一种表达外源hTRX1的增强型间充质干细胞及其制备方法和用途与流程

一种表达外源htrx1的增强型间充质干细胞及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及细胞治疗领域，更具体地，本发明涉及一种经修饰的间充质干细胞及其制备方法和用途。


背景技术：

2.人体组织细胞受电离辐射后，细胞生成并释放多种氧自由基和活性氧 (reactive oxygen species,ros)，同时抗氧化酶的作用减弱，导致dna碱基缺失、双链断裂、与蛋白质交联等多种类型损伤；其次，自由基可使生物膜发生脂质过氧化，膜的通透性增加，导致膜的结构及功能受损，甚至发生膜崩解。同时，ros使蛋白质紧密结构变得松散，疏水性、顺磁性、紫外吸收光谱等物理性质的改变，并易于被蛋白水解酶水解。最后，细胞结构及功能的损伤，进一步诱导细胞凋亡的发生。2007年lambeth研究证明，细胞通过nadph氧化酶(noxs)产生ros，进一步研究发现，nox4在电离辐射后的造血干细胞 (hscs)重表达上调，可能主要介导hsc中的ros产生。wang等研究发现，亚致死剂量辐射处理的小鼠体内ros持续增加，使用抗氧化剂可以显著降低细胞氧化损伤和辐射诱导的hscs克隆形成抑制。
3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,msc)是目前在组织损伤修复领域中应用范围最广的成体干细胞。1976年friedenstein和petrakova首次报道，通过贴壁培养的方法从骨髓中分离出msc，msc是中胚层来源的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，既可向成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、心肌细胞、基质细胞、内皮细胞、肝和胆道上皮细胞、肺上皮细胞等中胚层细胞分化，亦可向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化。同时，msc能产生一些造血及非造血生长因子、白介素和趋化因子，如 g-csf、lif、m-csf、flt-3配体、scf、il-6、il-11、il-12、tpo、il-15和 tnf-α等，此外，其还可分泌大量粘附分子。这些细胞因子在造血干细胞的增殖、分化及归巢中发挥重要作用。此外，msc本身还可能通过以下机制修复损伤器官：
①
msc通过分泌多种生长性细胞因子，促进细胞增殖；
②
msc在损伤局部促进新生血管生成；
③
分泌细胞因子，调剂机体/局部免疫反应；此外，msc 具有重建造血微环境、低免疫源性、免疫调节、易于外源基因转染和表达等特点。
4.msc已经开展的临床试验，主要包括：1、组织损伤修复；2、移植物抗宿主病的治疗；3、自身免疫性疾病；4、作为基因治疗的载体等。已经有多款间充质干细胞药物获批上市，我国也批准了多项间充质干细胞的临床试验。
5.大量研究表明，msc在促进造血恢复和延长hsc移植患者生存期等方面是安全有效的。放射诱发的肺损伤(rili)是胸部肿瘤放射治疗中的常见并发症， rili通过复杂的病理过程发展，导致多种细胞因子的诱导和激活，炎性细胞浸润，细胞因子诱导的成纤维细胞活化以及随后的活化成纤维细胞组织重塑，最终导致肺功能受损和呼吸衰竭。越来越多的证据表明，msc可能在调节炎症和免疫反应，促进受损的驻留细胞的存活和修复以及通过可溶性旁分泌因子和治疗性细胞外囊泡促进受损组织的再生中起主要作用。
