急性淋巴性白血病甲基化生物标记物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种急性淋巴性白血病甲基化生物标记物及其应用。


背景技术：

2.急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)是淋巴母细胞异常增生引起的恶性克隆性肿瘤，是最常见的发生于儿童的癌症，占儿童全部癌症的26％，占儿童急性白血病的75％-80％，其中b细胞急性淋巴细胞白血病在儿童所有all中占80％，是最为常见的all类型。成人all患者的发病率较低，约占成人急性白血病的20％。
3.正常情况下，骨髓生成的血液干细胞，也叫免疫细胞，将会分化为成熟血细胞。血液干细胞可转化为髓质干细胞和淋巴干细胞两种。其中髓质干细胞将分化为三种成熟血细胞，包括载氧和其他底物到身体不同器官组织的红细胞；起凝血作用的血小板和抗外源感染和疾病的粒细胞(白细胞)。髓质干细胞异常是急性髓性白血病(aml)的主要发病原因；淋巴干细胞首先分化为淋巴母细胞，进而分化为机体生产抗体，抵御外援感染的b淋巴细胞和协助b淋巴细胞产生抗体的t淋巴细胞，以及攻击肿瘤细胞和病毒的自然杀伤细胞。all患者大量干细胞转为淋巴母细胞、b淋巴细胞或t淋巴细胞，又称为白血病细胞，他们不能有效的防御外源感染，导致血液和骨髓中白细胞，红细胞和血小板细胞数量降低，引发感染、贫血或出血。对于绝大多数肿瘤，越早发现对于其后续的临床治疗越发简单，患者收益越高。然而，到目前为止，世界上没有特殊的应用于急性淋巴性白血病的检测技术方法，白血病常规检测为骨髓或血液样本显微镜检，通过白细胞等的大小、形状和其他特征对其进行鉴定和分类，最主要的指标是血细胞是否成熟。all患者的确诊通常需要骨髓中至少20％的细胞为幼稚细胞，正常情况下，幼稚细胞不超过骨髓细胞的5％。
4.另一方面，对于复发难治性白血病患者，存在治疗监测难和预后难等问题，复发治疗极易产生药物抗性，治疗效果逐渐降低。患者用药缓解后微小残留病变(minimal residual disease，mrd)的检测已成为不同肿瘤临床治疗检测研究热点。白血病患者在经过治疗达到完全缓解(cr)后，虽然用常规的形态学方法(放大100倍显微镜观察骨髓)不能检测到的明显的白血病细胞，但体内可能仍然存留少量白血病残留细胞。即使用流式细胞学方法来检测，灵敏度可以达到10-4
～10-5
(也就是1万～10万个细胞中可发现1个白血病细胞)，然而却无法检测到更早期的出现细胞形态变化前的细胞。应用分子诊断学方法可以发现更早期的具有基因变异或基因表达差异的白血病细胞，目前临床检测的分子标记物主要集中在细胞遗传学异常，如融合基因和点突变等。但是携带此类细胞遗传学异常和突变异常的患者仅仅占患病人群的一部分。鉴于白血病的复杂性，寻找可用于精确诊断和预后分层的分子标记物具有重要意义。
5.国内外大量研究表明，dna甲基化的异常调控贯穿于肿瘤的发生、发展和预后。血浆游离dna甲基化不仅与早期肿瘤发生密切相关，而且可分辨组织源性(pmid:29035356、pmid:26392541)。不同基因dna甲基化分子标记物组合也陆续应用于肿瘤筛查，特别是泛癌
症的早期诊断(cn 111742062 a、cn 109680060 a)。在血液病方面，公开发明专利(cn 111647661 a)通过一组特异性基因元件cyp26c1-dmr，dgkg-dmr，wt1-dmr和trim40-dmr的甲基化信息，建立了一种辅助诊断急性髓性白血病的方法，发现aml患者甲基化水平要明显高于正常人，通过logistic回归模型p值判定患者是否发病。此外，公开专利申请(cn111411157 a)和(cn109852672 a)分别通过全基因组甲基化和全基因组cpg位点甲基化捕获测序发现dna甲基化在幼年型粒单核细胞白血病和急性髓系白血病预后方面呈现一定的特异性。然而在急性淋巴性白血病诊断、治疗以及微小残留病变(mrd)监测方面，dna甲基化检测分子标记物的鉴定临床意义重大，然而研究相对比较有限。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于急性淋巴性白血病检测的甲基化生物标记物或其组合。
7.实现上述目的的技术方案如下：
8.一种用于急性淋巴性白血病检测的甲基化生物标记物或其组合，包括cg04357841和/或cg00589581，cg05955436，cg07690127，cg08670465，cg11731671，cg12366968，cg14018153，cg15225364，cg15460454，cg17001566，cg19513987，cg21940655，cg23367351，cg23375948中的至少一种。
9.在其中一些实施例中，上述甲基化生物标记物组合包括选自cg04357841和cg14018153、cg19513987、cg23367351、cg23375948中的任意至少一种。
10.在其中一些实施例中，上述甲基化生物标记物组合包括cg00589581，cg05955436，cg07690127，cg08670465，cg11731671，cg12366968，cg14018153，cg15225364，cg15460454，cg17001566，cg19513987，cg21940655，cg23367351和cg23375948。
