分泌GLP-1的蛋白表达系统及其制备方法和应用与流程

分泌glp
‑
1的蛋白表达系统及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损而导致血液葡萄糖水平慢性增高的代谢性疾病，主要可分为一型(胰岛素依赖型)糖尿病(t1dm)和二型(非胰岛素依赖型)糖尿病(t2dm)。t2dm多发于40岁以上成年人，又称为成人发病型糖尿病。早期的t2dm临床症状轻微，不易察觉，随着疾病进展，血糖水平逐渐上升，患者会出现典型的高血糖症状，即多饮、多食、多尿和体重减轻(三多一少)，并合并消化道功能紊乱、心脑血管疾病等。
3.研究表明，胰岛素抵抗是t2dm的主要致病因素。在长期营养过剩、肥胖、运动不足及年龄增长等因素的影响下，机体产生的慢性炎症和高水平循环游离脂肪酸(ffa)会导致活性氧反应性分子(ros)的产量增加，而ros通过激活jnk/ap
‑
1和ikk/nfκb信号轴，上调促炎性细胞因子基因的转录表达，并增加促炎因子和急性期反应物的产生。同时，这些促炎因子进一步损害了胰岛素受体底物(irs
‑
1)的作用，阻断了胰岛素信号传导，最终诱发机体胰岛素抵抗。此外，胰岛β细胞功能损伤也是导致t2dm的重要机制。
4.t2dm前期可以通过控制饮食、体育锻炼和减轻体重等方式控制病情，但随着病程进展，血糖逐渐升高，后期仍需通过降糖药物(口服和注射)或胰岛素(注射)来进行治疗。目前，针对t2dm的治疗药物如双胍类、格列奈类、磺脲类、α
‑
糖苷酶抑制剂类和噻唑烷二酮类尽管有一定的治疗效果，但这些药物易造成低血糖和胃肠道不适等副作用。
5.glp
‑
1是由人体肠道中l细胞分泌的一种肠促胰激素，在正常人体中的分泌量约为1pmol/l～5pmol/l，具有促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用，即只有在血糖水平升高时才发挥降糖作用，而在血糖水平正常时，则不发挥降糖效果，具有较高的临床应用安全性。然而，内源性glp
‑
1的氨基酸序列中存在可被dpp
‑
iv识别的位点而易被其降解，因此半衰期极短，严重限制了其生理效能。目前，大多数研究主要采取两种策略来延长其半衰期：1)优化天然glp
‑
1序列，使其既能保持生物活性又能抵抗dpp
‑
iv的降解作用，如glp
‑
1受体激动剂或glp
‑
1类似物；2)开发dpp
‑
iv抑制剂，通过抑制其活性来减少glp
‑
1的降解从而增加glp
‑
1的机体循环浓度。尽管glp
‑
1类似物及dpp
‑
iv抑制剂因降糖效果较好且不易引起低血糖等副作用而广受青睐，但其来源主要通过化学合成，成本高、售价昂贵，且需长期皮下注射给药，巨大的经济负担及治疗痛苦限制了glp
‑
1相关药物的大范围临床普及。


技术实现要素：

6.基于此，有必要提供一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统，该分泌glp
‑
1的蛋白表达系统可稳定分泌glp
‑
1，对t2dm有良好的治疗效果，且该分泌glp
‑
1的蛋白表达系统还能改善目前glp
‑
1相关药物成本高和给药方式让患者痛苦的问题。
7.此外，还提供一种上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统的制备方法和其在制备治疗二
型糖尿病、抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡、或改善二型糖尿病的肠道菌群的药物中应用。另外，还提供一种包括上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统的药物。
8.一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统，其特征在于，所述蛋白表达系统包括转化有重组表达载体的植物乳杆菌，所述重组表达载体包括空载体和编码人源glp
‑
1的核酸片段。
9.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统可稳定分泌glp
‑
1，对t2dm有良好的治疗效果，且该分泌glp
‑
1的蛋白表达系统采用益生菌植物乳杆菌作为载体，可以口服的方式给药且生产成本较低(可采用发酵工程技术大规模制备)，能改善目前glp
‑
1相关药物生产成本高和给药方式给患者的痛苦的问题。
10.在其中一个实施例中，所述重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统的制备方法，包括以下步骤：
12.将编码人源glp
‑
1的核酸片段插入空载体，制备重组表达载体，所述空载体为pmg36e，所述编码人源glp
‑
1的核酸片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；及
13.将所述重组表达载体转化到植物乳杆菌中，制备分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
14.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用。
15.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡的药物中的应用。
16.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备改善二型糖尿病的肠道菌群的药物中的应用。
17.一种药物，其特征在于，所述药物包括活性成分，所述活性成分包括上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
