组；不同的英文字母符号(a、c、bc)各自表示p《0.05。
29.图9a和图9b分别显示本公开的益生菌胞外泌体对于促进免疫细胞释放细胞因子tnf-α及il-6的影响，其中a、b及e分别表示源自菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体样品，0为未经胞外泌体处理的对照组；不同的英文字母符号(a、b、c、d)各自表示p《0.05。
30.图10显示本公开的益生菌胞外泌体对于促进免疫细胞释放细胞因子il-10的影响，其中a、b及e分别表示源自菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体样品，0为未经胞外泌体处理的对照组；不同的英文字母符号(a、b、c、e)各自表示p《0.05。
31.图11显示本公开的益生菌胞外泌体对于促进免疫细胞释放细胞因子il-4的影响，其中a、b及e分别表示源自菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体样品，0为未经胞外泌体处理的对照组；不同的英文字母符号(a、b、c)各自表示p《0.05。
32.图12显示本公开的益生菌胞外泌体对于促进免疫细胞释放细胞因子il-12p40的影响，其中a、b及e分别表示源自菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体样品，0为未经胞外泌体处理的对照组；不同的英文字母符号(a、b、d)各自表示p《0.05。
具体实施方式
33.以下具体实施例用于举例说明本公开的技术内容。基于本公开说明书的内容，所属技术领域技术人员可以想到本公开的其他优点。本公开还可以不同于实施例中所描述的方式实现或应用。对于不同的实施方案和应用，可以在不背离本文公开的范围下，修改及/或改变用于执行本公开的实施例。此外，本文所有范围和数值皆为包含及可合并的。落在本文中所述范围内的任何数值或点，例如任何整数，都可以作为最小值或最大值以导出下位的范围。
34.除非本文中另有说明，否则说明书及所附权利要求中所使用的单数形式“一”及“该”包括多数个体，以及术语“或”包括“及/或”的含义。
35.本公开提供一种源自于微生物的胞外泌体及其于改善细菌感染和免疫相关疾病的用途。如本文中所使用，术语“胞外泌体”或“ev”是指源自于细菌的组合物，可携带大量细菌脂质、蛋白质及/或核酸。在本公开的至少一个实施例中，微生物的胞外泌体源自于选自罗伊氏乳杆菌gkr1、植物乳杆菌gkm3、发酵乳杆菌gkf3、副干酪乳杆菌gks6、乳酸双岐杆菌gkk2及其任意组合所组成的组中的至少一种益生菌。
36.在本公开的一些具体实施例中，本公开源自于益生菌的胞外泌体可存在于医药组合物中而施用至有其需要的个体中，以用于抑制致病菌生长及/或预防或治疗免疫相关疾病。在本公开的一些具体实施例中，该医药组合物包含有效量的胞外泌体及其药学上可接受的载体。
37.如本文中所使用，术语“施用”、“施药”或“给药”是指向个体施用胞外泌体或包含其的医药组合物，从而产生期望的效果。本文中所述施用途径的实施例包括口服或非经肠道的途径，例如口服施药、直肠施药、局部施药、经鼻吸入、经皮给药或注射施用。通过注射进行的施药包括腹膜内、静脉内、肌肉内及皮下施药。
38.如本文中所使用，术语“免疫相关疾病”是指由免疫系统的活性所引起的任何疾
病、病症或症状，其包括气管反应过度或炎症、异位性皮肤炎、过敏结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性肺炎、外因性过敏性肺泡炎、荨麻疹、血管性水肿、花粉热、食物过敏、药物过敏及气喘，但不限于此。
39.如本文中所使用，术语“致病菌”是指导致生物体生病的病原菌，致病菌大部分为革兰氏阳性细菌，其中，作为双球状细菌的代表性病原菌为链球菌属(streptococcus)和葡萄球菌属(staphylococcus)；作为杆状细菌的代表性病原菌为不形成孢子(spore)的棒状杆菌属(corynebacterium)和李斯特菌属(listeria)，以及形成孢子的芽孢杆菌属(bacillus)与梭菌属(clostridium)等。
