一种伪狂犬病病毒四基因缺失株及应用

1.本发明属于动物病毒学及动物基因工程技术领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒四基因缺失株及应用，所述毒株缺失了伪狂犬病病毒gi/ge/tk/gg四个基因。本发明的伪狂犬病病毒基因缺失株是一株弱毒株，对伪狂犬病病毒有较好的免疫保护效果，适于作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。可在制备伪狂犬病病毒四基因缺失疫苗中应用。


背景技术：

2.伪狂犬病(pseudorabies,pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,prv)导致的多种家畜和野生动物发病的一种急性传染病，对猪的危害最大，以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征。prv能够感染各个日龄的猪群，导致不同的临床症状。猪伪狂犬病广泛分布于世界各地，给养猪业带来了重大经济损失。疫苗免疫接种是防控伪狂犬病最有效的方式，经过几十年的免疫防控，猪伪狂犬病的防控已经取得较好的效果。2011年末，我国出现了猪伪狂犬病新疫情，很多免疫了伪狂犬病病毒bartha-k61株疫苗的猪场仍然出现伪狂犬病暴发，对毒株进行序列分析表明为经典毒株变异产生的变异毒株。变异毒株与经典疫苗毒株属于不同的基因亚群，与国内早期分离毒株亲缘关系较远，是经典疫苗毒株对变异毒株保护不足的原因之一。因此，为了有效防控当前伪狂犬病的流行，需要针对目前临床流行的伪狂犬病病毒变异株开发新的疫苗。
3.本技术人所在的农业微生物学国家重点实验室与生猪健康养殖协同创新中心的课题组一直从事国内 prv流行病学调查与机制研究工作，本发明从实验室近年来分离的prv毒株中筛选出prv/jxfc/2015株，研究表明其与伪狂犬病病毒变异株的亲缘关系较近，对小鼠和猪的致病力明显高于经典毒株，是能开发有效防控当前伪狂犬病流行的基因缺失疫苗的理想候选毒株。


技术实现要素：

4.本发明第一个目的在于构建一株伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株，作为一种基因缺失弱毒疫苗来克服现有猪伪狂犬病疫苗针对当前伪狂犬病病毒变异株保护力不足的缺点。
5.本发明第二个目的在于提供一种构建该伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株的方法。
6.本发明第三个目的是提供该伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株的应用效果。
7.本发明通过下述技术方案实现：
8.本发明从送检的疑似猪伪狂犬病病料中通过微生物学分离方法得到一株伪狂犬病病毒prvjxfc/2015，于2021年5月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc),保藏编号为cctcc no：v202143。对该伪狂犬病病毒的gb、gc和ge序列测定发现其与当前流行的伪狂犬病病毒变异株亲缘关系较近。动物回归实验显示，该毒株毒力较强，
免疫原性良好，适合作为疫苗研究的候选毒株。
9.本发明构建的伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株，是将该毒株基因组中的gi/ge、tk 和gg(俗称糖蛋白)的部分基因被敲除后得到的。具体敲除的基因片段如下所述。
10.本发明缺失株中gi/ge基因缺失部分核苷酸序列如下所述(同序列表seq id no:1所示序列)： gagcgttgtccttgggggccagcaggacgtcggcggccgggttcgagacgctcgtcgggacgggggcgctggggtcaaacgtgtccatgtc gacggaggcggcgccgggcatgtcggaatgcgggcggaccggttctcccggtatttaagcggggcgggacatcaacaggcggttactaggg gttcctgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattggcagggcctgccgccccggtatctgcgcggcgcgcagcaga aagggccgcatggtctcaaccccggtgtgtgcgagactcgcgggggtgcccaggtttaaaacggcgcggacggagataaaacgccacccac aaaattatgcaaacaccacctttttattgttcttctgcgatggtggcgagcttctggcgcagctcggccaacgtcatcttgggctggggga cgggcgccccggcgacggggttggggggcgggcgccgcgggggcgccgcatggaccgccgatccgcgcccgggtcgcggccggtagatgcg