18.在其中一个实施例中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
19.在其中一个实施例中，所述药学上可接受的辅料包括稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的至少一种。
20.在其中一个实施例中，所述药物为口服或直肠施用药物。
附图说明
21.图1为实施例1采用elisa检测野生型植物乳杆菌和工程菌的发酵培养上清中glp
‑
1表达情况的结果；
22.图2为实施例1采用wb检测野生型植物乳杆菌和工程菌的发酵培养上清中glp
‑
1表达情况的结果；
23.图3～图7依次为实施例2中的耐酸试验结果、耐胆盐试验结果、抗氧化性试验结果、抑菌试验结果和细胞粘附试验的结果；
24.图8为实施例3中的各组小鼠空腹血糖变化曲线；
25.图9为实施例3中的各组小鼠体重变化曲线；
26.图10为实施例3中各组小鼠的血糖耐量变化曲线；
27.图11为实施例3中各组小鼠的葡萄糖曲线下面积；
28.图12～图15为实施例3中用wb检测的各组小鼠的胰腺中tlr
‑
4、myd88、p
‑
nfκb和nfκb的表达水平结果；
29.图16～图18为实施例3中采用wb检测的各组小鼠的胰腺中bax、bcl
‑
2、p
‑
akt、akt
的表达水平结果；
30.图19～图21为实施例3中采用q
‑
pcr检测的各组小鼠的胰腺中促炎细胞因子il
‑
1β、il
‑
6和tnfα的表达水平结果；
31.图22实施例3中各组小鼠胰腺切片在100倍镜和400倍镜下的he染色结果；
32.图23为实施例3中各组小鼠胰腺切片在100倍镜和400倍镜下的免疫染色结果；
33.图24～图28为实施例3中各组小鼠的肠道菌群分析结果。
具体实施方式
34.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
35.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
36.本技术一实施方式提供了一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统，该蛋白表达系统包括转化有重组表达载体的植物乳杆菌，重组表达载体包括空载体和编码人源glp
‑
1的核酸片段。
37.可选地，编码人源glp
‑
1的核酸片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。当然，在其他实施例中，编码人源glp
‑
1的核酸片段的核苷酸序列不限于上述，还可以是其他序列。
38.在本实施方式中，空载体为pmg36e。pmg36e来源于pwv01载体，包含一个强启动子p32，能够在多种细菌中高效表达外源蛋白。在本实施方式中，植物乳杆菌为植物乳杆菌atcc8014。
39.本技术采用植物乳杆菌作为表达glp
‑
1的重组表达载体的宿主，使得上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统中的重组表达质粒具有良好的遗传稳定性，传代6天后蛋白表达系统中的重组质粒遗传稳定率为100％，而即使连续培养30天，质粒稳定率仍能达到86％。
40.在本实施方式中，重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
41.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统是将可表达glp
‑
1的重组表达载体转化到植物乳杆菌中而使得植物乳杆菌能够分泌glp
‑
1蛋白，该蛋白表达系统能够定植于机体的肠道中，具有稳定的质粒遗传性能，且转化有重组表达载体的植物乳杆菌具有与野生型植物乳杆菌同样的耐酸、耐胆盐、细胞粘附、抗氧化和抑制致病菌生长能力。
42.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统可以显著降低t2dm小鼠的血糖、抑制t2dm小鼠体重的增长，提高t2dm小鼠的血糖耐量，可以应用于制备治疗二型糖尿病的药物中。基于此，本技术一实施方式还提供了一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用。
43.并且经进一步研究发现，上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统能够显著抑制诱发型t2dm小鼠的胰腺组织炎症、抑制胰腺细胞的凋亡、促进了胰岛细胞增殖、促进胰岛细胞修复，提高胰岛素的表达。因此，上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统可应用于制备抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡的药物。基于此，本技术一实施方式还提供了一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡的药物中的应用。
44.此外，经研究发现，上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统可增加了肠道菌群的多样性和丰富度，促进了肠道稳态的恢复。因此，上述改善分泌glp
‑
1的蛋白表达系统还可以应用于制备改善二型糖尿病的肠道菌群的药物中。基于此，本技术一实施方式还提供了一种分泌glp
‑
1的蛋白表达系统在制备改善二型糖尿病的肠道菌群的药物中的应用。
