一种多病毒核酸检测目视微流控芯片及其检测方法与流程

1.本发明属于微流控芯片领域，具体涉及一种多病毒核酸检测目视微流控芯片及其检测方法。


背景技术：

2.目前核酸检测已被广泛应于临床医学领域，其步骤主要分为：核酸提取，核酸扩增，核酸检测。传统的核酸检测需要花费大量的时间精力，还依赖严格干净的环境和专业的设备，这限制了核酸即时现场检测(point
‑
of
‑
care testing,poct)的发展。微流控技术的出现为该问题地解决提供了方案：微流控技术的主要形式为微流控芯片，是将整个分析实验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在一块几平方厘米的芯片上进行分析的技术。微流控芯片具有液体流动可控、消耗少、分析快等特点，作为一种新兴的科学技术，发展前景巨大，为医学研究与临床转化作出巨大的贡献。
3.目前，核酸检测微流控芯片主要有基于pcr和恒温扩增方法的检测技术，基本已经满足集样品处理、扩增、检测于一体的要求，但是多数使用荧光检测，需要专业检测设备进行结果判读，而且由于有背景荧光，阴性样本判读时间长；而且多数芯片只针对单一病原体进行检测，不满足通量上的需求；另外，大多微流控技术需要用额外控制设备来维持通道内稳定的压力差，这些均给poct高效准确、简单快速的要求造成挑战。