11.在其中一些实施例中，上述cg04357841的序列如seq i d no.66或其互补序列所示，上述cg00589581的序列如seq i d no.65或其互补序列所示，上述cg05955436的序列如seq i d no.67或其互补序列所示，上述cg07690127的序列如seq i d no.68或其互补序列所示，上述cg08670465的序列如seq i d no.69或其互补序列所示，上述cg11731671的序列如seq i d no.70或其互补序列所示，上述cg12366968的序列如seq i d no.71或其互补序列所示，上述cg14018153的序列如seq i d no.72或其互补序列所示，上述cg15225364的序列如seq i d no.73或其互补序列所示，上述cg15460454的序列如seq i d no.74或其互补序列所示，上述cg17001566的序列如seq i d no.75或其互补序列所示，上述cg19513987的序列如seq i d no.76或其互补序列所示，上述cg21940655的序列如seq i d no.77或其互补序列所示，上述cg23367351的序列如seq i d no.78或其互补序列所示，上述cg23375948的序列如seq i d no.79或其互补序列所示。
12.在其中一些实施例中，上述甲基化生物标记物组合包括选自seq i d no.66或其互补序列和seq i d no.72或其互补序列，seq i d no.79或其互补序列，seq i d no.76或其互补序列，以及seq i d no.78或其互补序列中的任意至少一种。
13.在其中一些实施例中，上述dna甲基化标记物组合包括seq id no.65-seq id no.79所示序列或seq id no.65-seq id no.79的完全互补序列。
14.本发明的目的之一还在于提供一种上述甲基化生物标记物或其组合在制备检测、
分类或预测、治疗监测、预后或其它评价急性淋巴性白血病的试剂盒中的应用。
15.本发明的目的之一还在于提供一种急性淋巴性白血病检测试剂盒。
16.实现上述目的的技术方案如下：
17.一种急性淋巴性白血病检测试剂盒，包括检测上述甲基化生物标记物或其组合的甲基化状态的试剂。
18.在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
19.在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测技术包括rt-pcr、免疫pcr、巢式pcr、荧光pcr、原位pcr、膜结合pcr、锚定pcr、固着pcr、原位pcr、不对称pcr、长距离pcr、降落伞pcr、梯度pcr中的任意一种。
20.在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测技术是荧光pcr，包括针对每个甲基化生物标记物的上下游引物，所述上下游引物分别为：
21.针对seq id no.65的seq id no.17和seq id no.18，和/或针对seq id no.66的seq id no.29和seq id no.30，和/或针对seq id no.67的seq id no.1和seq id no.2，和/或针对seq id no.68的seq id no.3和seq id no.4，和/或针对seq id no.69的seq id no.5和seq id no.6，和/或针对seq id no.70的seq id no.23和seq id no.24，和/或针对seq id no.71的seq id no.19和seq id no.20，和/或针对seq id no.72的seq id no.15和seq id no.16，和/或针对seq id no.73的seq id no.7和seq id no.8，和/或针对seq id no.74的seq id no.9和seq id no.10，和/或针对seq id no.75的seq id no.25和seq id no.26，和/或针对seq id no.76的seq id no.11和seq id no.12，和/或针对seq id no.77的seq id no.21和seq id no.22，和/或针对seq id no.78的seq id no.27和seq id no.28，和/或针对seq id no.79的seq id no.13和seq id no.14。
22.在其中一些实施例中，上述急性淋巴性白血病检测试剂盒包括上下游引物：针对seq id no.65的seq id no.17和seq id no.18，和针对seq id no.66的seq id no.29和seq id no.30，和针对seq id no.67的seq id no.1和seq id no.2，和针对seq id no.68的seq id no.3和seq id no.4，和针对seq id no.69的seq id no.5和seq id no.6，和针对seq id no.70的seq id no.23和seq id no.24，和针对seq id no.71的seq id no.19和seq id no.20，和针对seq id no.72的seq id no.15和seq id no.16，和针对seq id no.73的seq id no.7和seq id no.8，和针对seq id no.74的seq id no.9和seq id no.10，和针对seq id no.75的seq id no.25和seq id no.26，和针对seq id no.76的seq id no.11和seq id no.12，和针对seq id no.77的seq id no.21和seq id no.22，和针对seq id no.78的seq id no.27和seq id no.28，和针对seq id no.79的seq id no.13和seq id no.14。
23.在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测技术是数字pcr，上述试剂盒包括针对每个甲基化生物标记物的上下游引物、甲基化荧光探针和非甲基化荧光探针，其中上下游引物与上述一致，甲基化荧光探针和非甲基化荧光探针分别如下：