45.基于上述，本技术一实施方式还提供了一种治疗二型糖尿病、抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡、或改善二型糖尿病的肠道菌群的药物，该药物包括分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
46.可选地，上述药物包括活性成分和药学上可接受的辅料，其中，活性成分包括分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
47.可选地，药学上可接受的辅料包括稳定剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的至少一种。
48.稳定剂用于保持活性成分的有效性。可选地，稳定剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素c、半胱氨酸、抗坏血酸钠盐、异抗坏血酸钠盐、l
‑
半胱氨酸盐酸盐和依地酸盐至少一种。填充剂用于增加药物的重量，利于成型。可选地，填充剂选自微晶纤维素、乳糖、淀粉、预交化淀粉、甘露醇和山梨醇中的至少一种。粘合剂起粘合作用。可选地，粘合剂选自羟丙纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮和交联聚维酮中的至少一种。崩解剂可以使药物在胃肠液中迅速裂碎成细小颗粒的物质，从而使活性成分迅速溶解吸收。可选地，崩解剂选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯比咯烷酮、交联羧甲基纤维素纳和干淀粉中的至少一种。润滑剂具有助流、抗粘和润滑的作用，利于药物制备。可选地，润滑剂选自硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶和富马酸硬脂酸钠中的至少一种。矫味剂用于改善药物的口感。可选地，矫味剂选自甜味剂及芳香剂中的至少一种。当然，在其他实施例中，辅料不限于上述，还可以是其他能食用的辅料。
49.可选地，上述药物为口服或直肠施用药物。
50.此外，本发明一实施方式还提供了一种上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统的制备方法，该制备方法包括步骤a～步骤b：
51.步骤a：将编码人源glp
‑
1的核酸片段插入空载体，制备重组表达载体。
52.具体地，空载体如上述，将编码人源glp
‑
1的核酸片段插入空载体的具体步骤包括：先将装载有编码人源glp
‑
1的核酸片段的质粒酶切、将空载体酶切，然后将酶切后的载体连接，并转化筛选鉴定，制备重组表达载体。
53.步骤b：将重组表达载体转化到植物乳杆菌中，制备分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
54.具体地，将重组表达载体电转化到感受态植物乳杆菌中，并筛选，制备分泌glp
‑
1的蛋白表达系统。
55.上述分泌glp
‑
1的蛋白表达系统的制备方法简捷，易操作。
56.具体实施例
57.以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。在下文的附图中，l.plantarum代表野生型植物乳杆菌；l.plantarum
‑
pmg36e
‑
glp
‑
1代表本技术构建的工程菌。
58.实施例1
59.工程菌的构建
60.1.工程菌l.plantarum
‑
pmg36e
‑
glp
‑
1的构建步骤
61.(1)质粒提取：包含有pmg36e和glp
‑1‑
puc57质粒的大肠杆菌dh5α在添加相应抗生素的lb培养基中扩增培养，然后采用omega质粒小提试剂盒提取pmg36e和glp
‑1‑
puc57质粒。
62.(2)酶切：pmg36e，puc57
‑
glp
‑
1酶切体系如下表1，总体积25μl，反应时间为37℃，4h。
63.表1
[0064][0065]
(3)胶回收：配置2％的琼脂糖凝胶，设置电压110v，时间45min；在200bp～300bp切胶回收glp
‑
1目的片段，在3600bp左右切胶回收载体片段。
[0066]
(4)酶连：酶连体系如下表2，总反应体系10μl，室温下反应5min，得到酶连质粒。
[0067]
表2
[0068][0069]
(fragment：v ector＝5：1和10：1)
[0070]
(5)转化：a.
‑
80℃冰箱中取出大肠杆菌dh5α感受态细胞，置于冰上溶解；b.向100μl感受态细胞中加入酶连质粒10μl，轻轻摇匀，置于冰上30min；c.42℃热激45s，再置于冰上冷却5min；d.向管中加入1ml lb培养基，37℃振荡培养60min后离心沉淀菌体，弃大部分上清后留100μl左右培养基，吹打重悬菌体后将其涂布于含300ng/μl红霉素的lb平板上，37℃培养16h；e.挑取单克隆，置于红霉素抗性的lb培养基中扩增培养后采用omega质粒小提试剂盒提取质粒；f.质粒送公司测序，比对基因序列，确定为重组表达载体pmg36e
‑
glp
‑
1质粒，pmg36e
‑
glp
‑
1质粒的核苷酸序列如seq id no.2所示。其中，编码人源glp
‑
1的核酸片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0071]
(6)制备植物乳杆菌感受态
[0072]
a.平板划线获得植物乳杆菌atcc 8014单菌落后接种于5ml含有5％葡糖糖的mrs液体培养中，37℃过夜培养；b.培养的菌液按1％体积比接种于含有2％甘氨酸和5％葡萄糖的mrs液体培养基中，37℃静置培养，期间测定菌体od
600
值；c.待od
600
值为0.5左右，置菌液于冰上10min，冷冻离心机4℃，5000rpm离心5min，收集菌体；d.用预冷的含10％蔗糖、10％