6.msc易于外源基因转染和表达，且具有向照射后受损组织聚集的生物学特性。cheng等研究发现，在大鼠心梗模型中，与单纯输注骨髓msc相比，cxcr4 修饰的msc在梗死心肌内及周围大量聚集，并改善了心功能。利用趋化因子受体ccr1修饰的msc也出现了类似的结果。啮齿动物心肌梗死模型研究证明，除了增加损伤区的归巢率，cxcr4和sdf1双重修饰的msc还增加了血管生成和生长因子的表达，改善了血管内皮分化和血管生成，从而提高了心功能。 mangi等研究发现，应用反转录病毒作为载体，将抗凋亡信号蛋白akt修饰的 mscs移植到大鼠梗死的心肌内，可明显减少梗死心肌面积，抑制心室重构，提高左室射血功能。其作用机制可能与促进抗炎症因子和促修复因子的表达有关。通过使用抗凋亡因子bcl-2、血红素加氧酶-1(ho-1)、血管生成素和肝细胞生长因子等来修饰msc，来抑制其过早凋亡，提高抗缺氧能力，修复心肌细胞和促进血管生成，并改善心功能。
7.硫氧还蛋白(trx)系统由nadph、硫氧还蛋白还原酶(trxr)和硫氧还蛋白组成，通过其二硫还原酶活性调节蛋白质二硫醇/二硫平衡，是抵御氧化应激的关键抗氧化系统。人硫氧还蛋白(htrx1,thioredoxin)是一种12kda的多功能蛋白，具有保守的氧化还原催化位点(-cys-gly-pro-cys-)，与其他抗氧化剂如sod 和n-乙酰半胱氨酸不同，htrx1不但有强烈的清除体内过氧化物，保护细胞免受诸如肿瘤坏死因子(tnf)以及h2o2等损伤，而且其还具有抑制凋亡和促进细胞生长的作用，有利于受损伤组织的修复。此外，htrx1能清除活性氧中间物，从而保护细胞免受细胞毒作用。研究发现，htrx1通过清除自由基，减少活性氧来抑制脂质过氧化的产生，从而减轻缺血/再灌注引起的肺损伤。htrx1 通过抑制凋亡信号调节激酶ⅰ和caspase-3样蛋白酶的活性来抑制细胞凋亡。通过提高细胞对自身分泌的生长因子的敏感性来促进细胞增殖。htrx1能减轻肺及脑组织再灌注损伤。此外，htrx1也是一种应激诱导蛋白，在各种因素的刺激下其表达增强，如病毒感染、暴露于紫外线、x线照射和过氧化氢。提示其在病毒感染及急性辐射损伤中发挥重要作用。yagi等研究发现，在犬肺移植再灌注损伤模型中，htrx1治疗组(30mg/kg)与半胱氨酸治疗组(150mg/kg)均具有清除自由基的作用，减轻肺的缺血/再灌注损伤，起到保护移植肺的作用。hoshino等研究发现，重组人htrx1通过调节炎症反应可减轻由博来霉素或炎症因子il-2和il-18引起的小鼠间质性肺炎和肺纤维化。在脂多糖(lps)诱导的大鼠肺损伤模型中，静脉连续给予重组htrx1通过抗趋化作用来抑制支气管中性粒细胞浸润。另有研究表明，ros可能通过抑制trx1介导细胞自噬，促进细胞凋亡进程。chen等发现，htrx1通过减少ros生成、提高抗氧化活性和调节mapk和pi3k-akt信号通路，显著减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞损伤。
8.msc有多种来源，其中骨髓来源的msc研究的最多且最为深入，zhang等研究提示过表达trx1上调了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，下调了ros的产生，从而提高了骨髓msc抵抗高氧诱导损伤的能力，但是骨髓msc受到来源的限制并且随着年龄的增长其分化潜能逐渐降低，受到这些因素的影响，其应用受到很多限制。此外，人胎儿、围产期组织和成体多种组织中存在msc，包括胎肺、胎肝、羊水、胰腺、骨组织、软骨组织、肌肉组织、肌腱组织、脂肪组织、血管组织、脐带血和脐带。其中脂肪间充质干细胞虽来源广泛，但采集仍需二次手术，而外周血和脐血中由于msc数量少，因此它们都不是msc的最佳来源。
9.因此，存在对更具有临床应用前景的增强型msc细胞的需求。


技术实现要素：

10.为了解决上述问题，在第一个方面，本发明的目的在于提供一种增强型间充质干细胞，所述间充质干细胞中包含可以瞬时表达外源htrx1的载体，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
