1.本发明属于食用菌培养技术领域，尤其涉及一种蛹虫草菌株液态发酵的方法。
背景技术：
2.蛹虫草隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、粪壳菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属。蛹虫草是非常著名的药食两用的子囊真菌，也是获得虫草素的主要来源，具有很高的开发利用价值。近年来，随着野生冬虫夏草资源的日渐枯竭，其价格不断攀升，从而促使人们寻找野生冬虫夏草的替代品。由于蛹虫草具有与冬虫夏草相近的药用与食用价值，加之蛹虫草更加容易驯化，因此受到人们越来越多的关注。
3.蛹虫草菌种的制备是生产过程中的一个重要环节。一般蛹虫草菌种的生产采用三级制种方法。即母种、原种、生产种。要想生产出合格的菌种，必须先培育出母种，而后由母种制成原种，由原种制成生产种，而后用生产种转接至小麦培养基，再进行培养子实体管理。其中原种和生产种可利用液态发酵技术进行制种。
4.液态发酵技术是现代生物技术之一，它是指在生化反应器中，模仿自然界将菌株在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，提供适于菌体代谢所需要的环境，并控制适宜的外界条件，进行大量培养繁殖的过程。工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。发酵液直接供作药用或供分离提取，也可以作液体菌种。
5.由于传统工艺中液体配方的营养不全面，导致蛹虫草发菌慢，生产周期长，能耗大，同时我国尚未颁布统一的蛹虫草质量控制标准，因此在蛹虫草菌株培育领域亟需高效优质的液态发酵方法。
技术实现要素：
6.本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种蛹虫草菌株液态发酵的方法。
7.为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括以下步骤：（1）菌株活化：将保存的蛹虫草菌株接种于pda斜面培养基中，于生化培养箱中避光培养至菌丝长满培养基；（2）种子培养：从上述pda斜面培养基中用接种针切取带培养基的斜面菌丝，接种于种子培养基中，于培养箱中培养；（3）液态发酵培养：将上述所得种子液接种于发酵培养基中，于培养箱中培养。
8.进一步的，所述步骤2中种子培养基由以下质量比例的原料制成：蛋白胨20
‑
25g、蔗糖25
‑
30g、硝酸钠2.5
‑
3g、磷酸二氢钾0.8
‑
1.2g、硫酸镁0.3
‑
0.5g、硫酸亚铁0.01
‑
0.02g、氯化钾0.3
‑
0.5g、玻璃纤维5
‑
10g、水800
‑
1000g。
9.优选的，所述玻璃纤维为短切玻璃纤维，其长度控制为6
‑
12mm。
10.优选的，所述步骤2中培养箱温度控制为24
‑
27℃，震荡速度控制为130
‑
150r/min，培养时间为72
‑
96小时。
11.进一步的，所述步骤3中发酵培养基由以下质量比例的原料制成：蛋白胨15
‑
20g、蔗糖10
‑
15g、马铃薯240
‑
300g、桑葚匀浆液5
‑
10g、磷酸二氢钾0.8
‑
1g、硫酸镁0.3
‑
0.5g、维生素b1 0.01
‑
0.02g、氯化钾0.3
‑
0.5g、水800
‑
1000g。
12.更进一步的，所述桑葚匀浆液的制备方法如下：将新鲜桑葚洗净后加4
‑
6倍水浸泡1
‑
2小时，用榨汁机粉碎后双层纱布过滤得到匀浆液，再将剩余桑葚渣补水后重复榨汁2
‑
3次，合并桑葚榨汁，过滤定容制成10g/l的桑葚匀浆液即可。
13.更进一步的，所述桑葚匀浆液在发酵培养时间达到60小时后再进行添加。
14.优选的，所述步骤3中培养箱温度控制为24
‑
28℃，震荡速度控制为140
‑
160r/min，培养时间为72
‑
120小时。
15.本发明的优点是：本发明蛹虫草菌株液态发酵方法采用三步法，通过菌株活化、种子培养和液态发酵培养实现蛹虫草菌株的高效培育，各步骤依次进行，针对性更强，能大大缩减蛹虫草生产周期，同时操作简单易掌握。
16.在种子培养过程中，于种子培养基中加入除营养物质外，还补充了少量玻璃纤维成分，其作为无机非金属材料，对菌种无毒害作用，较好的机械强度能够作为蛹虫草菌株生长的物理依附，更多的生长位点有利于蛹虫草菌株的快速培养，同时玻璃纤维径短坚韧的特点便于后续取出回收。
17.在液态发酵培养过程中，加入了桑葚匀浆液作为营养补充物质，桑葚匀浆中含有的大量糖类、蛋白质、纤维等物质能促进蛹虫草菌株在代谢过程中对一些重要的有效成分进行转化，进而增加有效成分的积累，同时在对羟基自由基和超氧负离子自由基具有清除作用的桑葚多糖的作用下经发酵培养能够产生大量的具有抗氧化性的发酵产物，有利于提高液态发酵培养的经济效益。
18.本发明蛹虫草菌株液态发酵方法投入小、操作方便，生产条件容易控制，有利于工业化生产。
具体实施方式
19.以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：实施例1一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括以下步骤：（1）菌株活化：将保存的蛹虫草菌株接种于pda斜面培养基中，于生化培养箱中避光培养至菌丝长满培养基；（2）种子培养：从上述pda斜面培养基中用接种针切取带培养基的斜面菌丝，接种于种子培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为25℃，震荡速度控制为140r/min，培养时间为85小时；（3）液态发酵培养：将上述所得种子液接种于发酵培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为26℃，震荡速度控制为150r/min，培养时间为108小时。
