一种1,3,4-噁二唑衍生物及其制备方法和用途

一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明公开了一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物，公开了这种1,3,4
‑
噁二唑衍生物的不同的制备方法和其新的用途。其能够用于制备共济失调毛细血管扩张突变基因和rad3相关激酶(atr)的抑制剂和抗肿瘤药物。


背景技术：

2.共济失调毛细血管扩张突变基因和rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and rad
‑
3related protein kinase，atr)作为pikk家族中的重要蛋白激酶，不仅和基因重组有关，而且在dna损伤修复通路中发挥关键调节作用。atr接受上游调控信号单链dna(single stranded dna，ssdna)的断裂被激活后可通过磷酸化一系列下游蛋白，控制细胞周期分裂，促进脱氧核糖核苷酸合成，从而确保基因组的完整性。atr的生理学功能受损可导致一系列疾病，包括免疫缺陷、神经系统紊乱和癌症。由于肿瘤细胞中dna损伤应答机制存在缺陷，表现出肿瘤细胞对atr依赖性更高，atr抑制剂可以选择性抑制肿瘤细胞而对健康细胞影响较小。因此，atr被视为理想的抗肿瘤药物靶点。
3.1,3,4
‑
噁二唑及其衍生物作为一种重要的医药中间体，具有光谱生物活性，在消炎、抗真菌、抗结核、抗hiv、抗病毒以及抗肿瘤等方面广泛应用。传统的1,3,4
‑
噁二唑衍生物的制备方法中最常用的有“双酰肼环合法”，该合成方法通常需要较高的回流温度和脱水剂(如三氯氧磷、五氯氧磷、浓硫酸、亚硫酰氯、三氟甲磺酰酰氯和多聚磷酸等)，上述脱水剂存在毒性强、沸点高、腐蚀性高且对环境污染严重等问题，不利于实验室使用和工业化生产。尽管采用微波辅助反应方法快捷高效，但缺点是安全系数低。本发明以二溴三苯基膦为脱水环化剂，室温条件即可发生反应，收率高、反应后处理简单并且对环境友好，具有很好的实用价值。
4.现有的atr抑制剂数量较少，只有两种小分子药物(vx
‑
970和azd6738)处于临床试验阶段，迄今并没有一款上市药物的开发。渥曼青霉素(wortmannin)和五味子乙素(schisandrin b)是早期开发的两种弱选择性的atr抑制剂，因其药理毒性限制了进一步研究。诺华公司开发的一款吡唑并哌嗪衍生物对atr的抑制活性为ic
50
＝0.4nm，由于其存在体内药物代谢的安全性问题，该衍生物主要用作化学增敏剂使用。az20是一款开发的低纳摩尔级别活性的atr抑制剂，其抑制atr的活性为ic
50
＝5nm，可以使移植lovo结直肠细胞的小鼠肿瘤体积显著减小，但该抑制剂的低溶解度限制了进一步研究。因此，针对现阶段atr抑制剂数量不足、溶解度低且存在临床试验不良副反应等问题，开发新型的特异性atr抑制剂仍具有重要实际意义。


技术实现要素：

5.本发明属于药物研究领域，涉及一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物，公开其与往不同的制备方法，以及其与往不同的用途，用途包括用于制备共济失调毛细血管扩张突变基因和rad3相关激酶(atr)的抑制剂和抗肿瘤药物。
6.本发明公开的一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物，其具有如下结构：
[0007][0008]
本发明提供了所述1,3,4
‑
噁二唑衍生物的制备方法，通过图1的化学合成路线制备。其中，该制备方法具体包含以下步骤：
[0009]
步骤a：以化合物1(3
‑
氨基
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯)为原料，加入盐酸的水溶液使其酸化。冷却反应体系，滴加亚硝酸钠(nano2)以及体积百分含量为40％的四氟硼酸(hbf4)水溶液，化合物1、盐酸、亚硝酸钠以及四氟硼酸的摩尔比为1：2.5：1.2：3，反应混合物在室温反应3h后减压抽滤，得到化合物1的中间体(3
‑
四氟硼酸铵
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯)为淡黄色粉末状物质。将3
‑
四氟硼酸铵
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯溶解于甲苯中，反应混合物于110℃回流1h，使3
‑
四氟硼酸铵
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯充分分解。反应完毕真空减压浓缩除去甲苯，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到化合物2(3
‑
氟
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯)。
[0010]
步骤b：以化合物2(3
‑
氟
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯)为底物，以无水乙醇为溶剂，加入水合肼进行酯交换反应，反应混合物于70℃回流反应1.5h，化合物2和水合肼的摩尔比为1：6，回流反应后反应混合物冷却至室温，减压过滤并用无水乙醇洗涤滤饼，得到化合物3(6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
碳酰肼)。
[0011]