技术实现要素：

4.本发明提供一种多病毒核酸检测目视微流控芯片及其检测方法，用以解决上述针对poct要求不能高效准确、简单快速检测核酸的问题。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.一种多病毒核酸检测目视微流控芯片，所述目视微流控芯片包括提取层10、分隔层11和扩增检测层12，所述提取层10、分隔层11和扩增检测层12从上到下依次排列；
7.所述提取层10将样本溶液分到多个反应腔中；
8.所述分隔层11将提取层与扩增检测层分开；
9.所述扩增检测层12针对不同的病毒核酸进行扩增检测。
10.进一步的，所述提取层10包括提取层反应腔1、提取层稳流段2和提取层储液腔3，所述提取层储液腔3设置在提取层的中心，所述提取层稳流段2均布且连通提取层储液腔3，所述提取层稳流段2连通提取层反应腔1，所述提取层储液腔3中心开有进液口。
11.进一步的，所述扩增检测层12包括扩增检测层反应腔4、扩增检测层堵塞段通道5和扩增检测层负压口6，所述扩增检测层负压口6设置在扩增检测层的中心，所述扩增检测层堵塞段通道5均布且连通扩增检测层负压口6，所述扩增检测层堵塞段通道5连通扩增检测层反应腔4。
12.进一步的，所述扩增检测层堵塞段通道的进口处5
‑
1填入直径为30μm的微球；
13.所述扩增检测层堵塞段通道5的进口直径大于流动通道的直径。
14.进一步的，提取层反应腔1与扩增检测层反应腔4相连通。
15.一种多病毒核酸检测目视微流控芯片的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
16.步骤1：在扩增检测层反应腔4内预埋入干粉引物；
17.步骤2：将配置好的反应液通过进液口注入提取层储液腔3内；
18.步骤3：将注入反应液的目视微流控芯片离心30s，使反应液均分至各个提取层反应腔1；
19.步骤4：根据步骤1的试剂使用要求进行加热温度循环，完成扩增；
20.步骤5：完成扩增后，室温冷却60s；
21.步骤6：用注射器吸取酒精和醋酸铵形成混合溶液酒精：醋酸铵的配比为2：1；
22.步骤7：将步骤6的混合溶液通过进液口注入提取层储液腔3内；
23.步骤8：再次离心30s，使混合溶液通过提取层稳流段2进入到与提取层反应腔1连通的扩增检测层反应腔4内；
24.步骤9：用注射器抽取油性有色指示液，通过进液口注入提取层储液腔3内；
25.步骤10：在负压口6使用负压产生器抽气，目测扩增检测层堵塞段通道5的检测结果。
26.进一步的，所述步骤1中配置好的反应液具体为，将待测样本与扩增反应溶液共120μl装入检测试管内，旋涡混合30s，充分混合。
27.进一步的，所述步骤8混合溶液进入扩增检测层反应腔4内具体为，混合溶液通过进液口注入提取层储液腔3内后，通过离心驱动反应体系从提取层储液腔3流向扩增检测层反应腔4内。
28.进一步的，所述步骤8扩增检测层反应腔4内的液体混合后，由于乙醇溶液与核酸可形成物理沉淀，且该沉淀直径大于微球堆积的间隙大小，则油性有色指示液在负压作用下可在扩增检测层堵塞段通道5目测呈阳性的检测结果。
29.本发明的有益效果是：
30.本发明配套使用的注射器、负压产生器均为常见普通医用注射器，无需另行购买。
31.本发明全程在负压环境下实施，可以保证反应液与外界全程无接触，极大成度上抑制气溶胶污染，也不会泄露对环境造成威胁，有较高的生物安全性。
32.本发明将分样、扩增、检测集成在一张芯片上，实现了设备小型化。
33.本发明针对病毒核酸检测，可一次实现多种病原体的检测，无需复杂的核酸检验设备，可在短时间内通过目视判读结果。
34.本发明操作简单、结果读取通俗易懂，无需培训专业人员，可降低对人力资源的占用。
附图说明
35.图1本发明的结构示意图。
36.图2本发明的提取层结构示意图。
37.图3是图2提取层稳流段的局部放大示意图。
38.图4本发明的扩增检测层结构示意图。
39.图5是图4扩增检测层堵塞段通道的局部放大示意图。
40.图6本发明的芯片使用方式示意图，其中(a)为提取层俯视图，(b)为扩增检测层仰视图。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.一种多病毒核酸检测目视微流控芯片，所述目视微流控芯片包括提取层10、分隔层11和扩增检测层12，所述提取层10、分隔层11和扩增检测层12从上到下依次排列；
43.所述提取层10是样本溶液分到多个反应腔中；
44.所述分隔层11将提取层与扩增检测层分开；
45.所述扩增检测层12针对不同的检测试剂进行扩增检测。
46.进一步的，所述提取层10包括提取层反应腔1、提取层稳流段2和提取层储液腔3，所述提取层储液腔3设置在提取层的中心，所述提取层稳流段2均布且连通提取层储液腔3，所述提取层稳流段2连通提取层反应腔1，所述提取层储液腔3中心开有进液口。
47.进一步的，所述扩增检测层12包括扩增检测层反应腔4、扩增检测层堵塞段通道5和扩增检测层负压口6，所述扩增检测层负压口6设置在扩增检测层的中心，所述扩增检测层堵塞段通道5均布且连通扩增检测层负压口6，所述扩增检测层堵塞段通道5连通扩增检测层反应腔4。
