一种酮还原酶突变体及其应用的制作方法

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1.本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种酮还原酶突变体，可以用于制备去甲肾上腺素和肾上腺素的中间体(r)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇。


背景技术：

2.去甲肾上腺素(inn名称：norepinephrine，也称noradrenaline，缩写ne或na)，旧称“正肾上腺素”，化学名(r)-4-(2-氨基-1-羟基乙基)-1,2-苯二酚，是肾上腺素去掉n-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。去甲肾上腺素是一种抗休克的血管活性药，主要用于抢救急性低血压和周围血管扩张所引起的休克等。
3.专利cn111019981a中公开利用脱氢还原酶催化去甲肾上腺素酮获得去甲肾上腺素(scheme1所示)。但没有公布对应的基因信息和转化后产物的手性值，转化底物浓度仅为25g/l。
[0004][0005]
肾上腺素可以用于心脏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，也可治疗荨麻疹、枯草热及鼻粘膜或齿龈出血等。
[0006]
专利cn101906457b中公开用乙醇脱氢酶催化肾上腺素酮合成肾上腺素，但催化底物浓度仅有21g/l，难以工业化应用。
[0007]
本发明为了实现酶法高效催化合成手性肾上腺素和去甲肾上腺素的中间体，选择了以3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮为底物，在酮还原酶作用下生成(r)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇，进而可以制备去甲肾上腺素和肾上腺素。
[0008]
文献tetrahedron:asymmetry,2007,18,1799
–
1803中公开了一种醇脱氢酶ymr226c，可以将3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙酮转化为(r)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇，但是ee值仅为97％，转化底物浓度仅为2.37g/l。
[0009]
因此，我们需要对现有的酮还原酶进行改造，提高催化底物浓度、转化率以及ee值等，进而大幅度降低去甲肾上腺素和肾上腺素的制备成本。


