D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶及其制备方法与流程

d
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶固定化酶及其制备方法
技术领域
1.本技术涉及生化工程技术领域，具体涉及一种d
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶(简称dpe)固定化酶及其制备方法。


背景技术：

2.随着人们对健康饮食的日益重视，研发健康安全的低热量功能性甜味剂成为食品行业研究的重点。d
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阿洛酮糖作为自然界中天然存在但含量极少的低热量功能性甜味剂，已经成为人们研究的热点。
3.d
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阿洛酮糖(d
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allulose)又名d
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核糖
‑2‑
己酮糖，是d
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果糖的c
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3位的差向异构体。d
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阿洛酮糖是一种天然存在但有含量极少的低热量功能性甜味剂，其甜度为蔗糖的70％，但能量仅为蔗糖的0.3％，可以用作低卡路里减肥食品的甜味剂。同时，d
‑
阿洛酮糖还具有抑制肝中脂质合成有关酶活性的功能，有助于减少腹部脂肪堆积，并能一定程度上控制体重，可以用于健康食品等各种各样的功能性食品。此外，d
‑
阿洛酮糖还能够改善食品风味、外观等，延长食品的保存期限。因此，d
‑
阿洛酮糖这种健康安全的低热量功能性甜味剂已获得越来越多的关注，成为最具市场竞争力的新型甜味剂之一。
4.d
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阿洛酮糖的制备过程可以分为化学制备和生物制备。化学制备法由于纯化产物步骤复杂，化学污染严重以及一些副产物杂多等一系列的原因，未得到有效应用。1990年，日本香川大学(kagawa university)泉森(izumori)团队首次报道了1株产碱杆菌属细菌(azcaligenes sp.701b)静息细胞能以阿洛糖醇、d
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塔格糖或半乳糖醇为底物生产d
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阿洛酮糖，开辟了d
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阿洛酮糖酶法转化生产的先河。酶转化技术因具有反应单一，纯化步骤简单等优点而逐渐成为d
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阿洛酮糖制备研究的主要方向，迄今已有10余年的历程。现有酶转化技术多采用改良的重组菌株制备d
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阿洛酮糖3
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差向异构酶(d
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psicose3
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epimerase，缩写为dpe)，并通过整体细胞或粗酶的批次转化工艺，将果糖转化为d
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阿洛酮糖，酶只能利用一次，酶的利用率极低。采用固定化酶转化工艺，可以实现连续转化，有效提高了酶的利用率。目前文献报道的dpe固定化酶技术主要以海藻酸钠作为固定化的载体，但海藻酸钠在高浓度的电解质溶液中性质不够稳定、容易变软，并且使用海藻酸钠作为载体时，需要加入戊二醛作为交联剂，戊二醛有一定毒性，且对金属有腐蚀作用，因此，开发制备过程中不使用有毒有害物质的dpe固定化酶，具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术的缺点及不足之处，本技术提供一种dpe固定化酶及其制备方法，dpe固定化酶采用大孔树脂作为载体，dpe与大孔树脂通过共价键结合在一起，所述dpe固定化酶具有良好稳定性和酶催化活性，而且大孔树脂属于人工合成的材料，该载体的物理性能和化学性能稳定，抗腐蚀性强，树脂材料本身强度较大，不易出现变形或损坏，且制备过程中不使用有毒有害物质，使得所述dpe固定化酶可以实现d
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阿洛酮糖的连续转化，有效提高了酶的利用率。
6.本技术提供如下技术方案。
7.1、一种d
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶(简称dpe)固定化酶，其特征在于，包括酶载体和dpe。
8.2、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述dpe与酶载体的酶活质量比(u/g)为(70～400):1，优选为(100～250):1。
9.3、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述酶载体为大孔树脂；所述酶载体与dpe通过共价键结合在一起。
10.4、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。