attccgcgcgcagcgccgggccacgcaggcgatcccgcccaggaagatcaggaggacgacgatcgtgggccccagcaccatggctatcttc ccggggctccgggcgcccgccgtggcgttggcggcggcgagcaggacgcgcgacacgacgctggcgttcagcaccatcgtgccgttcgcgt ccagggtcccgggcgccggggtcagcgtcggcgtcgtcgtctccgcgtcaccctcctcctcctcgtccgatcggggctcgggggtggcgcc ggtcccccgggggggcgcgggggtcgtcggcggctcgggctcgggcgggggctgggtggtgaacacggcgtcctcggcggggtccacgacg cgcaggctgtcgtgccacgatccgacgacgggccggcactcgtccgcgggcggcgacgtggggacggggcgccccctcggcggcaccaggg ccgtcagcacaaagaggtccgtggtcccgttcacgcggacccgcagcacgtacgaccccgcgtcccccgaggccgggcgcgagacgaacag cagccggcgcgcctccaccgcggcggacgcgcgccgggcgagcggctcgcgcttgcgcaggcagccgcggaaggcttcgtggtgcacgcgg gggcagaggtcgtactcggcggcgtactcgcgcgtgtagcaggcgcgcttggggtcgaggcgcagcagctccacgcgcccgctgtagtgct cggcgaggacccctccaga；
11.本发明缺失株中tk基因缺失部分核苷酸序列如下所述(同序列表seq id no:2所示序列)： cgaagcttggagacgaaccacgcggagccgtcgccgtccaggacgaacagggtgggcccgcgcgcgggcgccgcggtgggcgcgggacccc cctgcggcgagggcggcccaccctgcggcgcgccgcgggcgagggcggcggcccccgcgagggccaggaggcccgcgagggtcaggaggcg cagcgggaggcgcacggacgacgcgggcatggtgacgggcacggcaaactttattgggatgacatacacatggctttatacgcgccccgag ccccctcccacgccgtcgtcgttgcctccgtcgcggtctccatccggccgcggcgcgggtgggaggggcgagggtcacacccccatctccg acgtgaaggcgcaataacttcgtataaggtatactatacgaagttatgcgccgtcgaggtagatccggaggatgcgcatcccggcgcgctt ccgggcggggatccgctgccacaaccgcttctacgaacgcctgcgacgcgacccgtccgcgtacggcgagagtctcttcgggcttccccga gagacgcttaagaaggcgtccttgaccctggcctttgaagtcaacctcggggtgcgccgccccgactgcgtgtgcgtggtgcggctggggg cgggcccgcacctgtgcttcctcatcgagctcaagacgtgccgcttcccccggaacctcaccccggccca；
12.本发明缺失株中gg基因缺失部分核苷酸序列如下所述(同序列表seq id no:3所示序列)： ggcaacgtggatcctcgccctcgggctcctcgtggtccgcaccgtcgtggccagagaggcccctcgggagctctgctacggccaccccgtc cacgacgaccggcggcccgtcgggcccgcgaccgacgcccagcccgtgaacccgctcgcccccgccaacgccaccgggacggactactctc gcggctgcgagatgcgcctcctggacccgcctctcgatgtctcgtcccgctccccggaccccgtcaacgtgaccgtcgcctggttctttga cggcggccactgcaaggtg
cccctcgtccaccgcgagtactacggctgccccggggacgccatgccctccgtcgagacgtgcaccggcggg tactcgtacacccgcacgcgcatcgacaccctgatggagtacgccctcgtgaacgccagcctcgtgctgcagcccgggctgtacgacgccg gcctgtacatcgtcgtgctcgtctttggcgacgacgcctacctcggcaccgtctccctgtcggtggaggccaacctggactacccctgcgg catgaagcacgggctcacgatcacccgccccggggccaccctcccgcccatcgcccccacggccggcgaccaccagcgctggcgcgggtgc