甘油混合溶液洗涤菌体，冷冻离心机4℃，8000rpm离心5min，收集菌体后再洗涤一次；e.最后将菌体以1/100体积重悬于含10％蔗糖、10％甘油混合溶液中，冰浴10min后备用。
[0073]
(7)植物乳杆菌电转化
[0074]
a.取2μl重组质粒(浓度高于100ng/μl)和50μl植物乳杆菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的0.2cm电击杯中，设置电击条件为1.5kv，400ω；
[0075]
b.将电击后的菌液转移至离心管中，加入0.9ml的含5％葡萄糖的mrs液体培养基中，37℃培养3h，离心沉淀菌体，弃大部分上清后留100μl左右培养基，吹打重悬菌体后将其涂布于含红霉素抗性的mrs平板上，37℃培养24
‑
48h，筛选阳性克隆子，得到l.plantarum
‑
pmg36e
‑
glp
‑
1表达系统，即工程菌l.plantarum
‑
pmg36e
‑
glp
‑
1，简称“工程菌”。
[0076]
2.elisa检测工程菌的培养上清中glp
‑
1的分泌表达
[0077]
(1)包被过程：将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl，置于37℃孵育4h，弃去孔中液体；(2)封闭酶标反应孔：反应孔加入5％小牛血清于37℃封闭40min。封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，结束后洗涤3次，每次3min；(3)加入待检测样品(建立合适的浓度梯度)：检测时采用1:50
‑
1:400的稀释度，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃孵育60min。加满洗涤液洗涤3次，每次3min；(4)加入酶标抗体：酶标抗体根据公司提供的参考工作稀释度进行。每孔100μl，37℃孵育30
‑
60min后洗涤3次，每次3min；(5)加入底物液(现用现配)：每孔100μl，37℃避光孵育3
‑
5min，加入终止液显色；(6)终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。结果如图1所示，图1中，l.plantarum：野生型植物乳杆菌；l.plantarum
‑
pmg36e
‑
glp
‑
1：工程菌。
[0078]
3.wb(western blot)检测工程菌的培养上清中glp
‑
1的分泌表达
[0079]
wb的实验步骤与本领域常用的相同。wb结果如图2所示。
[0080]
由图1和图2可知，工程菌构建成功后，经wb检测，可在工程菌培养上清中成功检测到glp
‑
1的蛋白表达(图2)，elisa试剂盒进行定量分析的结果显示，工程菌培养上清中glp
‑
1蛋白的表达量为80pg/ml。
[0081]
实施例2
[0082]
工程菌遗传稳定性及功能性评价
[0083]
1.重组质粒遗传稳定性评价
[0084]
为研究pmg36e
‑
glp
‑
1重组质粒在传代过程中的丢失情况，对工程菌进行质粒遗传稳定性评价。具体地，利用pmg36e
‑
glp
‑
1质粒中带有红霉素抗性基因，将构建的工程菌分别培养在含有红霉素和不含红霉素的mrs液体培养基，连续传代培养30天，每隔3天测定1次质粒稳定率。具体过程如下：
[0085]
a.挑取工程菌单菌落，接种于含有红霉素的mrs液体培养基中37℃过夜培养；b.第2天，以1/100的体积将培养的工程菌分别接种于含有红霉素和不含红霉素的mrs液体培养基中培养24h；c.之后每天用新的含有红霉素和不含红霉素的mrs液体培养基进行传代培养，培养至30天实验终止；d.同时，每隔3天取相应菌液进行平板划线(无抗性mrs平板)，随机选取100个单菌落点种于含有红霉素的mrs平板上，37℃培养24h，计算生长菌落数直至实验终止；e.根据100个点种于红霉素平板的菌落生长数，计算pmg36e
‑
glp
‑
1重组质粒遗传稳定率，结果表3所示。
[0086]
表3
[0087][0088]
由表3可知，在有红霉素选择压力条件下，质粒稳定率一直维持在100％，而在无红霉素选择压力条件下，重组质粒pmg36e
‑
glp
‑
1在无红霉素抗性培养基中连续培养6天的质粒稳定率为100％，而即使连续培养30天，质粒稳定率仍能达到86％。
[0089]
2.耐酸试验
[0090]
以1/100的体积接种植物乳杆菌l.plantarum和工程菌，在mrs液体培养基中传代培养18h。8000rpm离心5min，保留沉淀弃上清，再用无菌pbs缓冲液洗涤2次，分别将其各分装于5个1.5ml离心管中，8000rpm离心5min，得到野生型植物乳杆菌和工程菌菌体各5份。然后分别加入预先配置好的ph为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的pbs缓冲液，置于37℃培养箱静置培养2h，培养结束后取0h和2h菌悬液倍比(10倍)稀释，通过平板计数法测定活菌数，并计算野生型植物乳杆菌和工程菌菌株存活率，结果如图3所示。
[0091]
3.耐胆盐试验
[0092]
以1/100的体积接种植物乳杆菌l.plantarum和工程菌，在mrs液体培养基中传代培养18h。8000rpm离心5min，保留沉淀弃上清，再用无菌pbs缓冲液洗涤2次，分别将其各分装于5个1.5ml离心管中，8000rpm离心5min，得到野生型植物乳杆菌和工程菌菌体各5份。然后分别加入预先配置好的胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％的pbs缓冲液，置于37℃培养箱静置培养4h，培养结束后取0h和2h菌悬液倍比(10倍)稀释，通过平板计数法测定活菌数，并计算野生型植物乳杆菌和工程菌菌株存活率，结果如图4所示。