40.如本文中所使用，术语“治疗”是指尝试获得期望的药理学及/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，或者对于完全或部分治愈、减轻、缓解、补救、改善疾病或归因于该疾病的不利影响而言，该效果可以是治疗性的。
41.如本文中所使用，术语“有效量”是指在个体上赋予期望的药理学及/或生理学效果(例如，抑制致病菌生长)所需的胞外泌体的量。如本领域的技术人员所知，有效的剂量将根据给药的途径、赋形剂的使用、与其他治疗方法共同使用的可能性及待治疗的病症而可能有所变化。
42.在本公开的一些具体实施例中，本公开的益生菌胞外泌体于抑制致病菌生长及/或预防或治疗免疫相关疾病的用途包括向有需要的个体施用有效量的胞外泌体，其中，该胞外泌体的有效量可为1.0
×
105至1.0
×
10
10
个胞外泌体颗粒，例如，该有效量可为2.0
×
105至9.0
×
109个胞外泌体颗粒、5.0
×
105至5.0
×
108个胞外泌体颗粒、1.0
×
106至5.0
×
108个胞外泌体颗粒或1.0
×
106至1.0
×
107个胞外泌体颗粒。在本公开的一些具体实施例中，本公开的医药组合物可包含1.0
×
105至1.0
×
10
10
个益生菌的胞外泌体，例如，2.0
×
105个、5.0
×
105个、1.0
×
106个、2.0
×
106个、5.0
×
106个、1.0
×
107个、2.0
×
107个、5.0
×
107个、1.0
×
108个、2.0
×
108个及5.0
×
108个胞外泌体颗粒。
43.在本公开的一些具体实施例中，该医药配制品进一步包括药学上可接受的载体。医药组合物中的载体为药学上“可接受的”是指其与组合物中的胞外泌体相容，且对待治疗的个体无害。药学上可接受的载体的示例包括稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、助溶剂、表面活性剂或其任意组合，但不限于此。
44.如本文中所使用，术语“个体”或“受试者”可互换使用，其是指任何动物；在本公开的一些具体实施例中，也可称为“患者”或“病患”。描述为“有需要的”受试者或个体是指需要治疗疾病的受试者或个体。个体的示例包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔、仓鼠、牛、马、猪、鹿、狗、猫、狐狸、狼、鸡、食火鸡、鸵鸟、和鱼。在本公开的一些具体实施例中，个体可为哺乳动物，如灵长类动物，例如人。在本公开的一些具体实施例中，受试者或个体可为健康的，或可患有处于任何发展阶段的免疫病症或细菌感染。
45.以下通过特定的具体实施例进一步说明本公开的特点及功效，但非用于限制本公开的范围。
46.实施例
47.实施例1：益生菌的培养
48.将5种益生菌株a至e(参见下表一)的菌粉分别接种至mrs(de man、rogosa&sharpe)培养基中，以37℃培养于培养箱(roi-53cv，展钰仪器有限公司，台湾)中12小时，之
后取1％菌液至新的mrs培养基中，并于37℃培养12小时，再以分光光度计(synergy 2，biotek，winooski，vermont)测量其于波长600nm的吸光值(od
600 nm)。当od
600
达0.7以上时，取0.5％的菌液至200ml的mrs培养基中，并于37℃培养24小时后进行胞外泌体分离。
49.表一、益生菌株a至菌株e的列表
[0050][0051]
实施例2：益生菌胞外泌体的分离
[0052]
将经培养的益生菌菌体于4℃以10,000g转速离心15分钟，取出上清液，并以0.22μm滤膜(millex-gp，merck，cork，ireland)过滤后进行超高速离心4小时。去除上清液后，以磷酸盐缓冲液回溶，并再次以超高速离心2小时。去除上清液后，保存于-80℃冷冻机(forma900series，thermo scientific，waltham，ma)备用。
[0053]
实施例3：益生菌胞外泌体的形态观察
[0054]
5种益生菌胞外泌体经适当稀释后，各取10μl滴至滤纸上的镀碳铜网，经干燥后，以透射电子显微镜(transmission electron microscope)(jem-2100f，jeol，昭岛市，日本)观察益生菌胞外泌体的形态及大小。
[0055]
结果如图1a至图1e所示，5种益生菌的胞外泌体大小约介于50纳米(nm)至150纳米，外观呈圆球状，且具双层膜构造。
[0056]