ttcccctcgaccgacgagggcgcctgggagaacgtgaccgccgccgagaagggcctgtccgacgactacgccgactactacgacgtgcaca tcttccgcctggagtctgacgacgaggtcgtccacggcgatgcccccgaggcccccgagggcgaggaggtgaccgaggaggaggccgagct gacctccagcgacctcgacaacatcgagatcgaggtcgtgggctcgcccgccgctcccgtcgagggcgccggcgacggcgaggaggggcac ggggacgaggaggacgaggagctgacctccagcgacctcgacaacatcgagatcgaggtcgtgggctcgcccgcggccgcccgcttcttcg ccgcctccaccaccccccgcgcccccacccgcgcggccgagatcacgaccatgaccacggtcaccaccgtgcggacgaccgaggaccccag cggcatcaccgactgccgccggagcgacttcgtctcgccctctgacatcttcgtgacccccaccggcagccccgccctgctcctgggcttc ctgggcagcgcgctcgcctcgcgccccctgcacctgacggccggggagacggcccagcacgtgcgcgaggcccagcagaagagccgccacg tccgctccctcggcggc；
13.申请人将构建得到的伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株命名为：伪狂犬病病毒 prv-rjxfcδge/giδtkδgg，于2021年5月19日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc) 保藏,保藏编号为cctcc no：v202142。
14.伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株的微生物学形态和生理学特征：
15.本发明构建的伪狂犬病病毒rjxfcδgi/geδtkδgg的稳定毒价为10
7.5
tcid
50
，其在增殖早期 rjxfcδgi/geδtkδgg的增殖速度慢于prv jxfc/2015分离株，后期缺失毒株的滴度仍能达到与prvjxfc/2015相似的水平，其稳定毒价为10
7.5
tcid
50
。测定rjxfcδgi/geδtkδgg在pk-15细胞上的空斑形成能力，发现rjxfcδgi/geδtkδgg的空斑面积(0.031-0.055mm2)显著小于亲本毒株prv/jxfc/2015的空斑面积(0.080-0.098mm2)。小鼠试验表明prv rjxfcδgi/geδtkδgg对小鼠没有表现出明显的致病力。
附图说明
16.图1：本发明所用的pcdna3.1载体及以其为骨架构建的pcdna3.1-iee载体和pcdna3.1-ie转移质粒的图谱。附图标记说明：a:pcdna3.1；b:pcdna3.1-iee；c:pcdna3.1-ie。
17.图2：本发明的重组毒株jxfcδgi/ge缺失pcr鉴定图。附图标记说明：m：dl5000 dna marker；1： rjxfcδgi/ge-egfp；2：rjxfcδgi/ge；3：wt；4：negative control。
18.图3：本发明所用的pmd18-t载体及以其为骨架构建的pmd18-tk和pmd18-tkm转移质粒图谱。附图标记说明：a:pmd18-；b:pmd18-tk；c:pmd18-tkm。
19.图4：本发明重组毒株jxfcδgi/geδtk缺失pcr鉴定图。附图标记说明：m：dl5000 dna marker；1： rjxfcδgi/geδtk；2：wt；3：negative control。
20.图5：本发明构建的pcdna3.1-g载体和pcdna3.1-ge转移质粒的图谱。附图标记说明：a:pcdna3.1-g； b:pcdna3.1-ge。
21.图6：rjxfcδgi/geδtkδgg缺失pcr鉴定图。附图标记说明：m：dl5000 dna marker；1： rjxfcδgi/geδtkδgg；2：wt；3：negative control。
22.图7：rjxfcδgi/geδtkδgg缺失位置遗传稳定性鉴定图。
23.图8：rjxfcδgi/geδtkδgg株与jxfc/2015株空斑形态与空斑大小图。附图标记说明：a:prv jxfc/2015 的空斑形态；b:rjxfcδgi/geδtkδgg的空斑形态；c:prv jxfc/2015与rjxfcδgi/geδtkδgg空斑面积比较。
24.图9：rjxfcδgi/geδtkδgg株与jxfc/2015的增殖曲线图。
25.图10：rjxfcδgi/geδtkδgg对小鼠的安全性试验结果图。
具体实施方式
26.对序列表的说明：
27.seq ud no:1：本发明伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株gi/ge基因缺失部分核苷酸序列。