11.5、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。
12.6、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述酶载体为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有疏水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。
13.7、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述酶载体选自带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。
14.8、根据项1所述的dpe固定化酶，其特征在于，所述dpe固定化酶的酶活为20u/g～60u/g，优选为35u/g～60u/g。
15.9、一种dpe固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将dpe酶液与酶载体混合，摇床振荡，形成混合液，弃去所述混合液的上层液体，洗涤所述混合液的下层固体，从而得到dpe固定化酶。
16.10、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述摇床振荡的时间为10～36h，优选为12～20h。
17.11、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述dpe与酶载体混合后，摇床振荡反应的温度为15～35℃，优选为20～25℃。
18.12、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述dpe与酶载体酶活质量比(u/g)为(70～400)：1，优选为(100～250)：1。
19.13、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为大孔树脂；所述酶载体与dpe通过共价键结合在一起。
20.14、根据项9所述的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。
21.15、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。
22.16、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂或带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有疏水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。
23.17、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体选自带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大
孔树脂。
24.18、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述dpe固定化酶的酶活为20u/g～60u/g，优选为35u/g～60u/g。
25.本技术提供的dpe固定化酶，采用大孔树脂作为载体，dpe与大孔树脂通过共价键结合在一起形成具有良好的稳定性和酶催化活性的dpe固定化酶，而且大孔树脂属于人工合成的材料，该载体的物理性能和化学性能稳定，抗腐蚀性强，树脂材料本身强度较大，不易出现变形或损坏，使得所述dpe固定化酶可以连续循环使用，有效提高了酶的利用率，预期可以大幅降低生产成本。
附图说明
26.附图用于更好地理解本技术，不构成对本技术的不当限定。其中：
27.图1为不同底物浓度条件下，酶载体rc01制备的dpe固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图。
28.图2为750g/l底物浓度条件下，酶载体rc01制备的dpe固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图。
29.图3为750g/l底物浓度条件下，酶载体rc04制备的dpe固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图。
具体实施方式
30.以下对本技术的示范性实施例做出说明，其中包括本技术实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本技术的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
31.本技术提供一种dpe固定化酶，包括酶载体和dpe。
32.在本技术中，所述dpe与酶载体的酶活质量比(u/g)为(70～400)：1，优选为100～250u/g；
33.所述dpe与酶载体的酶活质量比(u/g)可以为70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1、200:1、210:1、220:1、230:1、240:1、250:1、260:1、270:1、280:1、290:1、300:1、310:1、320:1、330:1、340:1、350:1、360:1、370:1、380:1、390:1、400:1中的一种。
34.在本技术中，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。
35.在本技术中，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。
36.在本技术中，所述酶载体可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂；所述酶载体还可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有疏水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。