[0093]
4.抗氧化性试验
[0094]
(1)使用不添加l
‑
半胱氨酸的mrs液体培养基分别培养野生型植物乳杆菌和工程菌，10000rpm离心10min沉淀菌体，吸取上清液置于冷藏冰箱保存备用。
[0095]
(2)dpph自由基清除能力的测定：
[0096]
取1ml上清液与1ml配制好的dpph自由基的甲醇溶液混合，震荡均匀后避光条件下室温反应30min，517nm波长处测其od值(去离子水作为空白对照)。
[0097]
dpph自由基清除率：[1
‑
a
517
(样品)/a
517
(空白)]
×
100％
[0098]
(3)清除羟自由基的能力测定：
[0099]
取1ml上清液加入玻璃试管中(样品管)，空白管中加入1ml ddh2o，另分别加入1ml3mmol/l的水杨酸，1ml 1mmol/l的feso4，1ml 3mmol/l的h2o2，混合均匀后37℃水浴锅中反应15min，用分光光度计在510nm波长处测定吸光度。
[0100]
羟自由基清除率(％)＝[1
‑
a
510
(样品)/a
510
(空白)]
×
100％
[0101]
(4)清除超氧自由基能力的测定：
[0102]
配制tris
‑
hcl缓冲液(0.05mol/l，含1mmol/l na2edta)，取0.5ml上清液加到1号玻璃试管内，加入2ml的tris
‑
hcl溶液和1ml邻苯三酚溶液，2号管加0.5ml的去离子水，2ml的tris
‑
hcl溶液和1ml邻苯三酚溶液，3号管加1.5ml的去离子水，2ml tris
‑
hcl溶液，4号管加1ml的去离子水，0.5ml细菌上清液和2ml tris
‑
hcl溶液。
[0103]
超氧自由基清除率(％)＝[1
‑
(a
11
‑
a
10
)/(a
01
‑
a
00
)]
×
100％
[0104]
a
00
：不含样品和邻苯三酚；a
01
：不含样品含邻苯三酚
[0105]
a
10
：含样品不含邻苯三酚；a
11
：含样品和邻苯三酚
[0106]
(5)对亚铁离子螯合能力的测定：
[0107]
取0.5ml上清液加到玻璃管内，加入0.1ml 2mol/l的feso4，0.1ml 1％的维生素c和1ml 0.2mol/l的naoh溶液，混匀后37℃反应20min，继续加入10％的三氯乙酸，冷冻离心机4℃，6000rpm 10min离心沉淀蛋白。取0.4ml的上清，加入4ml邻二氮菲。空白对照中加入0.5ml的ddh20，其他相同。室温反应10min后536nm处测定吸光度。
[0108]
fe
2+
螯合能力＝(a
空白
‑
a
样品
)/a
空白
×
100％
[0109]
(6)还原活性的测定：
[0110]
取1ml细菌上清液，加入1ml 0.2mol/l pbs缓冲液和1ml 1％的铁氰化钾，混匀后50℃反应20min后加入1ml 10％的三氯乙酸，6000rpm 10min离心沉淀反应物。取1ml的混合液，加入4ml的ddh20和0.4ml 0.1％的fecl3溶液，室温反应10min。空白对照管加1ml的ddh20，其他加的试剂和处理情况相同。静置后700nm波长处测吸光度。
[0111]
抗氧化试验结果如图5所示。
[0112]
5.抑菌试验
[0113]
接种野生型植物乳杆菌和工程菌于mrs培养基中培养16h，8000rpm离心10min后去上清液。另取20μl过夜培养的8种致病菌(大肠杆菌o157，金黄色葡萄球菌，乙型溶血性链球菌，福氏志贺，白色念珠菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，单增李斯特菌)分别涂布在lb固体培养基的平板中，放上牛津杯，吸取250μl细菌上清液于牛津杯中，37℃培养箱培养8h后测量抑菌圈直径，结果如图6所示。
[0114]
6.细胞粘附试验
[0115]
接种野生型植物乳杆菌和工程菌于mrs培养基中培养，待od值达到0.6后终止培养，保留备用。六孔细胞培养板中放入无菌的盖玻片，将肠道上皮细胞ht
‑
29传代于细胞培养板上，待细胞面积至占培养孔面积的30％时，分别接种野生型植物乳杆菌和工程菌，37℃细胞培养箱继续培养2h。吸出培养基，小心取出盖玻片，用pbs缓冲液清洗3次，甲醇固定后进行革兰氏染色，油镜下观察细菌在ht
‑
29细胞上的粘附情况，结果如图7所示。
[0116]
由图3～图7可知，在耐酸实验中，在ph＝2的pbs环境中培养2h，野生型植乳乳杆菌
与工程菌数量均能达到107cfu/ml以上，具有较强的耐酸能力(图3)。在耐胆盐实验中，工程菌和野生型植物乳杆菌均表现出良好的胆盐耐受性，在0.5％的胆盐浓度下培养2h，两株菌均能达到107cfu/ml以上，两者之间无显著差异(图4)。然后，对两株菌的抗氧化性进行评价的试验中，工程菌和野生型植物乳杆菌发酵上清液对dpph自由基的清除率分别为92.7％，89.6％；羟基自由基的清除率分别为54.4％，49.9％；超氧自由基的清除率分别为60.8％，58.5％；亚铁离子的清除率分别为40.9％，37.4％以及总还原能力分别为234.7μg/l，223.3μg/l。两株菌均表现出良好的抗氧化性且无显著差异(图5)。最后，评价了两株菌对致病菌的抑制作用以及对肠道上皮细胞的粘附能力，抑菌实验中，工程菌和野生型植物乳杆菌对7种致病菌的抑制能力分别为14mm～24mm，12mm～27mm(图6)。细胞粘附实验中，工程菌对肠道上皮细胞(ht
‑
29)的粘附能力为1235cfu/100细胞，与野生型植物乳杆菌(1312cfu/100细胞)相比无显著差异(图7)。
[0117]