28.seq ud no:2{}伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株tk基因缺失部分核苷酸序列。
29.seq ud no:3：伪狂犬病病毒流行株gi/ge/tk/gg四基因缺失株gg基因缺失部分核苷酸序列。
30.下面结合实例对本发明进行详细说明，下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件中所述的方法进行。
31.试验材料和方法
32.1.毒株，细胞，质粒的分离与制备
33.prv/jxfc/2015变异毒株(简称prv分离株)由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室2015年分离于中国江西省某规模化猪场，其稳定病毒毒价为10
7.5
tcid
50
/0.1ml，对小鼠的ld
50
为102tcid
50
。 bartha-k61毒株，申请人命名为伪狂犬病病毒prv/jxfc/2015，pseudorabies virus prv/jxfc/2015，于 2021年5月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc),保藏编号为cctcc no： v202143。。
34.猪肾细胞pk-15细胞系购买自atcc(ccl-33)，质粒pcdna3.1(+)由本实验室保存。
35.2.酶、试剂和耗材
36.primestar max dna聚合酶、各种限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司(takara)；2
×
mixdna聚合酶、dna marker、dh5α感受态细胞、multis one step cloning kit无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技公司。
37.dmem培养基粉末、opti-mem培养基、胰酶粉末均购自gibco公司。新生胎牛(fbs)血清、无酚红dmem 培养基购自hyclone公司。低熔点琼脂糖购自amresco公司。培养细胞用的青链霉素购自bioshap公司。
38.普通质粒小提试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司；通用式柱式基因组提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(普通离心柱型)购自omega公司； lipofectamine 2000脂质体转染试剂购自invitrogen公司；6孔细胞培养板、t25、t75和t175细胞培养瓶购自corning公司；超滤管购自millipore公司
39.3培养基及相关试剂的制备
40.dmem培养液：1l装dmem粉剂一袋溶于900.0ml三蒸水中，再加入3.7g nahco3，用浓
盐酸调ph 值至6.8左右，用双蒸水定容至1000.0ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装后置4℃保存备用。
41.细胞生长液：在dmem培养液中加入10％已灭活的胎牛血清，4℃保存备用。
42.病毒维持液：在dmem培养液中加入2％的已灭活的新生牛血清，4℃保存备用。
43.0.25％胰酶消化液：2.5g胰酶，8.0g nacl，0.2g kcl，1.56g na2hpo4，0.2g kh2po4，依次加入 800.0ml的三蒸水中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，4℃搅拌过夜，后0.22μm滤器过滤除菌，分装后置-20℃保存备用。
44.pbs缓冲液：8.0g nacl，0.2g kcl，1.56g na2hpo4，0.2g kh2po4，依次加入800ml的三蒸水中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，121℃蒸汽灭菌30min，4℃保存备用。
45.lb液体培养基：5.0g胰蛋白胨，2.5g酵母浸出物，5.0g nacl，溶于约400ml去离子水中，完全溶解后调ph值至7.0，定容至500ml，121℃蒸气灭菌30min，室温保存。
46.lb固体培养基：5.0g胰蛋白胨，2.5g酵母浸出物，5.0g nacl，7.5g琼脂粉，去离子水500ml，121℃高压蒸气灭菌30min，室温保存。
47.tae(50
×
)：242.0g tris base，57.1ml冰乙酸，100.0ml 0.5mol/l edta(ph8.0)加蒸馏水定容至1l。
48.蛋白质抽提液：苯酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1的比例混合。
[0049]2×
dmem(无酚红)：13.4g无酚红的dmem粉剂和3.7g nahco3加入约400ml三蒸水中，浓盐酸调 ph值至6.8-7.0，定容至500ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。