步骤c：以化合物3(3
‑
氟
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
碳酰肼)和化合物4(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯甲酸)为底物，以无水乙腈为溶剂，以二溴三苯基膦为脱水环化剂，室温搅拌反应1小时，滴加n,n
‑
二异丙基乙胺(diea)继续反应16h。化合物3、化合物4、二溴三苯基膦和n,n
‑
二异丙基乙胺的摩尔比为1：1：3：6。反应后处理为减压过滤并用无水乙腈和正己烷洗涤滤饼，得到化合物5(2
‑
(6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑)。
[0012]
步骤d：以化合物6(5
‑
溴
‑
2(1h)
‑
吡啶酮)和3
‑
溴戊烷为底物、以乙二醇二甲醚为溶剂，加入3
‑
溴戊烷和碳酸铯，化合物6、3
‑
溴戊烷和碳酸铯的摩尔比为1：1.5：3，反应混合物于80℃回流2h。反应后处理为用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，洗涤后合并有机层，用无水na2so4干燥并过滤，真空减压浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到化合物7(5
‑
溴
‑1‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮)。
[0013]
步骤e：以化合物7(5
‑
溴
‑1‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮)和联硼酸频哪醇酯为底物，以1,4
‑
二氧六环为溶剂，以醋酸钾和二氯化钯为催化剂；化合物7、联硼酸频哪醇酯、醋酸钾以及二氯化钯的摩尔比为1：1.5：2：0.1，氮气保护条件下反应混合物于90℃回流12h后用乙酸乙酯和饱和食盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到化合物8(1
‑
异戊基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢吡啶
‑3‑
硼酸频哪醇酯)。
[0014]
步骤f：以化合物5(2
‑
(6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑)和化合物8(1
‑
异戊基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢吡啶
‑3‑
硼酸频哪醇酯)为底物，以1,4
‑
二氧六环为溶剂，以1,1'
‑
双二苯基膦二茂铁二氯化钯为催化剂，加入2m碳酸钾水溶液。化合物5、化合物8、1,1'
‑
双二苯基膦二茂铁二氯化钯和碳酸钾的摩尔比为1：1.1：0.1：
2，氮气保护条件下反应混合物于80℃回流反应2小时。回流反应后处理为用饱和食盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用无水na2so4干燥并过滤，真空减压浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到化合物ⅰ(2
‑
(6
‑
(1
‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮
‑4‑
基)
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑)。
[0015]
本发明所述的1,3,4
‑
噁二唑衍生物结构新颖，侧链苯环的吸电子基团(硝基)有助于提升其抗肿瘤活性。该1,3,4
‑
噁二唑衍生物的制备方法与传统1,3,4
‑
噁二唑衍生物制备方法(如“双酰肼环合法”)相比，能克服高温反应条件、脱水环化剂毒性强且易腐蚀等缺点，本发明提供的制备方法采用二溴三苯基膦为脱水环化剂，室温即可反应且对环境友好。本发明公开的1,3,4
‑
噁二唑衍生物用途与以往用途(如抗菌、抗病毒等)不同，可用于atr抑制剂和协同抗乳腺癌药物的制备。
附图说明
[0016]
图1是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物的制备路线
[0017]
图2是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物的1h nmr谱图
[0018]
图3是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物的
13
c nmr谱图
[0019]
图4是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物的ms谱图
[0020]
图5是本发明盐酸阿霉素抑制mcf
‑
7细胞的增殖活性
[0021]
图6是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物抑制mcf
‑
7细胞的增殖活性
[0022]
图7是本发明1,3,4
‑
噁二唑衍生物与盐酸阿霉素联合给药抑制mcf
‑
7细胞的增殖活性
具体实施方式
[0023]
以下结合附图，通过具体的实施例对本发明作进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
[0024]
化合物ⅰ制备的具体实施方法如下：
[0025]