实施例4：益生菌胞外泌体的粒径分布与浓度分析
[0057]
针对所收集的5种益生菌胞外泌体，以纳米粒子追踪分析仪(nanosight lm10-hs，malvern instruments，worcestershire，uk)进行布朗运动轨迹分析，借以测量胞外泌体的粒径大小与浓度。图2a至图2e以及图3a至图3e分别显示5种益生菌胞外泌体的粒径分布与布朗运动影像图，下表二则显示益生菌胞外泌体的浓度与粒径大小。
[0058]
表二、益生菌胞外泌体的浓度与平均粒径
[0059]
[0060]
由上可知，菌株a与菌株e能分离出较高浓度的胞外泌体，自菌株c所分离出的胞外泌体则浓度最低。此外，菌株b至菌株e的胞外泌体粒径大小主要分布在约120nm至约140nm之间，而菌株a的胞外泌体的平均粒径则为170.0nm，于其中属较大的粒径，且菌株a也是5种菌株中释放胞外泌体浓度最高的菌株。
[0061]
实施例5：益生菌胞外泌体的蛋白质与核酸浓度分析
[0062]
(1)益生菌胞外泌体的蛋白质浓度分析
[0063]
先将标准品牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)稀释至浓度1,000、750、500、250、100、75及50mg/ml，接着取4μl不同浓度的标准品与益生菌胞外泌体分别加入至96孔板中，再于各孔中加入200μl的布拉德福试剂(bradford reagent)，并静置5至50分钟，而后以分光光度计(synergy 2，biotek，winooski，vermont)测量各孔于波长595nm下的吸光值(od
595
)。利用标准品的浓度与吸光值做成标准曲线，并将各益生菌胞外泌体样品的吸光值代入曲线的公式以推算出样品的蛋白质浓度。
[0064]
(2)益生菌胞外泌体的总dna与总rna的浓度分析
[0065]
益生菌胞外泌体中dna与rna的总量是利用纳米液滴分析法(nanodrop assay)进行测量。具体地，取2μl的益生菌胞外泌体至超微量分光光度计(nd-lite，thermo scientific，waltham，ma)的测量平台上，盖上上盖后静待数秒，即可测得胞外泌体中总dna及总rna的浓度。
[0066]
(3)益生菌胞外泌体的大片段rna(long rna)与小片段rna(small rna)的浓度分析
[0067]
使用qubit检测试剂盒(thermo scientific，waltham，ma)进行测量。具体地，将试剂盒中的试剂与缓冲液以1μl比199μl的比例配制测量溶液，接着取适量的益生菌胞外泌体样品加上配制好的测量溶液共200μl，于离心管中混合均匀，静置后将离心管置于荧光定量仪(q33226，thermo fisher scientific，waltham，ma)内，测定大片段rna与小片段rna的浓度。
[0068]
上述益生菌胞外泌体中蛋白质及核酸浓度的测量结果显示于下表三。
[0069]
表三、益生菌胞外泌体的核酸与蛋白质浓度
[0070][0071]
自不同菌株所分离出益生菌胞外泌体中的蛋白质、dna及rna含量皆不同，对应各样品的胞外泌体浓度(即表二所示者)，将上述蛋白质及核酸的测量结果换算为于108个益生菌胞外泌体颗粒时的核酸及蛋白质含量以相互比较。换算结果显示于下表四，其中，菌株b及菌株c的胞外泌体具有较高的核酸浓度(od
260/280
)，而菌株c的胞外泌体则具有较高的蛋
白质浓度。
[0072]
表四、益生菌胞外泌体的核酸与蛋白质换算浓度
[0073][0074]
此外，下表五显示以qubit进行益生菌胞外泌体的小片段rna比例的分析结果，5种益生菌胞外泌体中的大片段rna浓度约为6.88至19.70ng/μl，而小片段rna浓度则约为5.32至45.50ng/μl，亦即，小片段rna的比例约落在40％至70％之间。
[0075]
表五、益生菌胞外泌体的微小核醣核酸比例
[0076][0077]
实施例6：益生菌胞外泌体抑制金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，s.aureus)的生长
[0078]
