一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法

1.本发明涉及海洋生物工程领域，特别涉及一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法。


背景技术：

2.目前，贝类利用模式主要是直接食用或取贝肉制作干制品，技术含量低，产品种类较少、附加值低，而且占贝类体重50％的裙边、贝壳等下脚料常作为加工废弃物丢弃，资源利用率低、污染排放严重，从而造成增产不增收，竞争力弱的行业困境。研究表明，扇贝裙边中营养成分十分丰富，不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、微量元素等营养成分，还含有活性多糖、牛磺酸等多种生物活性物质，营养价值高，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多种生理活性。若合理利用扇贝裙边中的生物活性物质，不仅可减少环境污染，且资源也可以得到合理的应用，因此，扇贝裙边具有很高的开发利用价值。
3.水解动物蛋白是一种优质的蛋白资源，主要为低分子多肽，含有大量的人体必需氨基酸，扇贝裙边的粗蛋白质含量均在65％以上，其中必需氨基酸/总氨基酸和必需氨基酸/非必须氨基酸比值分别为0.41和0.68，高于fao/who建议值0.40和0.60，说明扇贝裙边蛋白是一种优质蛋白，以该蛋白为底物，通过酶解法制备的酶解液营养均衡，有作为制备生物活性肽的应用前景。另外，也有研究报道扇贝裙边中提取并分离纯化得扇贝多糖，具有较好的抗凝血活性，其有可能成为一种新型海洋药物。然而无论是单一的制备裙边多肽，或者只从扇贝裙边中提取多糖，必然会对另一种活性物质造成浪费，如何同时提取裙边中的多糖和多肽两种活性物质，开发高值裙边功能糖肽产品，尚未解决，是实现扇贝裙边高效资源利用的重要难题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法，可以同时将扇贝裙边中有较好的生物活性的蛋白和多糖充分利用，提高扇贝产品附加值的目的。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
6.一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法，包括如下过程：
7.以扇贝裙边为原料，绞碎后加入去离子水，置于35
‑
50℃的恒温水浴中保持30
‑
60min，后调节ph值至7
‑
9，而后采用两段酶解法，先加入复合蛋白酶，加热酶解2.5
‑
4小时，后加入中性蛋白酶，继续加热酶解2.5
‑
4小时；酶解反应结束后，将酶解液置于100℃沸水浴中灭活10
‑
20min，然后在2
‑
6℃下离心8
‑
12min，收集上清液，冷冻干燥即得功能糖肽。
8.上述方案中，所述扇贝裙边与去离子水的质量比为1:4
‑
1:10。
9.优选地，所述扇贝裙边与去离子水的质量比为1:6。
10.上述方案中，所述复合蛋白酶的质量为扇贝裙边质量的2.5％
‑
12.5％，中性蛋白酶的质量为扇贝裙边质量的7.5％
‑
12.5％。
11.上述方案中，所述加热酶解温度为40
‑
50℃。
12.上述方案中，所述酶解液在沸水浴中灭活时间为15min。
13.上述方案中，离心的温度为4℃，转速为9000转，离心时间10min。
14.上述方案中，制得的功能糖肽中的糖为糖胺聚糖。
15.上述方案中，制得的功能糖肽中的肽分子量为300
‑
2900da，氨基酸组成为天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸。
16.一种从扇贝裙边中提取的功能糖肽在抗氧化和免疫调节药物或功能食品中的应用。
17.通过上述技术方案，本发明提供的一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法具有如下有益效果：
18.1、本发明以扇贝裙边下脚料为原料，利用两段式复合酶解技术，进行功能糖肽的提取，提取效率高，且绿色环保。
19.2、本发明可同时提取扇贝裙边中的多糖和多肽，可以对扇贝营养物质进行全面利用。
20.3、本发明提取的功能糖肽中的多糖为糖胺聚糖，本发明采用糖胺聚糖专一性的显色方法1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法对提取液中的糖胺聚糖进行定量测定，糖胺聚糖含量高，含量达到30％以上。现有专利中一般采用苯酚硫酸方法检测，是对扇贝中所有类型的多糖进行提取，多糖含量一般仅为20％以下。
21.4、本发明提取的扇贝糖肽中多肽也具有鲜明的结构特征，多肽分子量为300
‑
2900da，氨基酸组成为天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸17种必须氨基酸和非必须氨基酸，其中，谷氨酸和甘氨酸最为丰富。
22.5、本发明提取的功能糖肽具有较好的抗氧化和免疫调节活性，将在食药、日化行业具有重要的应用潜力，为贝类资源的多元化开发提供了新思路，有利于推动贝类资源的绿色高值开发产业的快速发展。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
24.图1为本发明实施例1提取的扇贝裙边功能糖肽的氨基酸组成。
25.图2为本发明实施例2提取的扇贝裙边功能糖肽的抗氧化活性。
26.图3为本发明实施例3提取的扇贝裙边功能糖肽的免疫调节活性。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
28.本发明提供了一种从扇贝裙边中提取功能糖肽的方法，具体实施例如下：
29.本发明实施例以及对比例中添加的复合蛋白酶是一种商品化的酶(cas号：9014
‑
01
‑
1)，中性蛋白酶也是商品化的酶(cas号：9068
‑
59
‑
1)。
30.实施例1
31.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水40ml置于50℃的恒温水浴保持30min，后调节ph值至9，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解3h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解3h，酶解温度控制为45℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.9mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为21％。
32.实施例2
33.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.8mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为22％。
34.实施例3
35.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水100ml置于45℃的恒温水浴中保持40min，后调节ph值至7，而后先加入0.5g复合蛋白酶，加热酶解4h，后添加1.0g中性蛋白酶，继续加热酶解4h，酶解温度控制为40℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.8mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为21％。
36.对比例1