步骤a：将3
‑
氨基
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯(5.0g，21.55mmol)溶于盐酸(5.47ml，53.88mmol)的水溶液(盐酸与水的体积比为1：1)中搅拌至糊状，室温反应20分钟。将该反应体系冷却至0℃后，滴加20ml nano2(1.64g，23.7mmol)水溶液，在0℃下充分搅拌反应10min后，滴加体积比为40％的hbf4水溶液(14.2ml，66.45mmol)，滴加完毕后在室温继续反应3小时。反应混合物减压抽滤，滤饼用冰水洗涤，真空干燥箱干燥，得淡黄色粉末状物质3
‑
四氟硼酸铵盐
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯。将上述3
‑
四氟硼酸铵盐
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯(4.5mg，19.1mmol)溶解于20ml甲苯中，充分搅拌反应混合物于110℃回流1h，使氟硼酸重氮盐充分分解，同时利用naoh溶液吸收分解产生的酸性气体bf3，防止其对环境产生污染。真空减压浓缩除去甲苯溶液，通过硅胶柱分离纯化得到化合物2(3
‑
氟
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯)，收率为20％。
[0026]
步骤b：将3
‑
氟
‑6‑
溴吡嗪
‑2‑
甲酸甲酯(800mg，3.42mmol)溶解于30ml无水乙醇中，滴加水合肼(85％，0.75ml，20.5mmol)，滴加完毕于70℃回流反应1.5h。反应液在冰箱冷却结晶，析出大量橙黄色沉淀，减压过滤得6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
碳酰肼，收率为85％。
[0027]
步骤c：将6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
碳酰肼(500mg，1.2mmol)溶于无水乙腈(5ml)，分别加
入2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯甲酸(314mg，1.44mmol)，二溴三苯基膦(1522mg，3.6mmol)室温搅拌反应1小时后，滴加n,n
‑
二异丙基乙胺(1.672ml，9.6mmol)。反应混合物室温搅拌16小时。用饱和食盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用na2so4干燥，过滤并浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到2
‑
(6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑，收率为32.5％。
[0028]
步骤d：将5
‑
溴
‑
2(1h)
‑
吡啶酮(1.159mg，6.66mmol)、碳酸铯(2.82g，8.7mmol)溶于乙二醇二甲醚溶液(20ml)中，室温滴加3
‑
溴戊烷(8.64ml，8.7mmol)。滴加完毕，反应混合物于80℃回流反应2小时。用乙酸乙酯和饱和盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用无水na2so4干燥并过滤，真空减压浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到中间体5
‑
溴
‑1‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮，收率为69.5％。
[0029]
步骤e：将5
‑
溴
‑1‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮(1.0g，4.63mmol)溶于1,4
‑
二氧六环(15ml)中，依次加入联硼酸频那醇酯(1.41g，5.55mmol)，醋酸钾(0.61g，9.3mmol)以及二氯化钯(339mg，0.462mmol)。氮气保护条件下反应混合物于90℃回流反应12小时。用乙酸乙酯和饱和食盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到黑色油状液体(1
‑
异戊基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢吡啶
‑3‑
硼酸频哪醇酯)，收率为82.5％。
[0030]
步骤f：将2
‑
(6
‑
溴
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑(200mg，0.5mmol)溶于1,4
‑
二氧六环(20ml)，分别加入1
‑
异戊基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢吡啶
‑3‑
硼酸频那醇酯(161mg，0.55mmol)，1,1'
‑
双二苯基膦二茂铁二氯化钯(36.8mg，0.05mmol)以及2m碳酸钾(0.504ml，1.0mmol)。氮气保护条件下反应混合物于80℃回流反应2小时。用饱和食盐水洗涤，洗涤后合并有机层，用na2so4干燥，过滤并浓缩，粗产物经过硅胶柱分离纯化得到最终化合物ⅰ为2
‑
(6
‑
(1
‑
异戊基
‑
2(1h)
‑
吡啶酮
‑4‑
基)
‑3‑
氟吡嗪
‑2‑
基)
‑5‑
(2
‑
硝基
‑4‑