11.在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体。
12.在一个实施方案中，所述腺病毒载体是admax载体系统，优选地为ad5腺病毒载体，更优选地为ad5f35腺病毒。
13.在一个实施方案中，所述间充质干细胞是体外培养的脐带间充质干细胞，更具体地，是体外培养至p2代、p3代、p4代或p5代的脐带间充质干细胞。
14.在第二个方面，本发明的目的在于一种增强型间充质干细胞的制备方法，所述方法包括使用可瞬时表达htrx1的腺病毒载体感染所述间充质干细胞，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
15.在一个实施方案中，所述方法包括步骤：a.将从脐带中分离的间充质干细胞进行体外扩增后构建种子细胞库；b.构建可瞬时表达htrx1的腺病毒表达载体；c.从所述种子细胞库中复苏所述间充质干细胞；以及d.使用所述腺病毒载体感染所述间充质干细胞。
16.在一个实施方案中，将从脐带中分离的间充质干细胞进行体外扩增至p2代、 p3代、p4代或p5代后构建种子细胞库。
17.在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体。
18.在一个实施方案中，所述腺病毒载体是admax载体系统，优选地为ad5腺病毒载体，更优选地为ad5f35腺病毒。
19.在第三个方面，本发明的目的在于提供了第一个方面的增强型间充质干细胞在制备用于组织损伤修复的药物、治疗移植物抗宿主病的药物、治疗自身免疫性疾病的药物或者作为基因治疗的载体中的用途。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：相较于现有的增强型msc细胞，本发明的增强型脐带msc细胞具有更低的免疫原性和更强的免疫调节作用，易于获取且增殖能力强，能培养获得大量的msc细胞数足够满足临床治疗需要，可以瞬时高丰度htrx1，更具有临床应用前景。
附图说明
21.图1是本发明实施例中构建的腺病毒穿梭质粒的图谱。
22.图2是对本发明实施例中构建的腺病毒穿梭质粒克隆以及对1号和2号克隆酶切鉴定的电泳结果，其中图2a是1-6号克隆提取质粒的电泳结果。图2b 是对1号和2号克隆质粒酶切鉴定的电泳结果。
23.图3是显示病毒扩增时细胞形态改变的电镜图。
24.图4是复苏48h后流式法检测trx1蛋白表达的结果，其中图4a-4c的感染复数(moi)值分别为0、50、100。
25.图5是复苏48h后蛋白印迹(wb)法检测trx1蛋白表达的结果，其中从左至右泳道对应的moi值分别为0、50、100、200、400、800。
26.图6是t-msc细胞中trx1蛋白表达水平随时间的变化，其中绿色荧光蛋白(gfp)为
对照组。图7是t-msc细胞的核型检测结果。图8是t-msc细胞的表型鉴定结果。图9是对t-msc细胞进行诱导分化的结果，其中图9a是成脂肪诱导的细胞图，图9b是成骨诱导的细胞图，图9c是成软骨诱导的细胞图。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
28.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
30.1.trx1修饰的间充质干细胞的制备
31.1.1 脐带间充质干细胞分离培养