37.所述酶载体可以具有以下基团中的一种或多种：羧酸基、羟基、磺酸基、磷酸基、氨基、铵基、烃基、酯基、聚氧丙烯基、长链全氟烷基、聚硅氧烷基。
38.在本技术中，所述酶载体可以为带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂
或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。如西安蓝晓的lx
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1000ep、lxte
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606、lx
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103b、1000ea等。
39.环氧基大孔树脂表面的活性功能基团，可以在温和条件下与酶分子上的氨基、巯基和酚羟基等非必须基团发生多点共价键结合反应，将酶固定在树脂载体上，形成具有良好稳定性和酶催化活性的固定化酶。
40.所述胺基大孔树脂在使用前用戊二醛活化可以在其表面形成醛基，与酶分子表面的胺基发生反应形成schiff碱，生成牢固的多点共价键合位点，从而形成稳定性良好的固定化酶。
41.在本技术中，所述dpe固定化酶的酶活为20u/g～60u/g，优选为35u/g～60u/g。
42.所述dpe固定化酶的酶活可以为20u/g、21u/g、22u/g、23u/g、24u/g、25u/g、26u/g、27u/g、28u/g、29u/g、30u/g、31u/g、32u/g、33u/g、34u/g、35u/g、36u/g、37u/g、38u/g、39u/g、40u/g、41u/g、42u/g、43u/g、44u/g、45u/g、46u/g、47u/g、48u/g、49u/g、50u/g、51u/g、52u/g、53u/g、54u/g、55u/g、56u/g、57u/g、58u/g、59u/g、60u/g中的一种。
43.本技术还提供一种dpe固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
44.步骤一：dpe酶液的制备：发酵培养含dpe基因的菌株，离心收集菌体细胞，用ph7.5的磷酸盐缓冲液(pbs)重悬菌体，并用高压均质机破碎细胞，然后离心得到的上清液，即为dpe酶液。
45.上述菌株的来源，可以通过基因工程方法构建获得，也可以通过筛选获得，也可以通过购买获得，所述菌株，可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等种属的任何含有dpe酶的菌株。
46.步骤二：将dpe酶液与酶载体混合，摇床振荡使得dpe被固定到酶载体上，摇床振荡后形成混合液，静置分层，弃去所述混合液的上层液体，取1.5～2.0倍酶载体体积的去离子水缓慢搅拌漂洗位于所述混合液下层的固体,将所述固体反复漂洗多次，直至上层液体澄清为止，去掉上清液，下层的固体即为dpe固定化酶。
47.所述dpe酶液的酶活为20～120u/ml，优选为25～100u/ml。即1ml dpe酶液中酶活为20～120u，优选为25～100u。
48.所述dpe酶液的酶活可以为20u/ml、21u/ml、22u/ml、23u/ml、24u/ml、25u/ml、26u/ml、27u/ml、28u/ml、29u/ml、30u/ml、31u/ml、32u/ml、33u/ml、34u/ml、35u/ml、36u/ml、37u/ml、38u/ml、39u/ml、40u/ml、41u/ml、42u/ml、43u/ml、44u/ml、45u/ml、46u/ml、47u/ml、48u/ml、49u/ml、50u/ml、51u/ml、52u/ml、53u/ml、54u/ml、55u/ml、56u/ml、57u/ml、58u/ml、59u/ml、60u/ml、61u/ml、62u/ml、63u/ml、64u/ml、65u/ml、66u/ml、67u/ml、68u/ml、69u/ml、70u/ml、71u/ml、72u/ml、73u/ml、74u/ml、75u/ml、76u/ml、77u/ml、78u/ml、79u/ml、80u/ml、81u/ml、82u/ml、83u/ml、84u/ml、85u/ml、86u/ml、87u/ml、88u/ml、89u/ml、90u/ml、91u/ml、92u/ml、93u/ml、94u/ml、95u/ml、96u/ml、97u/ml、98u/ml、99u/ml、100u/ml、105u/ml、110u/ml、115u/ml、120u/ml中的一种。
49.在本技术中，所述摇床振荡的时间为10～36h，优选为12～20h。
50.所述摇床振荡的时间可以为10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h以及36h中的一种。
51.在本技术中，所述dpe酶液与酶载体混合后，摇床振荡反应的温度为15～35℃，优选为20～25℃。
52.所述摇床振荡反应的温度可以为15℃、20℃、25℃、30℃以及35℃中的一种。
53.在本技术中，洗涤所述混合液的下层固体的次数为2～8次，优选为3～5次。
54.洗涤所述混合液的下层固体的次数可以为2次、3次、4次、5次、6次、7次以及8次中的一种。
55.dpe酶液的酶活测定：取1ml浓度为10g/l的果糖溶液，加入10μl稀释10倍的dpe酶液，恒温水浴55度反应20分钟，于沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液稀释5倍用高效液相色谱检测(hplc检测)。
56.dpe固定化酶的酶活测定：取10ml浓度为10g/l的果糖溶液，加入0.1～0.5g滤纸过滤后的dpe固定化酶，水浴摇床55℃恒温120rpm反应20min，吸取1ml上清溶液，沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液用hplc检测并计算酶活。
57.酶活力单位u定义为：单位时间内产生1μmol的d
‑
阿洛酮糖所需要的酶量。
58.hplc检测条件如下：agilent 1260高效液相色谱系统，waters公司；aminex hpx