技术实现要素：

[0010]
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的酮还原酶突变体。
[0011]
一方面，本发明利用蛋白质工程技术对来源于lactobacillus kefiri的酮还原酶进行改造，获得3个高催化效率的酮还原酶突变体a、b和c。
[0012]
进一步，所述酮还原酶突变体a、b和c的氨基酸序列分别如seq id no.3、5和7所示。
[0013]
更进一步，所述酮还原酶突变体a是在野生型序列基础上将部分位点进行突变，具体为：第64位点为val，第76位点为ile，第88位点为gly，第95位点为met，第96位点为ile，第99位点为leu，第100位点为gly，第117位点为ala，第143位点为ser，第145位点为ala，第147位点为ile，第153位点为met，第156位点为tyr，第159位点为thr，第160位点为lys，第190位点为ala，第197位点为ala，第200位点为pro，第202位点为phe，第206位点为cys。
[0014]
更进一步，所述酮还原酶突变体b是在酮还原酶突变体a的序列基础上进行取代、缺失获得。
[0015]
更进一步，酮还原酶突变体c是在酮还原酶突变体b的基础上进行多段loop的敲除后获得的。
[0016]
更进一步，所述酮还原酶突变体来源于野生型lactobacillus kefiri，野生型模板ncbi的登录号为4rf2_a。
[0017]
进一步，所述酮还原酶突变体在体外构建到重组表达载体上，优选pet系列载体。
[0018]
进一步，所述酮还原酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌，所述细胞为bl21(de3)、plyss或origami b(de3)。
[0019]
进一步，经过宿主细胞的在iptg诱导下的表达后，可以获得以上三株突变体的蛋白，为了提升酮还原酶突变体的利用率，可直接利用发酵后的全细胞进行后期底物催化。
[0020]
另一方面，本发明提供的酮还原酶突变体可以将3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮转化为(r)-3,4-二羟基-2
’‑
氯苯乙醇，采用的技术方案如下：
[0021][0022]
进一步，所述3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮浓度可达120g/l。
[0023]
进一步，所述酮还原酶突变体为酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的全细胞或细胞破碎液，优选酮还原酶全细胞。
[0024]
进一步，所述反应中需要加入辅酶体系，优选nadph。
[0025]
进一步，所述反应利用酮还原酶突变体的逆向反应，以异丙醇为底物实现了辅酶nadph的再生。
[0026]
更进一步，所述反应中异丙醇的浓度控制在20％～40％之间。
[0027]
进一步，所述反应的反应温度控制在25～45℃，优选37℃。
[0028]
进一步，所述反应的ph控制在5.0～7.5之间，优选6.0。
[0029]
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种新的酮还原酶突变体，转化底物浓度高达120g/l，转化率95.5％以上，手性ee值》99％。
[0030]
使得肾上腺素和去甲肾上腺素的制备成本有了大幅度降低，同时实现了绿色化生产。
具体实施方式
[0031]
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
[0032]
实施例1酮还原酶的构建
[0033]
从ncbi网站获取来源于lactobacillus kefiri的酮还原酶野生型基因序列，利用引物设计软件primer 5，设计出两条上下游引物，分别含有限制性内切酶ndei和xhoi的切割位点，具体引物信息见表1。
[0034]
表1 pcr扩增的引物序列
[0035]
引物名称引物序列(5
’→3’
)ndei-上游引物tacggctagcatgactgatcgtttaaaaggxhoi-下游引物catgctcgagttattgagcagtgtatccacc
[0036]
根据pcr扩增原理，利用primestar hs dna polymerase聚合酶的扩增能力，在上下游引物的参与下，借助pcr仪器合成目的基因。具体的pcr体系和扩增条件见表2和表3，经过约2h的扩增后，进行1％的琼脂糖电泳凝胶分析，结果显示基因大小正确。
[0037]
表2 pcr的反应体系
[0038]
成份用量5 x buffer10uld ntp(2.5mm)2ul上游引物(10pmol/ul)1ul下游引物(10pmol/ul)1ulkred基因50ngprimestar hs dna polymerase1ulddh2oadd to 50ul
[0039]
表3 pcr扩增条件
[0040][0041][0042]
实施例2酮还原酶的重组表达
[0043]
将上述构建好的重组质粒pet21a-lkkred经过化学转化方法，转入dh5α感受态细胞，在含有amp
+
抗性的lb平板上37℃隔夜倒置培养。挑选阳性单克隆进行基因测序，确定序
列正确后，将重组表达载体转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，提出单克隆细胞，获得可以诱导表达的节杆菌转氨酶基因工程菌株。
[0044]
将含有目的基因的bl21(de3)细胞接种到含有amp
++
抗性的lb试管中，于37℃培养过夜，得到一级种子培养液。将种子培养液按照1％的接种比例转接到含有抗性的2yt液体培养基中，置于摇床中，37℃下，200rpm转速培养3～5h，测od达到0.6～0.8时，降温至20℃，加入iptg，浓度控制在0.5mm，进行隔夜诱导表达。发酵液通过离心并收集菌体，用20mm tris-hcl缓冲液(ph7.5)将收集的菌体进行溶解，并利用超声破碎细胞。之后再次12000rpm离心10min，得到的上清液即为转氨酶蛋白，蛋白都处于可溶性表达。
[0045]
实施例3(r)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇的制备
[0046]
向50ml反应瓶中加入0.2g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用4ml异丙醇溶解，加入2mg的nadp，加入16ml水，用0.1m的naoh溶液调ph至7.0，最后投入1g细胞(野生型酮还原酶)，在37℃水浴中搅拌反应24h，加入乙腈终止反应，40℃下旋蒸，浓缩得到目标产物，转化率为65％，ee值为45％。
[0047]
实施例4(r)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇的制备
[0048]
向50ml反应瓶中加入0.4g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用5ml异丙醇溶解，加入2mg的nadp辅酶，加入16ml水，用0.1m的naoh溶液调ph至7.0，最后投入1g突变体a细胞(含有酮还原酶突变体a)，在37℃水浴中搅拌反应，利用0.1m的naoh溶液控制反应过程中ph为6.0。反应24h后，加入乙腈终止反应，40℃下旋蒸，浓缩得到目标产物，转化率为85％，ee值为99.2％。
[0049]
实施例5(r)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇的制备
[0050]
向50ml反应瓶中加入1g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用6ml异丙醇溶解，加入2mg的nadph，加入14ml水，用0.1m的naoh溶液调ph至7.0，最后投入0.8g酮还原酶突变体b酶粉，在37℃水浴中搅拌反应24h。反应结束后，加入乙腈助溶，40℃下旋蒸，浓缩得到目标产物，转化率为95％，ee值为99.3％。
[0051]
实施例6(r)-3,4-二羟基-2
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氯苯乙醇的制备
[0052]
向50ml反应瓶中加入2.4g 3,4-二羟基-2
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氯苯乙酮，用8ml异丙醇溶解，加入2mg的nadph，加入12ml水，用0.1m的naoh溶液调ph至7.0，最后投入0.4g突变体c细胞(含有酮还原酶突变体c)在37℃水浴中搅拌反应24h，加入乙腈终止反应，40℃下旋蒸，浓缩得到目标产物，转化率为95.5％，ee值为99.3％。
[0053]
实施例7去甲肾上腺素的制备
[0054]
取180mg实施例6中得到的(r)-1-(3，4-二羟基苯基)-2-氯-乙醇中溶于50ml二甲基亚砜中，加入80mg乌洛托品，70℃反应18h，然后降温至25℃，加入5ml乙醇，搅拌30min，析出固体，直接加入19ml浓盐酸，室温搅拌10h，滴加氨水溶液调ph至8，抽滤，滤饼水洗，乙醇洗，得到45mg去甲肾上腺素。
[0055]
实施例8肾上腺素的制备
[0056]
取20mg实施例7中的去甲肾上腺素以及60mg s-腺苷-蛋氨酸，用pbs缓冲液调节体系ph为5，再加入10g/l的pnmt粗酶液，50℃下反应12h，得到肾上腺素，hplc检测其转化率为96％。