(甲基磺酰基)苯基)
‑
1,3,4
‑
噁二唑，收率为58.2％。该化合物ⅰ经过核磁共振氢谱表征其结构(图2)：1h nmr(400mhz，c2d6so)δ:0.83(t,6h)，1.63(m,2h)，1.69(m,2h)3.12(s,3h)，4.67(m,1h)，6.35(d,1h)，7.44(d,1h)，7.66(s,1h)，8.12(d,2h)，8.32(d,2h)8.41(s,1h)，8.53(s,1h)。该化合物ⅰ经过核磁共振碳谱表征其结构(图3)：
13
c nmr(400mhz，c2d6so)δ:10.35，21.00，24.59，42.95，52.30，83.71，119.00，122.86，131.17，131.65，142.20，144.31，150.07，154.96，162.34，165.37，166.10，171.95。该化合物ⅰ经质谱分析(图4)，ms(es
+
)m/z：584.85[m+k+h2o]
+
。
[0031]
本发明使用上述1,3,4
‑
噁二唑衍生物抑制mcf
‑
7细胞增殖的实验考察其抗肿瘤用途。本发明使用的细胞株为人源乳腺癌细胞mcf
‑
7，来源于中国科学院上海细胞库，阳性对照药物为盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，dox)。实验采用cck
‑
8试剂盒检测细胞生长情况，根据细胞存活率计算ic
50
，进而评价新型atr抑制剂的抗肿瘤效果。
[0032]
本发明实验分为3组，分别为给药组(分别为化合物单独给药组及化合物与盐酸阿霉素联合给药组)、阴性对照组(加入体积分数0.1％的无菌dmso完全培养基溶液)和空白对照组。设置新型atr抑制剂的浓度梯度为25μm、50μm、100μm、200μm和400μm；盐酸阿霉素的浓度梯度为0.01μm、0.1μm、1μm、10μm和100μm。盐酸阿霉素与新型atr抑制剂以摩尔比1：1联合使用的浓度梯度为0.02μm、0.2μm、2μm、20μm以及200μm。
[0033]
本发明抗mcf
‑
7细胞增殖实验的具体实施过程如下：
[0034]
a.细胞培养：人源乳腺癌细胞株(mcf
‑
7)用dmem完全培养基(含有10％体积分数的胎牛血清和1％体积分数的青链霉素(双抗))在37℃、5％co2恒温培养箱培养24～48h，显微镜下观察mcf
‑
7细胞的生长状态，待细胞贴壁生长后从培养箱取出。
[0035]
b.细胞接种：取对数生长期的mcf
‑
7细胞，弃掉原有培养基，用pbs缓冲液清洗细胞，加入1ml胰酶消化液消化2min。然后加入2ml dmem完全培养基终止消化。将经胰酶消化的细胞转移至15ml离心管中，放入离心机于1500rpm离心5min，弃去上清液之后用dmem完全培养基重悬细胞，细胞混匀后接种于96孔板中，每孔100μl。之后将接种细胞的96孔板放回恒温培养箱中继续培养24h，显微镜定期观察细胞至贴壁生长。
[0036]
c.给药处理：用无菌dmso分别配制化合物ⅰ和盐酸阿霉素最大浓度母液，再用dmem完全培养基分别按比例稀释成不同浓度梯度的溶液。按照浓度梯度每孔加入100μl配制的候选化合物和盐酸阿霉素溶液，每个浓度设置3个复孔，将96孔板放进培养箱培养24～48h。
[0037]
d.cck
‑
8检测法计算细胞存活率：用完全培养基配制含10％体积分数的cck
‑
8检测试剂，弃去每孔中原有的培养基，加入pbs缓冲液清洗细胞后加入cck
‑
8检测试剂，放回恒温培养箱继续培养1～2h，最后用酶标仪在450nm波长处读取od值，按照公式1计算细胞存活率。按照公式2计算药物协同作用指数(combination index，ci)，从而判断两种药物的协同效应。
[0038][0039][0040]
其中，a、b代表不同的两种药物，d
a
和d
b
分别代表两种药物联合使用使肿瘤细胞生长抑制率达到x时的药物浓度，ic
x,a
和ic
x,b
分别代表两种药物单独使用使肿瘤细胞生长抑制率达到x时的药物浓度。
[0041]
本发明公开的一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物对mcf
‑
7细胞具有增殖抑制作用。根据公式1计算得盐酸阿霉素抑制mcf
‑
7细胞的增殖活性为ic
50
＝0.854μm(图5)，1,3,4
‑
噁二唑衍生物抑制mcf
‑
7细胞增殖活性为ic
50
＝154.087μm(图6)。
[0042]
盐酸阿霉素与1,3,4
‑
噁二唑衍生物以摩尔比1：1联合使用抑制mcf
‑
7细胞增殖活性为0.597μm(图7)，根据公式2计算得其协同效应ci＝0.351。根据soriano等的联合用药指数法：当0.9≤ci≤1.1时，药物发挥相互拮抗作用；当0.8≤ci<0.9时，药物发挥低度协同作用；当0.6≤ci<0.8时，药物发挥中度协同作用；当0.4≤ci<0.6时，药物发挥高度协同作用；当0.2≤ci<0.4时，药物发挥强协同作用。表明本发明提供的一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物与盐酸阿霉素联合使用抑制mcf
‑
7细胞增殖发挥强协同作用，能够显著抑制mcf
‑
7肿瘤细胞增殖。
[0043]
本发明提供的一种1,3,4
‑
噁二唑衍生物，其用途主要为抑制mcf
‑
7肿瘤细胞增殖，采用化疗药物盐酸阿霉素与新型atr抑制剂协同抗肿瘤增殖的方案，能够减少盐酸阿霉素的用量，以期降低化疗药物长期使用产生的耐药性问题，该策略有望为肿瘤临床治疗提供新的思路和解决方案。