‑
87n色谱柱，waters公司；agilent示差折光检测器；柱温：80℃，流速：1ml/min；以经0.22μm孔径的醋酸纤维膜过滤后并超声脱气的纯水作为流动相。
59.实施例
60.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
61.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
62.实施例1dpe酶液的制备
63.挑取含有dpe基因序列的重组大肠杆菌至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养；然后以1％的接种量接入装有3.5llb培养基的5l发酵罐中，控制培养温度37℃、搅拌转速300rpm、通风比为1：0.5的条件下，培养至od值达到0.6
‑
0.8时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，调整转速至100rpm诱导培养15
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16h。然以8000rpm离心收集菌体细胞、再用ph为7.5的磷酸盐缓冲液(pbs)重悬菌体、用高压均质机破碎细胞，然后在4℃、10000rpm离心得到的上清液，即为dpe酶液，取样测定dpe酶活。
64.实施例2.dpe固定化酶制备
65.选择dpe与酶载体的酶活质量比(u/g)250：1条件，分别称取9种酶载体各10g置于三角瓶中，根据dpe酶液的酶活检测结果，加入2500u的dpe酶液，混合均匀后，密封瓶口，于25℃摇床缓慢振荡20h，弃去上层液体，采用去离子水约20ml充分洗涤下层固体，弃去洗涤液，反复洗涤5次，即得到dpe固定化酶，取样检测dpe固定化酶酶活。结果如表1所示，以dpe固定化酶酶活比较，中性疏水型环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于弱碱性疏水型胺基聚苯乙烯类大孔树脂，优于中性亲水型环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于弱碱型亲水性胺基聚苯乙烯类大孔树脂。对于弱碱性胺基聚苯乙烯类大孔树脂，戊二醛活化后使用，dpe固定化酶明显提高。
66.表1.不同酶载体的dpe固定化酶酶活比较
[0067][0068]
注：rc07与rc04采用相同的酶载体，但是rc07的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化；rc08与rc05采用相同的酶载体，但是rc08的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化；rc09与rc06采用相同的酶载体，但是rc09的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化。
[0069]
实施例3.dpe酶与酶载体的酶活质量比优选
[0070]
根据实施例2结果，分别称量载体rc01、rc02各10g置于三角瓶中，根据dpe酶液的酶活检测结果，分别按照酶活载体质量比(u/g)60：1、70：1、100：1、200：1、250：1、400：1，计算并加入相应酶活单位的dpe酶液，混合均匀后，密封瓶口，进行dpe固定化酶制备，固定化条件、洗涤方法和洗涤次数与实施例1相同，取样检测dpe固定化酶酶活。结果如表2，从表2可知，dpe与酶载体的酶活质量比在(60～250):1范围内时，两者的比例越高，dpe固定化酶的酶活越高，但当两者的比例由250：1提高到400：1时，dpe固定化酶的酶活不再显著提高，说明dpe与酶载体的酶活质量比大于250u/g时，载体上的活性功能基团与酶分子的结合趋于饱和，固定化酶的酶活不再显著增加，当dpe与酶载体的酶活质量比小于70u/g时，载体上的活性功能基团与dpe酶分子的结合效率低，载体利用不充分，dpe固定化酶的酶活较低，优选的dpe酶与酶载体的酶活质量比(u/g)为(100～250):1。
[0071]
表2.dpe与酶载体的酶活质量比优选
[0072][0073]
实施例4.dpe固定化酶转化底物浓度的选择
[0074]
取树脂载体rc01制备的dpe固定化酶100ml装入带套管的玻璃制柱中，控制套管温度55℃，分别以200g/l、400g/l、650g/l、750g/l的果糖溶液为底物，控制进料流速40ml/h，进行dpe固定化酶连续转化，当反应平衡后，定时取样检测d
‑
阿洛酮糖浓度及转化率，结果如图1所示，d
‑
阿洛酮糖平均转化率均能达到29％以上。综合考虑，可以选取750g/l果糖底物浓度，进行固定化酶连续转化。
[0075]
实施例5.dpe固定化酶连续转化
[0076]
取酶载体rc01、rc04制备的dpe固定化酶各100ml，分别装入2个带套管的玻璃反应器中，控制套管温度55℃，选取750g/l的果糖浓度，以40ml/h的流速，进行dpe固定化酶连续转化，当反应平衡后，定时取样检测d
‑
阿洛酮糖浓度及转化率，直至转化率明显下降为止，计算连续转化反应时间。
[0077]
结果如图2和图3所示，酶载体rc01制备的dpe固定化酶，连续转化14天，果糖平均转化率达到29.35％、转化液中d
‑
阿洛酮糖的浓度达到220g/l以上(见图2所示)，第15天转化率大幅下降；酶载体rc04制备的dpe固定化酶，连续转化8天，果糖平均转化率达到28.02％、转化液中d
‑
阿洛酮糖的浓度达到210g/l以上(见图3所示)，第9天转化率大幅下降。
[0078]
小结：根据本技术的方法制备的dpe固定化酶可以实现d
‑
阿洛酮糖的连续转化，用酶载体rc01，连续化反应的时间可达14天，用酶载体rc04，连续化反应的时间可达8天。与单批次液体酶转化dpe只能利用一次相比，dpe固定化酶的使用效率已有大幅提高。
[0079]
尽管以上结合对本技术的实施方案进行了描述，但本技术并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本技术权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本技术保护。