[0050]
低熔点琼脂糖(2％)：2g低熔点琼脂糖粉剂，100ml三蒸水，121℃灭菌30min后室温保存(用前微波炉中加热融化，后置于37℃水浴锅中待用)。
[0051]
实施例1：gi/ge基因缺失的伪狂犬病毒株的构建
[0052]
(1)引物设计和pcr扩增
[0053]
构建带荧光标记的缺失ge用质粒pcdna3.1-iee：设计扩增ge基因上游同源臂的引物ge-up-f1、 ge-up-r1；设计扩增ge下游同源臂的引物ge-down-f1，ge-down-r1；设计扩增egfp基因的引物egfp-f， egfp-r。上述引物分别带有同源序列，用于通过无缝克隆的方法构建带荧光标记的缺失ge用质粒 pcdna3.1-iee。
[0054]
构建带缺失荧光标记质粒pcdna3.1-ie：设计扩增ge基因上游同源臂的引物ge-up-f1，ge-up-r2；设计扩增ge下游同源臂的引物ge-down-f2，ge-down-r1。上述引物分别带有同源序列，用于通过无缝克隆的方法构建缺失荧光标记质粒pcdna3.1-ie。
[0055]
表1扩增ge相应片段的引物序列
[0056][0057]
说明：在表1中：a：所有下划线为同源臂部分，用于无缝克隆
[0058]
(2)ge转移载体的构建
[0059]
以伪狂犬病病毒prv/jxfc/2015的基因组为模板，用表1中所列的3对引物ge-up-f1/r1、 ge-down-f1/r1和egfp-f/r使用primestar max dna聚合酶进行扩增。pcr体系为：2
×
primestar maxmix10μl，引物各加1μl，模板dna2μl，最后加水补足至20μl。反应程序为98℃,5min；98℃,30s， 60℃,30s，72℃,2min，35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收pcr产物再使用诺维赞公司的多片段无缝克隆试剂盒将上下游同源臂和egfp表达盒连入经限制酶 ecor i线性化后回收的质粒片段，连接完成后，将连接产物转化进dh5α感受态细胞中，经氨苄抗性平板筛选阳性单菌落，挑取单菌落用3个片段任意一对引物进行菌液pcr及酶切鉴定，鉴定正确后，将重组质粒送擎科生物公司测序，测序比对正确后，提取重组质粒，命名为pcdna3.1-iee，用于后续转染。
[0060]
用表1中所列的2对引物即ge-up-f1/r2和ge-down-f2/r1进行扩增。使用max dna聚合酶分别扩增prv的ge基因上下游同源臂，按照上面步骤获得重组质粒，将鉴定正确后的质粒命名为pcdna3.1-ie，用于后续转染步骤(见图1)。
[0061]
(3)prv/jxfc/2015基因组的提取
[0062]
将prv接种于长满单层的pk-15细胞中，待到病变细胞比例大于90％时收取病毒，反复冻融3次。将病毒8000r/min离心10min，分装至超滤管中，用长针头加入5ml 30％的蔗糖溶液，25000r/min离心 2h，弃去上清。用100μl的ten重悬沉淀，过夜后加入200μl ten洗涤后转管。加入200μl 10％sds 和15μl rna酶60℃水浴充分裂解细胞30min，再加入100μl蛋白酶k 60℃水浴30min，接着用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比25：24：1)反复抽提3-4次，用2.2倍体积预冷的无水乙醇提取(见白色絮状物)，断枪头抽出絮状物，用新的ep管经75％酒精洗涤后，12000r/min离心10min，晾干后用200μl te溶解，-20℃保存。
[0063]
(4)rjxfcδgi/ge基因缺失病毒的筛选和空斑纯化
[0064]
采用脂质体lip2000转染试剂进行转染实验。具体操作参照lip2000转染试剂说明书：
[0065]
取3个1.5ml ep管，分别标记1-3号，加入250μl mem培养基和10μl lip2000，用枪头吹打混匀后静置5min；再取3个同样的ep管，对应标记1-3号，各加入250μl mem培养基。然后在1号管中分别加入2μg病毒dna和2μg pcdna3.1-iee质粒。2号管中加入2μg病毒dna做为单独转染病毒 dna对照。3号管中加入2μg pcdna3.1-iee质粒做为单独转染质粒对照，均用枪头吹打混匀；将以上标记对应的各250μl mem进行混合，该混合物室温静置20min。期间将长满单层pk-15细胞的六孔板，弃掉培养基，然后用pbs洗两遍；在每个孔中加入预处理好的混合液500ml，再向每孔补加1.5ml mem并标记好，将细胞板置于37℃培养箱中培养。5小时后，弃掉含转染试剂的培养基，每孔换上含2％胎牛血清的新鲜培养基2ml。然后将细胞板置于37℃培养箱中培养，连续观察六孔板中共转染孔的细胞以及对照转染孔的细胞变化，待共转染孔同时出现病变和绿色荧光时收获病毒液，这即说明转染的dna和质粒均已表达。同时单独转染质粒的细胞只出现绿色荧光，单独转染亲本毒dna的细胞只出现细胞病变。