综上可知，实施例1构建的工程菌能够分泌glp
‑
1，具有较强的耐酸、耐胆盐、细胞粘附、抗氧化和抑制致病菌生长能力，此外还具有稳定的质粒遗传性能。
[0118]
实施例3
[0119]
1.t2dm小鼠模型的建立及治疗
[0120]
(1)造模过程：60只8周龄(体重在20g
‑
22g)c57bl/6雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物公司。以正常饲料适应性喂养一周后测量血糖体重，并给予高脂饲料(购自江苏协同生物)喂养9周。随机选取其中12只小鼠作为对照组，其余小鼠连续5天腹腔注射30mg/kg stz(溶于0.1mol/l的柠檬酸缓冲液，ph＝4.5)。每隔3天监测小鼠血糖，当空腹血糖高于11.1mmol/l时纳入研究，并将糖尿病小鼠随机分成模型组，植物乳杆菌治疗组，工程菌治疗组和阳性药物艾塞那肽治疗组。小鼠动物伦理审查批准编号：rye2019100801。
[0121]
(2)实验分组及给药剂量
[0122]
a.对照组(c组，n＝12)：灌胃100μl细菌包被液(0.9％的生理盐水中含有0.01％的明胶)，每天1次，持续治疗9周；b.模型组(m组，n＝12)：灌胃100μl细菌包被液，每天1次，持续治疗9周；c.植物乳杆菌治疗组(lac组，n＝12)：灌胃100μl以包被液重悬植物乳杆菌，菌液浓度为10
10
cfu/ml，每天1次，持续治疗9周；d.工程菌治疗组(lac
‑
g组，n＝12)：灌胃100μl以包被液重悬工程菌，菌液浓度为10
10
cfu/ml，每天1次，持续治疗9周；e.艾塞那肽组(p组，n＝12)：腹腔注射阳性药物glp
‑
1受体激动剂艾塞那肽(24nmol/kg/d)治疗，每天1次，持续治疗9周。
[0123]
2.小鼠表型检测及样本处理
[0124]
(1)血糖体重：造模成功后开始治疗，检测血糖前小鼠禁食12h，并通过尾静脉取血检测小鼠血糖，体重测量在血糖测量前一天进行，每周检测一次血糖体重观察治疗效果，结果如图8和图9所示。
[0125]
(2)葡萄糖耐量实验(gtt)：在实验结束前一周进行。实验前小鼠禁食16h，再根据体重腹腔注射葡萄糖(2g/kg)，然后在注射后不同时间点(0，30，60，90，120min)尾静脉取血检测血糖变化，结果如图10和图11所示。
[0126]
(3)粪便收集：在治疗结束前一天收集小鼠粪便3
‑
5粒，冷冻于
‑
80℃冰箱用于高通量测序。
[0127]
(4)组织样本收集：实验结束后解剖小鼠，取胰腺、肝脏、肠道等器官，置于
‑
80℃冰
箱或4％的多聚甲醛固定液中保存。
[0128]
在图8～图11中，c：正常对照组；m：模型组；lac：植物乳杆菌治疗组；lac
‑
g：glp
‑
1工程菌治疗组；p：阳性药物艾塞那肽治疗组。*表示p<0.05,**表示p<0.01。
[0129]
由图8～图11可知，用hfd喂养两个月后联合stz注射的方式构建t2dm小鼠模型。在造模成功后，除c组外，其它组小鼠的血糖均显著上升至11.1mmol/l以上(图8)。治疗4周后，工程菌治疗组小鼠血糖开始呈现下降趋势，在第5周时，工程菌组血糖与m组相比显著降低(15.6mmol/l vs.21.6mmol/l，p<0.05)。其中，阳性药物艾塞那肽治疗组在第3周呈现较好的治疗效果(16.6mmol/l vs.23.3mmol/l，p<0.05)并持续至治疗结束，而m组小鼠血糖一直维持在较高水平(图8)。t2dm小鼠采用hfd饲料喂养，长期喂食高热量饮食易导致肥胖。体重测量结果表明，c、m和lac组小鼠体重随着喂食时间的延长而增长。与p组治疗效果类似，工程菌可以抑制小鼠体重的增长(图9)。此外，ipgtt结果表明，与m组相比，工程菌治疗显著提高了小鼠的血糖耐量；葡萄糖曲线下面积(auc)分析也有类似的结果，与lac
‑
g组(1882.67vs.3480，p<0.01)或p组(1797.67vs.3480，p<0.01)相比，m组具有最大的auc值(图图10和图11)。
[0130]
3.蛋白水平检测(wb)
[0131]
(1)组织蛋白提取：取少量胰腺组织于离心管中，加入适量的ripa裂解液(含cocktail蛋白酶抑制剂)，剪碎后匀浆机匀浆，操作过程尽量在冰上进行。冷冻离心机4℃，13000rpm离心10min，将蛋白上清转移至新的离心管。
[0132]
(2)bca法定量蛋白：根据样品数量，按a液和b液50：1配制bca工作液。稀释标准品，得到8个不同浓度的标准品(2000μg/ml，1500μg/ml，1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml)。加适量体积的样品和标准品，随后各孔加入200μl bca工作液，37℃孵育10min。测定吸光度，绘制标准曲线，计算出蛋白浓度后将各组蛋白稀释至相同浓度。
[0133]
(3)电泳：将样品与上样缓冲液混合，98℃蛋白变性5min。置于冰上冷却后简短离心，上样至sds
‑
page胶孔内。电压设置为110v，1.5
‑
2h，具体时间根据蛋白分子量大小设置。
[0134]
(4)转膜：根据分子量剪取合适大小的0.22μm或0.45μm pvdf膜，采用湿转法转膜，一般恒流220ma转1
‑
2h，具体时间根据蛋白分子量大小设置。
[0135]
(5)封闭：转膜完毕后，tbst缓冲液稍冲洗后加入封闭液(5％脱脂乳或5％bsa)，摇床上缓慢摇动，室温封闭1.5h。
[0136]
(6)一抗孵育：倒掉封闭液，tbst缓冲液稍冲洗后加入对应的一抗(根据抗体说明书，用1％的脱脂乳或bsa配制)，摇床上缓慢摇动，4℃孵育过夜。
[0137]
