一种仿生胶原膜包被片及其制备方法

1.本发明属于细胞或组织培养材料领域，具体涉及一种仿生胶原膜包被片及其制备方法。


背景技术：

2.将细胞培养于细胞外基质上有助于在体外维持细胞的分化表型，并可以使用无血清的培养基培养细胞。目前常用于细胞培养的细胞外基质材料有各类型的胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等。胶原作为人与动物体内含量最大的细胞外基质成份，其优异的生物相容性与生物活性早就为人们所熟知。
3.在体内，前胶原分子合成后，被酶切去两端的端肽，形成长约300nm，直径1.5nm的胶原蛋白分子，然后多个胶原分子自组装形成具有67nm典型d
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band结构的纳米胶原纤维。67nm d
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band的产生是由于胶原分子在首尾相交联自组装时所产生的overlap和gap所致。overlap段长约30nm，gap段长约37nm。螺纹结构的深度在3nm至5nm间。如图1所示。在合适的ph、温度、离子浓度的环境中，在静电等作用下，酸法提取得到的胶原分子可以在体外重新自组装，形成与体内类似的具有周期性螺纹结构的胶原纤维。
4.虽然各国相关的多家公司(bd公司等)都有在商业化的培养器皿表面进行胶原包被，且有产品面市，但这种胶原包被的孔板仅仅利用孔板自身吸附胶原分子进行涂覆，并不具备胶原在体内所特有的纤维结构及典型的d
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band周期性螺纹结构。而细胞可以响应基质表面的几何形貌，且尺寸可以小至纳米级。因此，制备有纳米结构的胶原涂层对于特殊细胞的培养及胶原体内天然纤维结构生物功能的研究有重要意义。
5.美国国家标准与技术研究院在非tc处理的细胞培养孔板(聚苯乙烯)表面制备胶原纤维涂层，但大部分的胶原都被洗去，因此包被孔板时使用的胶原浓度要求高，胶原的包被率低。
6.前期cn103060192b报道了一种仿生胶原膜包被的培养器皿及其制备方法，但这种器皿表面水平包被方法需要多次洗涤过程，操作较为繁琐，且包被形态仅限于培养器皿，有一定的局限性。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种仿生胶原膜包被片及其制备方法。
8.本发明提供的制备方法，可制备一种均一、平整、具有天然纤维结构及周期性螺纹结构的仿生胶原膜包被片，该包被片可以用于增强细胞粘附、细胞增殖和细胞功能及胶原的细胞学功能。该胶原膜同载体表面结合紧密，不易脱落。
9.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
10.本发明提供的仿生胶原膜包被片的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)配制胶原重组缓冲液；
12.(2)将胶原醋酸溶液与胶原重组缓冲液混合均匀，得到混合液，调节所述混合液ph为中性，得到调节ph后的混合液；
13.(3)将载体竖立浸泡在步骤(2)所述调节ph后的混合液中，保温处理，烘干，得到所述仿生胶原膜包被片。
14.进一步地，步骤(1)所述胶原重组缓冲液的配制，包括：将nacl、hepes、na2hpo4及naoh加入水(优选去离子水)中，溶解均匀，得到所述胶原重组缓冲液。
15.进一步地，在所述胶原重组缓冲液中，nacl的浓度为270～540mm，hepes的浓度为60～120mm，na2hpo4的浓度为60～120mm。
16.优选地，在所述胶原重组缓冲液中，nacl的浓度为270mm，hepes的浓度为60mm，na2hpo4的浓度为60mm。
17.进一步地，步骤(2)所述胶原醋酸溶液为胶原与醋酸溶液混合均匀得到的混合物；所述胶原为i型胶原或ii型胶原；所述醋酸溶液的浓度为0.005m至0.05m。
18.进一步地，在步骤(2)所述胶原醋酸溶液中，胶原的浓度为0.02～0.5mg/ml。
19.进一步地，在步骤(2)所述胶原的醋酸溶液与缓冲液的体积比依胶原重组缓冲液配制浓度而变。