24.针对seq id no.65的seq id no.39和seq id no.54，和/或针对seq id no.66的seq id no.45和seq id no.60，和/或针对seq id no.67的seq id no.31和seq id no.46，
和/或针对seq id no.68的seq id no.32和seq id no.47，和/或针对seq id no.69的seq id no.33和seq id no.48，和/或针对seq id no.70的seq id no.42和seq id no.57，和/或针对seq id no.71的seq id no.40和seq id no.55，和/或针对seq id no.72的seq id no.38和seq id no.53，和/或针对seq id no.73的seq id no.34和seq id no.49，和/或针对seq id no.74的seq id no.35和seq id no.50，和/或针对seq id no.75的seq id no.43和seq id no.58，和/或针对seq id no.76的seq id no.36和seq id no.51，和/或针对seq id no.77的seq id no.41和seq id no.56，和/或针对seq id no.78的seq id no.44和seq id no.59，和/或针对seq id no.79的seq id no.37和seq id no.52。
25.在其中一些实施例中，上述甲基化探针荧光报告基团为fam，淬灭基团为mgb，非甲基化探针荧光报告基团为vic，淬灭基团为mgb。
26.在其中一些实施例中，上述急性淋巴性白血病检测试剂盒的甲基化荧光探针和非甲基化荧光探针包括：针对seq id no.65的seq id no.39和seq id no.54，和针对seq id no.66的seq id no.45和seq id no.60，和针对seq id no.67的seq id no.31和seq id no.46，和针对seq id no.68的seq id no.32和seq id no.47，和针对seq id no.69的seq id no.33和seq id no.48，和针对seq id no.70的seq id no.42和seq id no.57，和针对seq id no.71的seq id no.40和seq id no.55，和针对seq id no.72的seq id no.38和seq id no.53，和针对seq id no.73的seq id no.34和seq id no.49，和针对seq id no.74的seq id no.35和seq id no.50，和针对seq id no.75的seq id no.43和seq id no.58，和针对seq id no.76的seq id no.36和seq id no.51，和针对seq id no.77的seq id no.41和seq id no.56，和针对seq id no.78的seq id no.44和seq id no.59，和针对seq id no.79的seq id no.37和seq id no.52。
27.本发明的目的之一还在于提供一种检测急性淋巴性白血病的方法。
28.实现上述目的的技术方案如下：
29.一种检测急性淋巴性白血病的方法，包括以下步骤，
30.提取将待测的生物样品基因组dna；
31.对所述dna进行亚硫酸氢盐转化；
32.对上述甲基化生物标记物或其组合的甲基化程度的检测。
33.在其中一些实施例中，上述dna甲基化标记物检测方法包括但不限于以下技术：聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术。
34.在其中的一些实施例中，上述检测方法中聚合酶链式反应技术包括rt-pcr、免疫pcr、巢式pcr、荧光pcr、原位pcr、膜结合pcr、锚定pcr、固着pcr、原位pcr、不对称pcr、长距离pcr、降落伞pcr、梯度pcr等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，dna富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱的gc-ms、lc-ms、maldi-tofms、ft-ms、icp-ms、sims等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450k和850k等甲基化检测技术。
35.在其中的一些实施例中，上述生物样品为血液、血浆、唾液、血清。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明的发明人经研究找到了与急性淋巴性白血病非常相关的甲基化生物标记
物，包括：cg00589581，cg04357841，cg05955436，cg07690127，cg08670465，cg11731671，cg12366968，cg14018153，cg15225364，cg15460454，cg17001566，cg19513987，cg21940655，cg23367351和cg23375948这15个甲基化生物标记物对应的15个dna片段。这15个dna片段的单独或组合使用，能够应用于急性淋巴性白血病的检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价。