(7)二抗孵育：一抗回收后tbst缓冲液洗涤3次，每次5min。加入对应的二抗，摇床上缓慢摇动，室温封闭1.5h后去除二抗，继续用tbst缓冲液洗涤3次，每次5min。
[0138]
(8)显影：根据说明书1:1配制显影液，现配现用。tanon 5200全自动化学发光成像分析系统上进行曝光。
[0139]
各组胰腺组织中tlr
‑
4、myd88、p
‑
nfκb和nfκb的表达水平结果如图12～图15所示；各组胰腺组织中bax、bcl
‑
2、p
‑
akt、akt的表达水平结果如图16～18所示。
[0140]
4.转录水平检测(q
‑
pcr)
[0141]
(1)取少量胰腺组织于离心管中，加入1ml trizol，剪碎后匀浆机匀浆，操作过程
尽量在冰上进行。冷冻离心机4℃下以5000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。
[0142]
(2)再加入160μl氯仿后振荡混匀，冷冻离心机4℃以13000rpm离心15min，小心吸取上清至新的离心管中，不要吸到蛋白层。
[0143]
(3)吸取等体积的异丙醇于离心管中，颠倒混匀后冷冻离心机4℃以13000rpm离心10min，弃去上清。
[0144]
(4)离心管中加入1ml 75％乙醇进行充分洗涤，冷冻离心机4℃以13000rpm离心10min，弃去上清。
[0145]
(5)再次加入无水乙醇1ml，重复步骤(4)。
[0146]
(6)室温下静置20min。
[0147]
(7)加入160μl无核酶水，在55℃水浴锅溶解rna。
[0148]
(8)测定rna浓度。
[0149]
(9)逆转录：
[0150]
步骤1：基因组dna去除步骤，反应体系如下表4：
[0151]
表4
[0152][0153]
42℃，2min，4℃。
[0154]
步骤2：逆转录反应步骤，反应体系如下表5：
[0155]
表5
[0156][0157]
step 1：37℃，15min；step 2：85℃，5s；step 3：4℃。用无核酶水3倍稀释逆转录完的cdna，立即使用。
[0158]
(10)将cdna作为模板进行q
‑
pcr反应，反应体系如下表6所示，其中引物序列如表7所示。
[0159]
表6
[0160][0161]
每孔总反应体系为20.0μl。
[0162]
表7
[0163][0164]
整个反应过程如下：第一阶段：95℃30s；第二阶段：95℃5s，60℃34s，40循环；第三阶段：95℃15s，60℃60s，95℃15s。
[0165]
胰腺中促炎细胞因子il
‑
1β、il
‑
6和tnfα的转录水平结果如图19～21所示。在图12～图21中，c：正常对照组；m：模型组；lac：植物乳杆菌治疗组；lac
‑
g：glp
‑
1工程菌治疗组；p：阳性药物艾塞那肽治疗组。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
[0166]
机体的慢性炎症在t2dm的发生发展中起到促进作用，为探讨工程菌对胰腺组织炎症的影响，本技术研究了炎症相关通路(nfκb信号转导)中的关键蛋白和基因。由图12～图15可知，与m组相比，工程菌和艾塞那肽的治疗显著降低tlr
‑
4(1.16vs.0.79和0.72)、myd88(1.20vs.0.77和0.65)和p
‑
nfκb/nfκb(1.42vs.0.79和0.79)的表达(图12～图15；p<0.01)。此外，由图19～图21可知，相比于m组，工程菌和艾塞那肽显著降低了促炎细胞因子il
‑
1β(2.87vs.1.64和1.51)、il
‑
6(2.78vs.2.20和1.84)和tnfα(7.65vs.3.18和2.78)的相对表达(图19～图21；p<0.01)。由此可知，工程菌能显著抑制诱发型t2dm小鼠的胰腺组织炎症，保护胰岛β细胞。
[0167]
胰岛细胞的增殖和凋亡调控着t2dm的进程，对胰腺组织增殖和凋亡相关蛋白的研究结果表明，相比于m组，工程菌和艾塞那肽治疗显著降低了bax/bcl
‑
2的比值(2.00vs.0.79和0.89，p<0.01)，显著增加了p
‑
akt/akt的比值(0.73vs.0.96和1.22，p<0.05)(图16～图18)，说明工程菌的摄入抑制了胰腺细胞的凋亡。
[0168]
5.组织病理检测(he、免疫荧光)
[0169]
(1)he染色
[0170]
a.石蜡切片常规脱蜡至水：二甲苯i脱蜡10min，二甲苯ii脱蜡10min，梯度乙醇(无水乙醇i，无水乙醇ii，95％酒精，90％酒精，85％酒精)各1min，最后自来水冲洗2min；b.染色：苏木精染色3min，自来水洗1min，1％盐酸酒精分化20s，自来水洗1min，稀氨水(1％)反蓝30s，自来水洗1min，伊红染色20s至5min，自来水洗30s；c.脱水、透明、封片：85％酒精脱
水20s，90％酒精30s，95％酒精i1min，95％酒精ii 1min，无水乙醇i 2min，无水乙醇ii 2min，二甲苯i 2min，二甲苯ii 2min，二甲苯iii 2min，中性树胶封片。he染色的结果如图22所示。
[0171]
由he染色结果可见，m组小鼠胰岛细胞萎缩严重，胰岛细胞团数量和形态明显缩小，而工程菌和艾塞那肽治疗显著抑制了胰岛细胞的凋亡，促进了胰岛的修复。
[0172]
(2)免疫荧光
[0173]
a.脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯30min，无水乙醇5min，95％乙醇5min，85％酒精5min，75％酒精5min，50％酒精5min，ddh2o冲洗5min；b.抗原修复：切片置于柠檬酸抗原修复液，于微波炉内抗原修复，设置中火8min，停火8min，中低火7min。此过程中应防止缓冲液过度蒸发导致干片。自然冷却后将玻片置于pbs缓冲液(ph7.4)中，在摇床上低转速晃动洗涤3次，每次5min；c.画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。若为胞内抗原，则需0.5％triton x