37.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至6，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.2mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为13％。
38.对比例2
39.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至10，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.0mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为14％。
40.对比例3
41.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为35℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.1mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为5.8％。
42.对比例4
43.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持
60min，后调节ph值至8，而后先加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.75g中性蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为55℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.4mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为6.2％。
44.对比例5
45.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后先加入0.75g中性蛋白酶，加热酶解2.5h，后添加0.25g复合蛋白酶，继续加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.0mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为14％。
46.对比例6
47.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后同时加入0.25g复合蛋白酶和0.75g中性蛋白酶，加热酶解5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
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二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.8mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为11％。
48.对比例7
49.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后加入0.25g复合蛋白酶，加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
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二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为3.1mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为12％。
50.对比例8
51.称取绞碎后的扇贝裙边10g，加入去离子水50ml置于35℃的恒温水浴中保持60min，后调节ph值至8，而后加入0.75g中性蛋白酶，加热酶解2.5h，酶解温度控制为50℃，后将酶解液置于100℃沸水浴中灭活15min，然后4℃下9000转离心10min，收集上清液，通过1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法测定水解液中糖胺聚糖浓度为2.9mg/ml，通过茚三酮法测定蛋白水解度为13％。
52.从上述对比例可以看出，对比例1和对比例2在ph超出7
‑
9时，不利于酶解反应，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例3和对比例4在酶解温度超出40
‑
50℃时，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例5先加入中性蛋白酶，后加入复合蛋白酶进行酶解，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3；对比例6将复合蛋白酶和中性蛋白酶同时加入进行酶解，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3。对比例7和对比例8只加入一种酶，得到的糖胺聚糖浓度以及蛋白水解度均不如本技术的实施例1
‑
3。同时，本发明还做了其他酶的水解试验，发现效果均不如本技术的实施例1
‑
3。
53.功能糖肽成分及性能测试：
54.1、成分测试：
55.将实施例1中水解上清液冷冻干燥即得扇贝裙边功能糖肽产物，所得扇贝裙边功
能糖肽氨基酸分析结果显示(参见图1)，功能糖肽含有天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸17种必须氨基酸和非必须氨基酸，其中谷氨酸和甘氨酸最为丰富。对扇贝裙边功能糖肽中糖胺聚糖经1,9
‑
二甲基亚甲基蓝光度法定量测定结果显示糖胺聚糖含量为33％，gpc分析多肽分子量为300
‑
2900da。
56.2、抗氧化活性测试
57.量取1ml不同质量浓度的实施例2提取的功能糖肽样品溶液，后依次加入1ml磷酸缓冲溶液(150mm，ph 7.4)，0.5ml edta
‑
fe
2+
溶液(220μm)，1ml番红花(0.23μm)和1ml h2o2(60μm)，混匀后，将反应混合物在37℃下加热30min，测定反应液在520nm下的吸光度值。羟自由基能够使番红花褪色，所以反应混合物增加的吸光度值表明该样品具有更强的羟自由基清除活性。样品的羟自由基清除能力按照以下公式计算：
[0058][0059]
a
空白
是空白对照的吸光度值(蒸馏水代替供试样品加样)，a
对照
是对照组的吸光度值(蒸馏水代替h2o2)。
[0060]
由图2可见，由扇贝裙边的功能糖肽对羟自由基具有很好的清除活性，且清除活性要好于阳性对照抗氧化剂vc，说明扇贝裙边功能糖肽具有强的抗氧化活性。
[0061]
3、免疫调节活性测试
[0062]
取对数生长期raw264.7小鼠腹腔巨噬细胞1*105个/ml单细胞悬液，每孔100ul接种于96孔板中，于培养箱中过夜培养后弃去培养基，加入用培养基配制的实施例3制得的功能糖肽样品，不同浓度下进行处理，并设空白对照。处理24h后取培养液于新的96孔板中，加入griess试剂，540nm下测其吸光度，然后和标准曲线比对，计算no浓度。no是一种半衰期极短的信使分子，在免疫应答和免疫调节中起重要作用。如图3所示的结果表明，扇贝功能糖肽能够显著促进raw264.7巨噬细胞产生no，具有很好的免疫调节活性。
[0063]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。