38.通过研究这些标记物在all患者及健康人群中的甲基化修饰差异，发现以上标记物组合对于all患者检测的敏感性为99.63％，特异性为94.74％，能够作为all诊断标记物。并进一步地在all治疗后缓解患者及all治疗后复发患者中，通过单独检测以上标记物或将上述标记物进行组合检测，发现all复发患者样本与all患者样本的检测结果一致，均存在以上位点的甲基化修饰特异性，从而有效区分all缓解和复发患者，预示其可进一步地作为all患者治疗后微小残留病监测(mrd)的筛查标记物。
39.本发明联合分析至少1个基因组片段上的多个甲基化胞嘧啶的共甲基化特征作为判断all发病的生物标记物敏感性高，特异性强，对于all的预测、靶向药物开发和伴随诊断、特别是治疗后微小残留病监测(mrd)的筛查诊断意义重大。
附图说明
40.图1为实施例3中关于15个位点的测序结果中，all患者和健康个体外周血甲基化差异分析图，其中a组为all患者，b组为健康个体。
41.图2为实施例4中关于位点cg 04357841数字pcr检测结果中，all复发患者外周血甲基化特征结果图。
42.图3为实施例4中关于位点cg 04357841数字pcr检测结果中，all治疗后缓解个体外周血甲基化特征结果图。
具体实施方式
43.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
44.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
45.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
46.为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
47.在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实
施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
48.此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
49.术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5
′‑
a-g-t-3
′
与序列3
′‑
t-c-a-5
′
互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
50.术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列，该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的dna混合物中，随后在dna聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“pcr”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“pcr扩增”，是“pcr产物”或“扩增子”。
51.如本发明所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于dna测序方法、探针杂交方法。
52.术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
53.术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
54.如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置c5或n4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的n6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的dna通常是未甲基化的，因为通常体外dna扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化dna”或“甲基化dna”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增dna。
55.因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于dna中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是dna的典型核苷酸碱基。
56.甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比
例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
57.如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的dna，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如cpg二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
58.术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个cpg二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
59.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
60.实施例1分子标记物的获取
61.收集geo数据库中已有450k甲基化芯片检测数据，获得临床甲基化检测数据分类：初诊all患者1356例、正常对照个体87例。随机选取初诊1084例和健康49例患者数据进行机器学习建模，训练一个随机森林模型。然后通过剩余的初诊all患者272例和健康38例样本数据做验证集，通过筛选获得分子标记物及对应序列如下表1-1所示：