‑
100(pbs缓冲液配制)室温通透30min；d.bsa封闭：在圈内滴加5％浓度的bsa(1g的bsa溶于20ml ddh2o中)孵育封闭30min；e.一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加一抗后平放于暗盒内(内加少量水防止抗体蒸发)，4℃孵育过夜；f.二抗孵育：玻片置于pbs缓冲液中，在摇床上低转速晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在阻水圈内滴加相应的荧光二抗，暗盒内室温孵育1h；g.dapi染核：玻片置于pbs缓冲液中，在摇床上低转速晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加dapi染液，暗盒内室温孵育5min；h.树脂封片：玻片置于pbs缓冲液中，在摇床上低转速晃动洗涤3次，每次5min。滴加适量的防荧光淬灭剂，稍甩干后用树脂封片剂封片。免疫染色的结果如图23所示。
[0174]
胰岛素免疫荧光染色也有类似he染色的结果，m组小鼠分泌胰岛素的β细胞显著减少，而工程菌和艾塞那肽治疗显著恢复了insulin+细胞的数量，促进了胰岛β细胞增殖，提高了胰岛素的表达。
[0175]
对诱发型t2dm小鼠胰腺中凋亡和增殖相关蛋白的检测、胰腺组织he染色证明了工程菌和艾塞那肽治疗显著抑制了诱发型t2dm小鼠的胰腺细胞凋亡和胰岛细胞团的萎缩，同时促进了胰岛细胞增殖。此外，胰岛素免疫荧光染色表明工程菌促进了胰岛细胞修复，提高了胰岛素的表达。
[0176]
6.肠道菌群分析
[0177]
将实验中收集的小鼠粪便送至上海派森诺公司进行16s rdna高通量测序分析。基本流程为：提取粪便细菌基因组dna，高通量测序得到原始数据后，使用cut adapt软件和uchime算法处理来自原始dna片段的配对末端。随后使用uparse软件包进行序列分析，并将具有≥97％相似性的序列分配到相同的操作分类单元(otu)。对每个样品匹配到的otu的reads数进行统计，并依据匹配到otu的最小序列数进行随机抽平处理，然后进行alpha多样性分析。从每个otu中提取出一条丰度最高的代表序列，并将该序列与rdp数据库进行比对，从而对每个otu进行物种分类，得到物种丰度表后再进行后续分析。结果如图24～图28所示。
[0178]
收集各组小鼠粪便，通过高通量测序对肠道菌群进行分析，共获得了1424085个有效标签和11730个otu，平均每组2346个。为了进一步分析工程菌对t2dm小鼠肠道菌群的影响，进行了菌群α多样性分析，shannon指数用于评估肠道菌群丰富度，chao1指数用于评估
菌群多样性。如图所示，m组小鼠的shannon指数和chao1指数显著降低，而植物乳杆菌、工程菌和艾塞那肽显著提升了肠道微生物丰度和多样性(图24和25)。venn图(图26)结果表明，从所有组别中鉴定出317个共同的otu，在c、m、lac、lac
‑
g和p组中唯一的otu数分别为39、42、27、23和35。此外，用于研究微生物群落相似性的主成分分析(pca)(图27)表明，c组斑点聚集，m组相对分散，而植物乳杆菌、工程菌和艾塞那肽组的样品具有较高的相似性，与c组和m组没有明显的交集，说明lac、lac
‑
g和p组具有较为独立的微生物群。在属的水平上，选择一些与糖尿病密切相关的典型细菌细菌进行分析。由图28可知，糖尿病模型显著增加了odoribacter，bacteroides，acetatifactor和desulfovibrio的相对丰度(p<0.05)。相比于m组，工程菌治疗提升了alloprevotella，akkermansia，saccharibacteria_genera_incertae_sedis，clostridium xlva，lactobacillus和clostridium iv的相对丰度(p<0.05)，降低了alistipes，helicobacter，bacteroides，acetatifactor，desulfovibrio的相对丰度(p<0.05)；艾塞那肽治疗提升了akkermansia和lactobacillus的相对丰度(p<0.05)，降低了odoribacter，bacteroides，acetatifactor和desulfovibrio的相对丰度(p<0.05)。
[0179]
由上可知，与m组相比，工程菌治疗增加了肠道菌群的多样性和丰富度，促进了肠道稳态的恢复。
[0180]
综上所述，本技术的研究结果表明，工程菌通过抑制胰腺炎症和胰岛细胞凋亡，增加肠道益生菌akkermansia和lactobacillus从而逆转了hfd联合stz诱导的t2dm模型小鼠的血糖，改善了糖耐量，并抑制小鼠体重增长。本研究在t2dm动物模型上，通过多种技术手段进行多方面机制分析，为新型t2dm药物的开发和临床应用提供了参考依据。益生菌作为药物载体，不仅解决了现存蛋白质肽类需静脉注射给药给患者带来的痛苦，而且通过益生菌和效应蛋白的联用可直接(效应蛋白作用)和间接(益生菌恢复肠道菌群稳态)起到治疗疾病的目的，有助于放大治疗效果。
[0181]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0182]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。