20.优选地，在步骤(2)所述胶原醋酸溶液与胶原重组缓冲液的体积比为1:1～3:1。
21.进一步优选地，在步骤(2)所述胶原醋酸溶液与胶原重组缓冲液的体积比为1:1。
22.进一步地，在步骤(2)所述混合液中，胶原的浓度为0.01～0.25mg/ml，nacl的浓度为120～150mm，hepes的浓度为20～40mm，na2hpo4的浓度为20～40mm。
23.优选地，在步骤(2)所述混合液中，nacl的浓度为135mm，hepes的浓度为30mm，na2hpo4的浓度为30mm。
24.进一步地，在步骤(3)所述载体为片状材料。
25.优选地，步骤(3)所述载体为高分子聚合物、玻璃、硅片中的一种。载体浸泡在所述混合液中的角度可以调整。
26.进一步地，在步骤(3)所述保温处理的温度为25～35℃。
27.优选地，步骤(3)所述保温温度为30℃。
28.进一步地，步骤(3)所述保温处理的时间为1h～5h。
29.进一步地，步骤(2)所述烘干的温度为60℃以下，烘干的时间为2h至48h。
30.本发明提供一种由上述的制备方法制得的仿生胶原膜包被片。
31.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
32.(1)本发明提供的制备方法，通过操作简便的自组装过程，通过溶液蒸发过程中的表面张力增加了胶原与载体表面的结合力，克服了胶原在载体表面结合力差的问题，制备出具有均一平整结构的无纺布样式纳米纤维仿生胶原膜涂层。
33.(2)本发明提供的制备方法，较器皿表面水平包被相比，省去了多次水洗烘干的过程，操作大大简便。且器皿表面水平包被过程中需保持严格静止，否则会影响包被效果，而载体垂直包被即使包被过程中有振动，得到的胶原纤维膜依旧均一平整。
34.(3)本发明提供的仿生胶原膜包被片，其表面附着的胶原膜其胶原是以纳米纤维形式存在，而且当重组温度介于25至35摄氏度时，形成的纤维具有典型的67nm周期性螺纹结构。
35.(4)本发明提供的制备方法，包被片上的胶原膜可以通过调整胶原的浓度来控制胶原纤维的包被率和膜厚度。
36.(5)本发明提供的仿生胶原膜包被片活性良好，有良好的细胞亲合性，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
附图说明
37.图1a和图1b分别是实施例1制备的仿生胶原膜包被片在不同放大倍数下扫描电镜图；
38.图2a和图2b分别是实施例2制备的仿生胶原膜包被片在不同放大倍数下扫描电镜图；
39.图3a为atdc5细胞在实施例1制备的仿生胶原膜包被片上培养后粘附的扫描电镜图；
40.图3b为atdc5细胞培养于商业化的组织处理细胞孔板中的扫描电镜图；
41.图3c为atdc5细胞在实施例2制备的仿生胶原膜包被片上培养后粘附的扫描电镜图；
42.图4为实施例3制备的仿生胶原膜包被片扫描电镜图；
43.图5为对比例1制备的胶原膜包被片扫描电镜图。
具体实施方式
44.以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
45.实施例1
46.一种仿生胶原膜包被片的方法，步骤如下：
47.(1)将i型胶原加入0.02m的醋酸溶液中，配制得到i型胶原浓度为0.2mg/ml的胶原醋酸溶液。
48.(2)配制胶原重组缓冲液；该缓冲液含有270mm的nacl，60mm的hepes、60mm的na2hpo4。
49.(3)将步骤(1)所述胶原醋酸溶液和步骤(2)所述胶原重组缓冲液以1:1的比例混合均匀，得到混合液，使用1mnaoh调节所述混合液的ph为中性，取1ml调节ph后的混合液加入12孔板中，孔板中垂直竖立聚苯乙烯片，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温1h。
50.(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘2h，即得所述仿生胶原膜包被片(所述仿生胶原膜包被聚苯乙烯片)。
51.由图1a和图1b可以看出，聚苯乙烯薄片表面附着的胶原膜是以纳米纤维形式存在，直径约为200nm，而且具有典型的67nm周期性螺纹结构。胶原膜在聚苯乙烯薄片表面分布平整均一。