[0066]
将病毒液置于-70℃反复冻融三次，收取上清接种于长满单层的pk细胞，待细胞出现病变时挑取有绿色荧光的病变孔的病毒液按10倍比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk细胞，37℃感作2h，然后弃去所有上清，加入体积比为1∶1混合的2
×
mem(含2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于 37℃培养箱中，连续观察数日。细胞中出现大小适中的绿色荧光蚀斑时，挑取相应的荧光蚀斑并溶于1mlmem培养基中，-70℃反复冻融三次后接种于pk-15细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都出现绿色荧光时所得的克隆即纯的rjxfcδgi/ge-egfp缺失突变毒。
[0067]
用上述同样的方法将rjxfcδgi/ge-egfp与质粒pcdna3.1-ie共转染pk-15细胞，待出现病变时收获病毒液，将病毒液按10倍体积比比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk-15细胞，37℃感作2h。然后弃去所有上清，加入体积比为1∶1混合的2
×
mem(含2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于37℃培养箱中，连续观察数日。细胞中出现大小适中的不发绿色荧光蚀斑时，挑取相应的蚀斑并溶于1 ml mem培养基中，置于-70℃反复冻融三次后接种于pk-15细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都不发绿色荧光时。用表2中引物ge-val-f/r进行鉴定，扩增得到大小为971bp的条带，证明所得的克隆即纯的rprv/jxfcδgi/ge缺失突变毒(图2)。
[0068]
实施例2：构建gi/ge/tk基因缺失的伪狂犬病毒株
[0069]
(1)引物设计和pcr扩增
[0070]
建带荧光标记的缺失tk用质粒pmd18-tkm和pmd18-tk：设计扩增tk基因上游同源臂的引物tk-up-f， tk-up-r；设计扩增tk下游同源臂的引物tk-down-f，tk-down-r；设计扩增mcherry基因的引物mcherry-f， mcherry-r。上述引物分别带有同源序列，用于通过无缝克隆的方法构建带荧光标记的缺失tk用质粒 pmd18-tkm和缺失tk用质粒pmd18-tk。
[0071]
表2扩增tk相应片段的引物序列
[0072][0073]
说明，表2中：a：所有下划线为同源臂部分，用于无缝克隆
[0074]
(2)tk转移载体的构建
[0075]
以rjxfcδgi/ge病毒的基因组为模板，用表2中所列的3对引物tk-up-f1/r1、tk-down-f1/r1、mcherry-f/r进行扩增。pcr体系：2
×
primestar max mix10μl，引物各加1μl，模板dna2μl，最后加双蒸水补足至20μl。反应程序：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，延伸5min，16℃保存。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收pcr产物再使用诺维赞公司生产的多片段无缝克隆试剂盒将上下游同源臂和egfp表达盒连入pmd18-t质粒中，连接完成后，将连接产物转化进dh5α感受态细胞中，经氨苄抗性平板筛选阳性单菌落，挑取单菌落用tk鉴定引物进行菌液pcr及酶切鉴定，鉴定正确后，将重组质粒送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序比对正确后，提取重组质粒，将所得的重组质粒命名为pmd18-tkm，用于后续转染。
[0076]
按同样的方法回收pcr产物再使用诺维赞公司的多片段无缝克隆试剂盒将上下游同源臂连接后连入 pmd18-t质粒中，pcr和酶切鉴定正确命名为pmd18-tk，将pmd18-tk用于后续转染(图3)。
[0077]
(3)rjxfcδgi/ge基因组的提取
[0078]
将rjxfcδgi/ge接种于长满单层的pk-15细胞中，待到病变细胞比例大于90％时收取病毒，反复冻融3次。将病毒在8000r/min离心10min，分装至超滤管中，用长针头加入5ml 30％的蔗糖溶液，以25000 r/min离心2h，弃去上清后用100μl的ten重悬，过夜后加入200μl ten洗涤后转管。加入200μl 10％sds和15μl rna酶60℃水浴充分裂解细胞30min，再加入100μl蛋白酶k 60℃水浴30min，接着用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比25：24：1)反复抽提3-4次，用2.2倍体积预冷的无水乙醇提取(见白色絮状物)，断枪头抽出絮状物，用新的ep管75％酒精洗涤后，12000r/min离心10min，晾干后用200μl te溶解，-20℃保存。