32.将脐带剪成2～5cm的小段后，首先将脐带中的血管剥离去除，随后在离心管中将脐带组织剪碎并与由ⅱ型胶原酶和透明质酸酶组成的消化液混合，在一定的温度和转速下振荡消化。脐带组织经消化处理后，将离心管静置约8～10min，让组织块自然沉降然后转移收集上层细胞悬液。上层细胞悬液经生理盐水或其它缓冲液稀释后，进行离心，获取细胞沉淀。将细胞沉淀用生理盐水或其它缓冲液洗涤离心后用培养基重悬接种于培养瓶中，置于细胞培养箱中于37℃、5％ co2条件下培养。待细胞生长至融合度达80～90％时消化收获，即得到mscs原代 (p0代)细胞。对于脐带组织消化处理后未消化完全的脐带组织块，用0.9％氯化钠注射液离心洗涤后，将组织块按照0.3～0.5cm的间距接种于培养皿中，稍晾干后，再缓慢加入间充质干细胞培养基。一般2～3d后即可见到组织块周围有长梭形细胞爬出，3～4天后换液，继续培养直至细胞沉淀培养消化收获时一并收获组织块贴壁法培养的细胞，合并后作为原代(p0代)细胞。消化后组织块小于0.5ml则不进行贴壁接种。
33.对原始细胞库进行细胞形态、细胞数、细胞活率、细胞表型、无菌检查、内毒素检查、支原体及衣原体检查、ebv、cmv检查，检定的细胞冻存于液氮罐中，用时复苏并做后期处理。
34.1.2 htrx1基因的克隆与腺病毒穿梭质粒构建
35.1.2.1 获得目的基因：
36.以现有质粒为模板设计引物，pcr获得htrx1片段并在两端加ecori、sali 酶切位点及其保护碱基。
37.引物序列为：
38.正向引物序列5
’‑
ccggaattcatggtgaagcagatcgag-3’(seq id no:1)
39.反向引物序列5
’‑
acgcgtcgacgactaattcattaatggtggcttc-3’(seq id no:2)
40.1.2.2 pcr产物用ecori/sali双酶切回收327bp片段
41.1.2.3 ecori/sali双酶切质粒pdc316，回收约3886bp片段
42.1.2.4 连接、转化，获得4207bp质粒，质粒图谱如图1所示
43.1.2.5 质粒鉴定：
44.1)酶切鉴定：
45.hindiii/kpni:331/3876
46.scai/sali:1936/2271
47.2)测序鉴定：
48.正向引物序列5
’‑
attggctgagctgcgttc-3’(seq id no:3)
49.反向引物序列5
’‑
atggccgacaagcagaagaa-3’(seq id no:4)
50.从1-6号克隆中提取质粒并进行电泳检测，获得条带大小均正确(参见图 2a)。取1、2号克隆进一步酶切鉴定，酶切后电泳条带大小均正确(参见图2b，其中泳道1对应1号克隆hindiii/kpni的酶切片段；泳道2对应1号克隆 scai/sali的酶切片段；泳道3对应2号克隆hindiii/kpni的酶切片段；泳道 4对应2号克隆scai/sali的酶切片段)。
51.将1、2号克隆测序，获得序列与已知htrx1序列(seq id no:5)比对结果显示均正确,保存1号克隆菌种及质粒用于病毒包装。
52.1.3 重组腺病毒ad5f35-htrx1的包装及纯化
53.将admax载体系统的ad5f35病毒载体骨架质粒与目的基因穿梭质粒共转染 hek293-c340细胞，转染后第二天更换新鲜培养液.持续观察7-10天，中途根据细胞状态进行补充适量培养液，待出现明显毒斑，收集细胞及培养液，进行冻融裂解后为原始毒种(参见图3)。取原始毒种与2％dmem培养液混合制成病毒感染液，感染t75瓶内hek293细胞，感染3-4h后更换2％dmem培养液，待细胞病变率＞90％后收集细胞及培养液，裂解后离心取上清为1代毒种，分装冻存于-70℃，并送检目的基因鉴定和滴度，检测结果见下文表1，待检测合格后用于后续病毒大量制备用工作毒种。
54.根据毒种感染滴度与最佳感染moi，计算病毒扩增用毒种体积；取毒种感染多个t225内hek293细胞，约48-52h观察细胞病变率＞90％后收集细胞及培养液，低速离心除去培养液，更换为纯化缓冲a液，重悬细胞沉淀，并加入核酸酶，进行裂解。裂解后离心取上清进行离子交换层析纯化病毒并置换为保存缓冲液，分装冻存于-70℃以下。