62.表1-1
63.[0064][0065]
针对上述15个all患者样本特异性的候选甲基化位点，通过构建的机器学习模型和随机森林模式检测分析272例all样本和38例健康人样本，所有标记物组合对于all患者检测的敏感性为99.63％，特异性为94.74％，结果如下表1-2所示。
[0066]
表1-2.甲基化分子标记物对于急性淋巴性白血病和正常人群检测
[0067][0068]
进一步根据该1356例初诊和87例健康样本作为训练集建立一个随机森林模型，用32个复发状态，195个缓解状态检测样本做验证集(数据来源于geo数据库)，如果复发状态被预测为all样本，缓解状态被预测为健康样本，则判断为预测正确。针对cg04357841和cg14018153、cg19513987、cg23367351、cg23375948不同组合预测结果见下表1-3：
[0069]
表1-3甲基化预测急性淋巴性白血病复发/缓解结果
[0070][0071]
通过上表统计结果可知，检测生物标记物组合cg23375948和cg23367351甲基化程度用于预测all复发/缓解样本具有很好的敏感性和特异性。分别检测生物标记物组合cg04357841和cg14018153；cg04357841和cg19513987；cg19513987和cg14018153甲基化程度用于预测all复发/缓解样本也都具有良好的敏感性和特异性。
[0072]
实施例2分子标记物的试剂盒制备及检测
[0073]
根据上述标记物，设计亚硫酸盐特异性pcr扩增引物，具体引物序列如下表2-1所示。
[0074]
表2-1
[0075]
[0076][0077]
在实时定量pcr检测中可用actb基因引物和探针作为内参，其中上游引物为：gattaggtgtttaagatagtgtt(seq id no.80)，下游引物为：atctattcaaacctactatacac(seq id no.81)，检测探针为：tgtgataaggttatgaggttggt(seq id no.82)。
[0078]
选取cg04357841(seq id no.29-seq id no.30引物对和seq id no.45探针)、cg23375948(seq id no.13-seq id no.14引物对和seq id no.37探针)和cg14018153(seq id no.15-seq id no.16引物对和seq id no.38探针)检测位点分别跟actb内参基因引物探针组合，分别用于all患者和健康个体各一例进行荧光定量检测，检测结果通过δct计算每一样本甲基化水平。检测结果如下表2-2所示：
[0079]
表2-2
[0080][0081]
从上表数据可初步看出生物标记物：cg04357841、cg23375948和cg14018153的甲基化程度在all患者和健康个体中存在显著差异，检测ct值也明显不同，因此可采用定量pcr进行上述生物标记物检测从而用于all的检测。
[0082]
基于上述引物对还可制备数字pcr检测试剂盒，同时包括上述引物对，其还包括检测甲基化seq id no.31至seq id no.45和非甲基化seq id no.46至seq id no.60的荧光探针，具体序列如下表2-3所示。其中甲基化探针荧光报告基团为fam，淬灭基团为mgb，非甲基化探针荧光报告基团为vic，淬灭基团为mgb。
[0083]
表2-3
[0084]
[0085][0086]
对于待检测的某一位点，其上下游引物，甲基化荧光探针和非甲基化荧光探针均以混合液形式存在，其中上、下游引物在混合液中的浓度分别为10um，甲基化和非甲基化荧光探针在混合液中的浓度分别为3um。
[0087]
在数字pcr检测试剂盒中，还包括数字pcr反应预混合液，为quantstudio
tm
3d digital pcr master mix v2(thermo)。试剂盒同时包括甲基化和非甲基化标准品，该标准品可通过lambdadna(promega，d1521)制备。
[0088]
该试剂盒检测流程如下：
[0089]
dna分子标记物甲基化修饰应用于急性淋巴性白血病诊断前，需对基因组dna进行亚硫酸盐或重亚硫酸盐进行转化，其中转化试剂为ez dna methylation-gold
tm
kit(zymo research)。
[0090]
反应体系制备：引物(10um)探针(3um)混合液2ul，pcr反应预混液12.5ul(包括2xpcr缓冲液、0.25mm dntp和5u pcr扩增酶)，亚硫酸盐转换后dna模板50ng，反应总体积用
超纯水补足25ul。
[0091]
微滴制备及扩增：将样品反应体系加入到dg8 cartridge(微滴发生卡)中间一排，最底下一排加入70ul的微滴生成油，微滴将生成于cartridge最上面一排，吸取40ul于96孔板进行扩增，反应程序为：(1)95℃，1min；(2)95℃30sec，60℃1min，40个循环；(3)4℃，5min，90℃2min，4℃下保持不超过12小时。
[0092]
信号读取及分析：扩增反应后，通过qx200 droplet reader读取每个孔内微滴的信号，并通过quanta soft软件分析数据。
[0093]
实施例3标记物dna区域组合扩增子测序检测急性淋巴性白血病
[0094]
待测样本选取：选取北京解放军307医院14例医院确诊的急性淋巴性白血病患者的外周血样本(a组)和10例正常体检者外周血(b组)，进行甲基化检测。
[0095]
基因组dna提取：运用天根公司的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304-03)，分别提取待检测样本的基因组dna，qubit荧光法定量dna浓度。
[0096]