[0079]
(4)rjxfcδgi/geδtk基因缺失病毒的筛选和空斑纯化
[0080]
采用脂质体lip2000转染试剂进行转染实验。具体操作参照lip2000转染试剂说明书，待共转染孔同时出现病变和红色荧光时收获病毒液，这即说明转染的dna和质粒均已表
达。将病毒液在-70℃反复冻融三次接种于长满单层的pk-15细胞待细胞出现病变时，挑取有绿色荧光的病变孔的病毒液按10倍比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk-15细胞，37℃感作2h。然后弃去所有上清，加入体积比为1∶1混合的 2
×
mem(含2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于37℃培养箱中，连续观察数日。当细胞中出现大小适中的红色荧光蚀斑时，挑取相应的荧光蚀斑并溶于1ml mem培养基中，在-70℃反复冻融三次后接种于pk细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都出现红色荧光时所得的克隆即为纯的rjxfcδgi/geδtk-mcherry缺失突变病毒。
[0081]
将rjxfcδgi/geδtk-mcherry与质粒pmd18-tk共转染pk-15细胞，待出现病变时收获病毒液，将病毒液按10倍比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk-15细胞，37℃感作2h。然后弃去所有上清，加入体积比为1∶1混合的2
×
mem(含2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于37℃培养箱中，连续观察数日。细胞中出现大小适中的不发红色荧光蚀斑时，挑取相应的蚀斑并溶于1ml mem培养基中，在-70℃反复冻融三次后接种于pk-15细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都出现不发生红色荧光，pcr鉴定正确(图4)时所得的克隆即为纯的rjxfcδgi/geδtk缺失突变毒。
[0082]
实施例3：gi/ge/tk/gg基因缺失的伪狂犬病毒株的构建
[0083]
(1)引物设计和pcr扩增
[0084]
设计扩增gg基因上游同源臂的引物gg-up-f，gg-up-r，设计扩增gg下游同源臂的引物gg-down-f， gg-down-r，设计扩增egfp基因的引物gg-egfp-f，gg-egfp-r。上述引物分别引入酶切位点hind iii、 bamh i、ecor i、xba i，用于通过酶切连接的方法构建带荧光标记的缺失gg用质粒pcdna3.1-ge和不带荧光标记的缺失gg用质粒pcdna3.1-g。
[0085]
表3扩增gg相应片段的引物序列
[0086][0087]
说明，表3中：a：所有下划线为酶切位点，用于酶切连接。
[0088]
(2)gg转移载体的构建
[0089]
以猪伪狂犬病病毒prv/jxfc/2015病毒dna和egfp表达盒为模板，用表1中所列的引物gg-up-f/r、 gg-down-f/r、gg-egfp-f/r。pcr体系：2
×
primestar max mix10μl，引物各加1μl，模板dna2μl，最后加水补足至20μl。反应程序：98℃，5min；98℃，30s，60℃，30s，72
℃，2min，35个循环； 72℃延伸5min，16℃保存。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。分别扩增出812bp、612bp和1697 bp的特异性片段，设计在上下游同源臂和egfp表达盒两端的酶切位点分别为handⅲ、bamhⅰ、ecor i 和xbalⅰ。将扩增的上下游同源臂回收后连接到pcdna3.1载体，得到重组转移载体pcdna3.1-g。将扩增出的egfp表达盒插入pcdna3.1-g质粒的bamhⅰ和ecor i之间获得重组转移质粒pcdna3.1-ge(图5)。将构建好的质粒转化进dh5α感受态细胞中，经氨苄抗性平板筛选阳性单菌落，挑取单菌落用3个片段任意一对引物进行菌液pcr及酶切鉴定，鉴定正确后，将重组质粒送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序比对正确后，提取重组质粒，用于后续转染。
[0090]
(3)prv/jxfcδgi/geδtk基因组的提取
[0091]
将prv接种于长满单层的pk-15细胞中，待到细胞病变比例在90％以上收取病毒，反复冻融3次。将病毒在8000r/min离心10min，分装至超滤管中，用长针头加入5ml 30％的蔗糖溶液，25000r/min离心2h，弃去上清用100μl的ten重悬，过夜后加入200μl ten洗涤后转管。加入200μl 10％sds 和15μl rna酶60℃水浴充分裂解细胞30min，再加入100μl蛋白酶k 60℃水浴30min，接着用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比为25：24：1)反复抽提3-4次，用2.2倍体积预冷的无水乙醇提取(见白色絮状物)，断枪头抽出絮状物，用新的ep管经75％酒精洗涤后，12000r/min离心10min，晾干后用200μl te溶解，-20℃保存。