55.表1：ad5f35-htrx1腺病毒质量标准及检测结果
[0056][0057]
1.4 表达外源htrx1的增强型间充质干细胞t-msc的制备
[0058]
复苏预先冻存的p4代脐带间充质干细胞至t175培养瓶，贴壁24小时后，加入ad5f35-htrx1腺病毒，轻柔震荡混匀，5
±
1小时后收获，以常规方法液氮冻存备用。
[0059]
1.4.1 增强型间充质干细胞t-msc的htrx1蛋白表达水平
[0060]
通过流式和wb检测复苏后48小时的t-msc细胞htrx1蛋白(seq id no:6) 的表达水平，可见复苏后48小时的t-msc有较强水平的trx1蛋白表达(参见图4和图5)
[0061]
在不同时间检测细胞的活率和trx1蛋白水平，结果如下：细胞活率始终保持在85％以上；复苏12小时开始逐渐表达外源蛋白，直到96小时仍保持着较强的表达水平(参见下文表2及图6)。
[0062]
表2 t-msc细胞活率检测
[0063][0064]
1.4.2 基本检测
[0065]
对增强型间充质干细胞进行了多项检测，其中无菌检测和内毒素检测均为阴性，人源病毒检测为阴性，染色体核型检测结构和数量均正常(参见图7)。
[0066]
1.4.3 增强型间充质干细胞t-msc细胞的表面标志
[0067]
t-msc细胞复苏48小时后行流式检测，按照抗体组合表分管标记细胞：
[0068][0069][0070]
cd105+、cd73+、cd90+细胞≥95％，cd34+、cd14+、hla-dr+、cd19+、cd45+ 细胞的比例≤2％，符合2006年国际干细胞治疗学会提出的《多潜能间充质干细胞最低标准》检测脐带msc的表面标志的标准(参见图8)。
[0071]
1.4.4 增强型间充质干细胞t-msc细胞的多向分化潜能
[0072]
成脂肪诱导：细胞按8
×
104/孔接种于6孔板，msc培养基培养24h后换用含10％fbs的dmem-hg，并加入地塞米松1μm、消炎痛200μm、ibmx 0.5mm，每3天半量换液，诱导2周，去培养基后，pbs洗一次，加入12％中性甲醛溶液固定5min，加入油红o染液染色30min，60％甲醛脱色数秒，镜下观察；
[0073]
成骨诱导：细胞按4
×
104/孔接种于6孔板，msc培养基培养24h后换用含 10％fbs的dmem-hg并加入地塞米松0.1μm、抗坏血酸磷酸盐50μm、β-磷酸甘油10mm，每3天半量换液，诱导2～4周，弃诱导培养基，pbs洗一遍，加入固定液(柠檬酸40μl+去离子水2ml+丙酮3ml)固定30秒；加入染色工作液(坚牢兰rr 62.5μl+去离子水3ml+as-mx 125μl)，避光反应30min；倒掉染液，加少量水，镜下观察；
[0074]
成软骨诱导：细胞按2-4
×
105/管细胞在尖底离心管中260g低速离心10 min，使细胞形成微团，msc培养基培养24h后细胞形成微球，换用无血清的 dmem-hg，并加入its 1％，丙酮酸钠1mm，抗坏血酸磷盐50μm，tgf-β3 10ng/ml，每3天半量换液，连续培养3-4周，10％中性甲醛固定进行石蜡包埋切片，切片脱蜡后，分别用5％阿尔辛兰染色，37℃染色30min，水洗、封片观察。
[0075]
经油红o染色可见细胞内脂滴形成，经碱性磷酸酶染色阳性细胞呈蓝紫色，经阿尔新蓝染色阳性细胞呈蓝色(参见图9)，提示t-msc细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞，以上特性均符合2006年isct对msc细胞的描述。
[0076]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。