将s.aureus冻管(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心)接种至bhi(brain heart infusion)培养基中，在37℃震荡培养8小时后，取1％的菌液到新的bhi培养基中，再经37℃震荡培养10小时后，取200μl菌液至96孔板中，利用分光光度计(synergy2，biotek，winooski，vermont)测量其于波长600nm的吸光值。当od
600
达1.70至1.75之间时，取1％的菌液至含不同浓度的益生菌胞外泌体的bhi培养基中，而后取200μl的培养液至96孔板中，于37℃震荡培养，并于培养0、3、6、9、10、11、12小时的各时间点以分光光度计(synergy 2，biotek，winooski，vermont)测定于波长600nm的吸光值。
[0079]
图4a至图4d为金黄色葡萄球菌分别以不同浓度的益生菌胞外泌体处理后的生长曲线，图5a至图5d则为金黄色葡萄球菌分别以不同浓度的益生菌胞外泌体处理12小时后的od
600
值，其中，菌株a、菌株b、菌株e的胞外泌体样品的浓度为105、107或109个颗粒/ml，而菌株c由于胞外泌体浓度较低(如表二所示)，故菌株c的胞外泌体样品的浓度为106或108个颗粒/ml。结果显示，菌株a及菌株e的胞外泌体显著抑制金黄色葡萄球菌的生长，且呈剂量依
赖性。
[0080]
实施例7：益生菌胞外泌体抑制艰难梭状芽孢杆菌(clostridium difficile，c.difficile)的生长
[0081]
将c.difficile冻管(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心)接种至bhi培养基中，在37℃厌氧下培养约16小时后，取100μl菌液至96孔板中，以分光光度计(multiskan go，thermo scientific，waltham，ma)测量其于波长600nm的吸光值(od
600
)。当od
600
达约0.13至0.14时，取1％的菌液到含不同浓度益生菌胞外泌体的bhi培养基中，在37℃厌氧下培养12小时，并于培养0、3、6、9、10.5、12小时的各时间点取100μl的培养液至96孔板中，利用分光光度计(multiskan go，thermo scientific，waltham，ma)测量od
600
值。
[0082]
图6a至图6e为艰难梭状杆菌分别以不同浓度的益生菌胞外泌体处理后的生长曲线，图7a至图7e则为艰难梭状杆菌分别以不同浓度的益生菌胞外泌体处理12小时后的od
600
值，其中，菌株a、菌株b、菌株d、菌株e的胞外泌体样品的浓度为105、107或109个颗粒/ml，而菌株c由于胞外泌体浓度较低(如表二所示)，故菌株c的胞外泌体样品的浓度为106或108个颗粒/ml。
[0083]
结果显示，菌株b及菌株e的胞外泌体显著抑制艰难梭状杆菌的生长，且呈剂量依赖性；具体地，浓度为109个颗粒/ml的菌株b的胞外泌体对艰难梭状杆菌的抑制百分比为95.6％；浓度为107个颗粒/ml及109个颗粒/ml的菌株e的胞外泌体对艰难梭状杆菌的抑制百分比分别为66.8％及97.3％。菌株a、菌株c、菌株d的胞外泌体对艰难梭状杆菌的生长亦有抑制趋势，其浓度于109个颗粒/ml时的抑制百分比分别为52.9％、67.5％及33.4％。
[0084]
实施例8：益生菌胞外泌体调节免疫细胞的一氧化氮(no)生成量
[0085]
为测试益生菌胞外泌体的免疫调节作用，先将小鼠巨噬细胞raw264.7细胞(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心)培养于rpmi-1640培养基(gibco/life technologies corporation，grand island，ny，usa)，该培养基含10％胎牛血清(zeta-life，menlo park，ca，usa)及抗生素(100u/ml的青霉素及100μg/ml的链霉素；sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)。将细胞培养于37℃、5％co2的培养箱中，每24小时更换培养液，每72小时传代一次。
[0086]
接着，将经培养的raw 264.7细胞以1
×
105细胞/ml的量培养于24孔板中，并以106颗粒/ml的益生菌胞外泌体处理16小时，而后离心细胞液，收集上清液，以检测试剂盒(r&d system，minneapolis，usa)测定no生成量。试验进行三重复独立试验。