[0092]
(4)prv/jxfcδgi/geδtkδgg基因缺失病毒的筛选和空斑纯化
[0093]
采用脂质体lip2000转染试剂进行转染实验。具体操作参照lip2000说明书进行，待共转染孔同时出现病变和绿色荧光时收获病毒液，这即说明转染的dna和质粒均已表达。将病毒液-70℃反复冻融三次接种于长满单层的pk-15细胞待细胞出现病变时，挑取有绿色荧光的病变孔的病毒液按10倍比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk-15细胞，37℃感作2h。然后弃去所有上清，加入体积比为1∶1混合的2
×
mem(含 2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于37℃培养箱中，连续观察数日。细胞中出现大小适中的绿色荧光蚀斑时，挑取相应的荧光蚀斑并溶于1ml mem培养基中，-70℃反复冻融三次后接种于 pk细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都出现绿色荧光时所得的克隆即为纯的 rjxfcδgi/geδtkδgg-egfp缺失突变毒。
[0094]
用上述同样的方法将rjxfcδgi/geδtkδgg-egfp与质粒pcdna3.1-g共转染pk-15细胞，待出现病变时收获病毒液，将病毒液按10倍比稀释10-1-10-6
接种于长满单层的pk-15细胞，37℃感作2h。然后弃去所有上清，加入1∶1混合的2
×
mem(含2％胎牛血清)和2％低熔点琼脂糖混合液，待其凝固后放于37℃培养箱中，连续观察数日。细胞中出现大小适中的不发绿色荧光蚀斑时，挑取相应的蚀斑并溶于1ml mem 培养基中，在-70℃反复冻融三次后接种于pk-15细胞进行传代和蚀斑纯化，直至所有的病变蚀斑都出现不发绿色荧光时。用表2中引物gg-val-f/r进行鉴定，扩增得到大小为1713bp的条带，证明所得的克隆即为纯的rjxfcδgi/geδtkδgg缺失突变毒(图6)。
[0095]
实施例4：jxfcδgi/geδtkδgg缺失株的生物学特性
[0096]
(1)jxfcδgi/geδtkδgg的pcr鉴定
[0097]
将该基因缺失病毒在pk-15细胞上连续传代25次，分别取第5、10、15和25代病毒液提取病毒基因组，并用表1、表2和表3中ge、tk和gg缺失鉴定引物进行pcr鉴定，证明jxfcδgi/geδtkδgg在细胞传代时不会发生回复突变(图7)，图7表明缺失部位稳定存在于伪狂
犬病病毒的基因组中，说明本发明构建的伪狂犬病病毒四基因缺失株具有细胞传代稳定性。
[0098]
(2)jxfcδgi/geδtkδgg的一步生长曲线和空斑面积测定
[0099]
测定jxfcδgi/geδtkδgg基因缺失毒株的tcid
50
，然后按照感染复数为1moi的病毒量接种单层pk-15 细胞的6孔板。放置于细胞培养箱中培养孵育2h，然后用pbs洗涤2次，加入维持液，放置细胞培养箱中继续培养，分别在接毒后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48h收样，每个时间点做2个重复。冻融3次后进行各个时间段tcid
50
测定，每个时间点做三个重复，绘制一步法增殖曲线。结果显示 jxfcδgi/geδtkδgg缺失病毒和亲本毒jxfc/2015株在pk-15细胞上的增殖特性基本相近(图8)，表明 gi/ge的缺失不影响缺失毒株在细胞中的增殖。将jxfc/2015和jxfcδgi/geδtkδgg接种pk-15细胞后，逐日观察细胞病变，发现prv/jxfc/2015的空斑形成速度快于jxfcδgi/geδtkδgg的空斑形成速度，感染细胞48h后采用结晶紫法进行染色，可以看出jxfcδgi/geδtkδgg在pk-15细胞上的空斑面积只有 prv/jxfc/2015在pk-15细胞上的空斑面积的44％，二者蚀斑面积呈差异显著(图9)，说明jxfcδgi/ geδtkδgg在pk-15细胞上的空斑形成能力低于亲本毒。
[0100]
实施例5：jxfcδgi/geδtkδgg缺失株对小鼠的安全性试验
[0101]
以jxfcδgi/geδtkδgg和jxfcδgi/geδtk以106tcid
50
的剂量、疫苗a和疫苗b以106tcid
50
的剂量、 jxfc/2015毒株以104tcid
50
的剂量感染(注射后肢足垫)4周龄balb/c小鼠，同时以无菌dmem作为阴性对照，每组试验5只。注射jxfc/2015毒株104tcid
50
剂量下的小鼠在48h开始出现典型的神经症状，在第6d-9d全部死亡。在14天的观察期内，其余注射组的小鼠精神状态良好，没有出现任何明显症状，对照组也完全正常(图10)。以上结果表明jxfcδgi/geδtkδgg缺失毒株对小鼠没有致病力。