48.进一步的，所述扩增检测层堵塞段通道的进口处5
‑
1填入直径为30μm的微球；
49.所述扩增检测层堵塞段通道5的进口直径大于流动通道的直径。
50.进一步的，提取层反应腔1与扩增检测层反应腔4相连通。
51.一种多病毒核酸检测目视微流控芯片的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
52.步骤1：在扩增检测层反应腔4内预埋入干粉引物；
53.步骤2：将配置好的反应液(所述反应液为待测样本与扩增反应液，其比例是根据生物试剂决定)通过进液口注入提取层储液腔3内；
54.步骤3：将注入反应液的目视微流控芯片离心30s，使反应液均分至各个提取层反应腔1；
55.步骤4：根据步骤1的试剂使用要求进行加热温度循环，完成扩增；
56.步骤5：完成扩增后，室温冷却60s；
57.步骤6：用注射器吸取酒精(高浓度)和醋酸铵形成混合溶液，吸取酒精：醋酸铵的配比为2：1；
58.步骤7：将步骤6的混合溶液通过进液口注入提取层储液腔3内；
59.步骤8：再次离心30s，使混合溶液通过提取层稳流段2进入到与提取层反应腔1连通的扩增检测层反应腔4内；
60.步骤9：用注射器抽取油性有色指示液，通过进液口注入提取层储液腔3内；
61.步骤10：在负压口6使用负压产生器抽气，目测扩增检测层堵塞段通道5的检测结果。
62.进一步的，所述步骤1中配置好的反应液具体为，将待测样本与扩增反应溶液共120μl装入检测试管内，旋涡混合30s，充分混合。
63.进一步的，所述步骤8混合溶液进入扩增检测层反应腔4内具体为，混合溶液通过进液口注入提取层储液腔3内后，通过离心驱动反应体系从提取层储液腔3流向扩增检测层反应腔4内。
64.进一步的，所述步骤8扩增检测层反应腔4内的液体混合后，由于乙醇溶液与核酸可形成物理沉淀，且该沉淀直径大于微球堆积的间隙大小，则油性有色指示液在负压作用下可在扩增检测层堵塞段通道5目测呈阳性的检测结果。
65.当反应体系流经堵塞通道段时，含有阳性样本的反应液将产生许多沉淀，并堆积在细长通道内。这将使通道内出现明显地流速减慢的场景，而阴性样本则会有红色流体较快速地通过负压口流入芯片外接的收集腔，一般阴性样本可在1分钟流过通道，阳性样本需花费10分钟及以上时间。即当原样本含有待测核酸时，该条通道呈现堵塞状态，反之同样成立，据此可通过目视判断检测结果。
66.如图1所示，该芯片整体为9厘米直径大小，分三层，上层为提取层，通道厚度0.4mm；下层为扩增和检测层，通道厚度为0.4mm；中层起分隔作用。如图2，进液口位于上层储液腔中心，储液腔半径为15mm，可容纳280微升液体，多条细长通道成放射状均匀排列；细长通道中部设有弯曲段，以达到稳定压强的作用。上下层通过细长通道末端的圆形孔联通。下层(如图4)圆形孔即为反应腔，半径为9mm可容纳100微升的反应液，每个反应腔包埋一套特定的引物，可以检测不同的病原体；下层负压口位于中心位置，反应腔成放射状排列在负压口周围，通过细长通道与负压口连接；该细长通道即为检测通道，该通道内填充有微球以预堵塞，阳性反应液通过该段时会堵塞通道使液体无法流动，即可通过目视判断检测结果。
67.pmma基底芯片整体制作：使用热模压法的加工制造方式，以铬版玻璃通过曝光、显影、定影、水漂、后烘、腐蚀铬、腐蚀玻璃、去胶、去铬的步骤制作模板，把处理好的pmma基片和模板放到压片机的工作台上进行模压，最后将三层pmma芯片键合制作完成。
68.堵塞段通道设计为细长形以方便堵塞。在堵塞段进口填入直径为30μm的微球，进行通道的预填装，微球排列紧凑后堵住微球进口。此时该通道可允许水和阴性样本的反应后溶液通过，而含有阳性样本的反应后溶液则难以通过。此装置中没有设置阴性对照通道，可通过是否发生堵塞直接定性判断扩增结果。
69.将待测样本与扩增反应溶液共120μl装入200μl检测试管内，旋涡混合30s，用200μl注射器从进液口注入储液腔。将芯片离心30s，反应液均分至各个反应腔。采用水浴或金属浴的加热方法，根据试剂使用要求控制加热温度循环(如使用lamp试剂，需在65
°
恒温下加热30min)。扩增完成后，室温冷却1min，用500μl注射器吸取180μl酒精+90μl醋酸铵，从进液口注入储液腔。乙醇溶液与核酸可形成物理沉淀，常用于核酸提纯，该沉淀直径较大，此处应用该特性减缓流速形成堵塞。通入乙醇和醋酸铵混合液后，再次离心30s，在此离心过程中酒精与反应体系快速混合，从而均匀地生成核酸沉淀。为使反应结果更好观察，在使用500μl注射器注入280μl红色油性染料，使检测结果可被肉眼快速观察。即此时每个反应腔含有待测样本与扩增反应溶液20μl，酒精30μl，醋酸铵15μl。
70.注入红色染剂后，从负压口处利用负压产生器抽气，形成腔内负压，以驱动反应体系从反应腔流向收集腔。当反应体系流经堵塞通道段时，含有阳性样本的反应液将产生许
多沉淀，并堆积在细长通道内。这将使通道内出现明显地流速减慢的场景，而阴性样本则会有红色流体较快速地流入收集腔，一般阴性样本可在1分钟流过通道，阳性样本需花费10分钟及以上时间。即当原样本含有待测核酸时，该条通道呈现堵塞状态，反之同样成立，据此可通过目视判断检测结果。