52.将atdc5细胞(小鼠模型细胞)分别培养在实施例1制备的仿生胶原膜包被片和商业化的组织处理细胞孔板(corning3512)上，培养时间均为24h，然后分别使用戊二醛固定，梯度酒精脱水并风干，镀金膜后用扫描电镜观察。结果分别如图3a和图3b所示。图3a为
atdc5细胞在实施例1制备的仿生胶原膜包被片上培养后粘附的扫描电镜图；图3b为atdc5细胞在普通的细胞孔板上培养后的扫描电镜图。
53.图3a显示atdc5在包被有纤维结构胶原的膜片(实施例1制备的仿生胶原膜包被片)上粘附良好，显示出良好的细胞亲合性；而培养于孔板中的细胞铺展面积要远小于培养于胶原纤维膜上的细胞(图3b)，说明实施例1制备的仿生胶原膜包被片上的胶原膜活性良好，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
54.实施例2
55.一种仿生胶原膜包被片的方法，步骤如下：
56.(1)将i型胶原加入0.005m的醋酸溶液中，配制得到i型胶原浓度为0.05mg/ml的胶原醋酸溶液。
57.(2)配制胶原重组缓冲液；该缓冲液含有270mm的nacl，60mm的hepes、60mm的na2hpo4。
58.(3)将步骤(1)所述胶原醋酸溶液和步骤(2)所述缓冲液以1:1的比例混合均匀，得到混合液，使用1mnaoh调节所述混合液的ph为中性，取1ml调节ph后的混合液加入12孔板中，孔板中垂直竖立聚乙烯薄片，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温2h。
59.(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于30摄氏度烘箱烘12h，即得仿生胶原膜包被片(所述仿生胶原膜包被的聚乙烯片)。
60.由图2a和图2b可以看出，制备的胶原膜均匀分布于载体表面，且平整均一，具有典型的67nm周期性螺纹结构。
61.图3c显示atdc5在包被有纤维结构胶原的膜片(实施例2制备的仿生胶原膜包被片)上粘附良好，显示出良好的细胞亲合性，说明实施例2制备的仿生胶原膜包被片上的胶原膜活性良好，在细胞粘附方面优于商业化的组织处理细胞孔板。
62.实施例3
63.一种仿生胶原膜包被片的方法，步骤如下：
64.(1)将i型胶原加入0.05m的醋酸溶液中，配制得到i型胶原浓度为0.5mg/ml的胶原醋酸溶液。
65.(2)配制胶原重组缓冲液；该缓冲液含有540mm的nacl，120mm的hepes、120mm的na2hpo4。
66.(3)将步骤(1)所述胶原醋酸溶液和步骤(2)所述缓冲液，以3:1的比例混合均匀，得到混合液，使用1mnaoh调节所述混合液的ph为中性，取1ml调节ph后的混合液加入12孔板中，孔板中垂直竖立硅片，盖好盖子，于30摄氏度烘箱保温5h。
67.(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于35摄氏度烘箱烘48h，直至溶液烘干，即得仿生胶原膜包被片(所述仿生胶原膜包被的硅片)。
68.由图4可以看出，制备的胶原膜均匀分布于载体表面，且平整均一，具有典型的67nm周期性螺纹结构。
69.对比例1
70.一种胶原膜包被玻璃片的方法，步骤如下：
71.(1)将i型胶原加入0.005m的醋酸溶液中，配制得到i型胶原浓度为0.02mg/ml的胶原醋酸溶液。
72.(2)配制胶原重组缓冲液；该缓冲液含有270mm的nacl，60mm的hepes、60mm的na2hpo4。
73.(3)将步骤(1)所述胶原醋酸溶液和步骤(2)所述缓冲液，以1:1的比例混合均匀，得到混合液，使用1mnaoh调节所述混合液的ph为中性，取1ml调节ph后的混合液加入12孔板中，孔板中垂直竖立玻璃薄片，盖好盖子，于37摄氏度烘箱保温2h。
74.(4)将步骤(3)得到的含重组胶原的12孔板盖子打开，于37摄氏度烘箱烘4h，即得仿生胶原膜包被片(所述仿生胶原膜包被的玻璃片)。
75.由图5可以看出，对比例1制备的胶原膜均匀分布于载体表面，但由于较高的保温温度，许多纤维相互缠绕，且不具典型的67nm周期性螺纹结构。
76.以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。