基因组dna亚硫酸盐转换：取500ng提取基因组dna，体积不超过20ul，使用zymo research公司的ez dnamethylation-gold
tm
kit(d5006)亚硫酸盐转化试剂盒，按照试剂盒的操作指导对全基因组dna进行亚硫酸盐处理并纯化，qpcr和安捷伦2100检测后(其中纯化标准为：安捷伦2100片段分布为150bp-500bp范围，且文库浓度不低于1ng/ul)，dna洗脱到10ul的eb缓冲液中。
[0097]
将seq id no.1至seq id no.30上下游扩增引物配置pcr扩增工作引物，每条引物的浓度为1um。该引物组合可扩增标记物中所有核心cg位点和潜在cg位点的甲基化信息。
[0098]
亚硫酸盐pcr扩增：首先按照以下体系在冰上配置pcr反应液。
[0099]
亚硫酸盐转化后基因组dna 5ul，pcr扩增工作引物2ul，pcr反应预混液20ul，超纯水13ul，然后，在pcr仪上按照如下程序进行扩增，扩增产物经纯化后，qubit测定浓度。
[0100]
表3-1
[0101][0102]
文库构建：
[0103]
按照下表3-2配置反应液体系：
[0104]
表3-2
[0105]
pcr扩增产物(50ng)10ul10x多聚核苷酸激酶缓冲液5ult4多聚核苷酸激酶2ulatp(10mm)5ul50％peg7.5
接头1/2(10mm)1ult4dna连接酶1ul超纯水18.5ul
[0106]
其中接头1为：tacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seq id no.61)；
[0107]
接头2为：gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac(seq id no.62)。
[0108]
混匀后，20℃反应30min；反应后产物经0.9倍反应产物体积的贝克曼xp磁珠纯化后，将dna洗脱到30ul洗脱液中。
[0109]
文库pcr扩增及测序
[0110]
首先，在pcr管中按照以下反应体系配置反应液：
[0111]
表3-3
[0112]
接头连接扩增产物23ul2xpcrreadymix25ul外引物1和2(10um)2ul
[0113]
其中，外引物1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seq id no.63)。外引物2：caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seq id no.64)。其中n8为标签序列，用于区分不同样本测序数据。
[0114]
反应体系配置完成后，在pcr仪中，按照如下表3-4所示程序进行反应
[0115]
表3-4
[0116][0117]
文库经检测后进行高通量二代测序，目标区域测序甲基化数据分析及all患者与正常对照甲基化差异，下机数据通过外引物2的标签序列进行不同样本数据拆分，去除接头污染等低质量测序数据后，计算分子标记物测序数据甲基化水平，图1结果显示，其中a组为all检测结果，b组为正常体检外周血检测结果，其中，纵坐标为甲基化水平，由此可见该15个检测区域的平均甲基化水平在急性淋巴性白血病患者和正常个体中存在差异显著。
[0118]
实施例4、数字pcr试剂盒监测急性淋巴性白血病mrd
[0119]
以甲基化生物标记物cg 04357841(seq id no.66)的检测为例，运用上述引物seq id no.29、seq id no.30和探针seq id no.45、seq id no.60，按照技术发明流程和参数，构建引物探针混合液，按照数字pcr试剂盒检测流程，分别检测all治疗后缓解和复发患者各一例的外周血样本dna甲基化分子拷贝数差异。
[0120]
基因组dna提取：运用天根公司的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304-03)，分别提取待检测样本的基因组dna，qubit荧光法定量dna浓度。
[0121]
dna分子标记物甲基化修饰应用于急性淋巴性白血病诊断前，需对基因组dna进行亚硫酸盐或重亚硫酸盐进行转化，转化试剂为ez dnamethylation-gold
tm
kit(zymo research)。
[0122]
反应体系制备：引物(10um)探针(3um)混合液2ul，pcr反应预混液12.5ul，亚硫酸盐转换后dna模板50ng，反应总体积用超纯水补足25ul。
[0123]
微滴制备及扩增：将样品反应体系加入到dg8 cartridge中间一排，最底下一排加入70ul的微滴生成油，微滴将生成于cartridge最上面一排，吸取40ul于96孔板进行扩增，反应程序为：(1)95℃，1min；(2)95℃30sec，60℃1min，40个循环，(3)4℃，5min，90℃2min，4℃下保持不超过12小时。
[0124]
信号读取及分析：扩增反应后，通过qx200 droplet reader读取每个孔内微滴的信号，并通过quantasoft软件分析数据。
[0125]
通过上述对all复发患者和all缓解患者外周血样本的甲基化拷贝数检测，结果如图2-3所示，其中左上部分散点代表甲基化(fam阳性)拷贝数，右下角散点代表非甲基化(vic阳性)拷贝数，其中all复发患者外周血dna位点cg 04357841的甲基化拷贝数显著高于all缓解患者外周血dna甲基化的拷贝数。该结果跟图1结果一致，即all患者体内同样存在相同位点的甲基化修饰特异性，all患者样本中位点cg 04357841的甲基化水平显著高于健康个体的甲基化水平。
[0126]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0127]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。