[0087]
图8为小鼠巨噬细胞raw264.7经益生菌胞外泌体处理后的no生成量，结果显示，菌株b及菌株e的胞外泌体显著促进巨噬细胞产生no。
[0088]
实施例9：益生菌胞外泌体调节免疫细胞的细胞因子生成量
[0089]
为测试益生菌胞外泌体的免疫调节作用，先将小鼠巨噬细胞raw264.7培养于rpmi-1640培养基(gibco/life technologies corporation，grand island，ny，usa)，该培养基含10％胎牛血清(zeta-life，menlo park，ca，usa)及抗生素(100u/ml的青霉素及100μg/ml的链霉素；sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)。将细胞培养于37℃、5％co2的培养箱中，每24小时更换培养液，每72小时传代一次。
[0090]
接着，将经培养的raw 264.7细胞以1
×
105细胞/ml的量培养于24孔板中，并以106颗粒/ml的益生菌胞外泌体处理16小时，而后离心细胞液，并收集上清液，再以elisa试剂盒
(r&d system，minneapolis，usa)测定其中的tnf-α、il-4、il-6、il-10及il-12p40等细胞因子的含量。
[0091]
图9a和图9b为小鼠巨噬细胞raw264.7经益生菌胞外泌体处理后细胞因子tnf-α及il-6的生成量，结果显示，菌株b及菌株e的胞外泌体显著促进巨噬细胞产生tnf-α细胞因子，与对照组相较，tnf-α细胞因子的释放量可达约5倍。此外，菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体亦显著促进巨噬细胞产生il-6细胞因子，显示益生菌的胞外泌体确实具有免疫调节潜力。
[0092]
图10为小鼠巨噬细胞raw264.7经益生菌胞外泌体处理后的细胞因子il-10的生成量，结果显示，菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体显著促进巨噬细胞产生il-10细胞因子，其中又以菌株b及菌株e的胞外泌体促进效果更为明显，与对照组相较，il-10细胞因子的释放量可达近30倍。
[0093]
图11为小鼠巨噬细胞raw264.7经益生菌胞外泌体处理后的细胞因子il-4的生成量，结果显示，菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体显著促进巨噬细胞产生il-4细胞因子，其中又以菌株b及菌株e的胞外泌体促进效果更为明显，与对照组相较，il-4细胞因子的释放量可达近20倍。
[0094]
图12为小鼠巨噬细胞raw264.7经益生菌胞外泌体处理后的细胞因子il-12p40的生成量，结果显示，菌株a、菌株b及菌株e的胞外泌体显著促进巨噬细胞产生il-12p40细胞因子，其中又以菌株b及菌株e的胞外泌体促进效果更为明显，与对照组相较，il-12p40细胞因子的释放量超过30倍。
[0095]
由上述可知，本公开的益生菌胞外泌体可刺激炎症相关细胞因子的生成量，显示其具有调节免疫的功能，且对于抗炎症状或是抗过敏的免疫调节相关疾病具有预防或治疗的潜力。
[0096]
实施例10：统计分析
[0097]
本公开相关实验数据以平均值(mean)
±
标准偏差(standard deviation，sd)表示，其通过独立样品双尾t检验进行统计分析，以判断两组数据之间是否具有显著差异，并以p值小于0.05视为具显著差异性，p值越小代表差异越大，除非另有指示，否则本文中*代表p《0.05、**代表p《0.01、***代表p《0.001；部分实验结果还采用spss(spss institute,inc.，chicago，il，usa)软体进行统计分析，以单因子变异数分析(one-way anova)比较各组间的差异，再以邓肯分析法(duncan’s tests)作显著性差异的比较，分别以不同的英文字母符号(如a、b、c、bc等)表示p《0.05。
[0098]
上述实施例仅用以示例性说明本公开的原理及其功效，而非用于限制本公开。任何本领域技术人员均可在不违背本公开的范围下，对上述实施例进行修改。因此，本公开的权利保护范围，应如权利要求书中所列。