20.所述种子培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨22g、蔗糖28g、硝酸钠2.8g、磷酸
二氢钾1g、硫酸镁0.4g、硫酸亚铁0.01g、氯化钾0.4g、6
‑
12mm短切玻璃纤维7g、水900g。
21.所述发酵培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨18g、蔗糖13g、马铃薯270g、桑葚匀浆液8g、磷酸二氢钾0.9g、硫酸镁0.4g、维生素b1 0.01g、氯化钾0.4g、水900g。
22.所述桑葚匀浆液的制备方法如下：将新鲜桑葚洗净后加5倍水浸泡1.5小时，用榨汁机粉碎后双层纱布过滤得到匀浆液，再将剩余桑葚渣补水后重复榨汁3次，合并桑葚榨汁，过滤定容制成10g/l的桑葚匀浆液即可，其中桑葚匀浆液在发酵培养时间达到60小时后再进行添加。
23.实施例2一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括以下步骤：（1）菌株活化：将保存的蛹虫草菌株接种于pda斜面培养基中，于生化培养箱中避光培养至菌丝长满培养基；（2）种子培养：从上述pda斜面培养基中用接种针切取带培养基的斜面菌丝，接种于种子培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为24℃，震荡速度控制为130r/min，培养时间为96小时；（3）液态发酵培养：将上述所得种子液接种于发酵培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为24℃，震荡速度控制为140r/min，培养时间为120小时。
24.所述种子培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨20g、蔗糖25g、硝酸钠2.5g、磷酸二氢钾0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.01g、氯化钾0.3g、6
‑
12mm短切玻璃纤维5g、水800g。
25.所述发酵培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨15g、蔗糖10g、马铃薯240g、桑葚匀浆液5g、磷酸二氢钾0.8g、硫酸镁0.3g、维生素b1 0.01g、氯化钾0.3g、水800g。
26.所述桑葚匀浆液的制备方法如下：将新鲜桑葚洗净后加4倍水浸泡2小时，用榨汁机粉碎后双层纱布过滤得到匀浆液，再将剩余桑葚渣补水后重复榨汁2次，合并桑葚榨汁，过滤定容制成10g/l的桑葚匀浆液即可，其中桑葚匀浆液在发酵培养时间达到60小时后再进行添加。
27.实施例3一种蛹虫草菌株液态发酵的方法，包括以下步骤：（1）菌株活化：将保存的蛹虫草菌株接种于pda斜面培养基中，于生化培养箱中避光培养至菌丝长满培养基；（2）种子培养：从上述pda斜面培养基中用接种针切取带培养基的斜面菌丝，接种于种子培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为27℃，震荡速度控制为150r/min，培养时间为72小时；（3）液态发酵培养：将上述所得种子液接种于发酵培养基中，于培养箱中培养，培养箱温度控制为28℃，震荡速度控制为160r/min，培养时间为72小时。
28.所述种子培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨25g、蔗糖30g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾1.2g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.02g、氯化钾0.5g、6
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12mm短切玻璃纤维10g、水1000g。
29.所述发酵培养基由以下质量的原料制成：蛋白胨20g、蔗糖15g、马铃薯300g、桑葚匀浆液10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素b1 0.02g、氯化钾0.5g、水1000g。
30.所述桑葚匀浆液的制备方法如下：将新鲜桑葚洗净后加6倍水浸泡1小时，用榨汁机粉碎后双层纱布过滤得到匀浆液，再将剩余桑葚渣补水后重复榨汁3次，合并桑葚榨汁，
过滤定容制成10g/l的桑葚匀浆液即可，其中桑葚匀浆液在发酵培养时间达到60小时后再进行添加。
31.对比例采用常规摇床培养方法培养，同时培养基中无玻璃纤维和桑葚匀浆液的添加。
32.经测试实施例1
‑
3较对比例的菌种生产周期缩短了1
‑
4天，同时对发酵产物干重测定，实施例均达到11.3g/l以上，较对比例提高了36.3%，经羟自由基测定试剂盒试验，实施例发酵产物物清除oh
·
能力较对比例提高了41.7%。
33.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。