一种抗菌肽、含有其的组合物及应用

本发明涉及一种抗菌肽，其在治疗眼睑炎、睑腺炎、泪囊炎、结膜炎或手术期无菌化中应用。
背景技术：
：自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染中取得了较大的成就，但随着目前抗生素的持续使用，微生物抗药性已成为微生物感染控制的重大问题，以至于某些微生物已无法使用现有的抗生素来控制。如在临床药物治疗中，万古霉素抗性的葡萄球菌和肠球菌以及其他革兰氏阴性菌感染疾病目前已成为世界范围内的临床难题。抗菌肽是一类广泛存在于微生物及动植物体内的小分子多肽，其具有抗微生物活性，通常由12至50的氨基酸残基组成，分子量为2至7kda。在医学制剂上具有良好的应用前景，但现有天然抗菌肽在抗菌活性和溶血作用等方面还存在很多缺陷。天然抗菌肽制备成液体制剂后，活性降低速度快，在室温下活性稳定性不好，难以制备成稳定的液体制剂。技术实现要素：本发明之一提供了一种抗菌肽，其氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明之二提供了一种含有本发明之一所述的抗菌肽的组合物。在一个具体实施方式中，所述组合物还包括增稠剂、渗透压调节剂、ph缓冲剂、保护剂、表面活性剂和水。在一个具体实施方式中，所述增稠剂选自玻璃酸钠、聚乙烯醇和羧甲纤维素钠中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述渗透调节剂选自氯化钠、葡萄糖和甘露醇中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述ph缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂或枸橼酸盐缓冲剂。其中，所述磷酸盐缓冲剂可以由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾复配而成；所述枸橼酸盐缓冲剂可以由枸橼酸和枸橼酸钠复配而成。在一个具体实施方式中，所述保护剂选自甘氨酸、甘油和海藻糖中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆188和/或吐温80。在一个具体实施方式中，所述组合物的渗透压为226至350mmol/l；所述组合物的ph值为6.1至7.1。在一个具体实施方式中，所述抗菌肽在所述组合物中的含量为0.004至2.048mg/ml；所述增稠剂在所述组合物中的含量为0.1至1.1mg/ml；所述保护剂在所述组合物中的含量为2至12mg/ml；所述表面活性剂在所述组合物中的含量为0.5至5mg/ml；所述ph缓冲剂在所述组合物中含量为10mm或20mm。其中，所述ph缓冲剂在所述组合物中的含量以其中的酸根离子计。本发明之三提供了根据本发明之一所述的抗菌肽或本发明之二中任意一项所述的组合物在用于制备抗葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、细球菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属、克雷白氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、摩氏摩根菌、嗜血杆菌属、黄单细胞菌属、不动杆菌属和丙酸杆菌属中的至少一种微生物的药物中的应用。在一个具体实施方式中，所述应用为在用于制备抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌中的至少一种的药物中的应用。在一个具体实施方式中，所述应用为在用于制备治疗眼睑炎、睑腺炎、泪囊炎、结膜炎和手术期无菌化中的至少一种的药物中的应用。本发明的有益效果：本发明制备出的抗菌肽滴眼液具有很好的抗菌活性，溶血率低，可以用于临床上眼部细菌及真菌感染使用。具体实施方式以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。本发明的抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示，由吉尔化学合成，其所合成的抗菌肽的含量为98.6％。普通营养琼脂培养基和营养肉汤培养基均购买于北京索莱宝科技有限公司。pbs为ph7.2的磷酸盐缓冲液购买于北京索莱宝科技有限公司。10mm枸橼酸缓冲液配方：枸橼酸0.11g，枸橼酸钠2.79g，用无菌注射水定容至1000ml。20mm枸橼酸缓冲液配方：枸橼酸0.22g，枸橼酸钠5.58g，用无菌注射水定容至1000ml。枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501、金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102和铜绿假单胞菌cmcc(b)10104均购买于北京三药科技开发公司。实施例1抑菌活性检测在96孔板的每个孔中加入100μl营养肉汤培养基，然后在第一列的第一行中加入浓度为2048μg/ml的抗菌肽水溶液(即仅为抗菌肽和水的混合溶液)100μl，将该孔中的营养肉汤培养基和抗菌肽水溶液混合均匀，从第一列第一行吸取100μl加入第一列第二行，混合均匀后，再第一列第二行取100μl加入下一行，以此重复，直至第一列第八行吸取100μl弃去；然后将金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003稀释至104至105cfu/ml，按每孔100μl菌液接种于96孔板，此时抗菌肽在第一列的第一行的终浓度为1024μg/ml，在第一列的第八行终浓度为4μg/ml。将第二列、第三列依照第一列的方式配制作为第一列的重复列，第四、五、六列使用纯化水依照第一列方式配制为阴性对照；第七、八、九列依照第一列配制成终浓度为1μg/ml的氨苄西林作为阳性对照。将96孔板置于37℃条件培养过夜，使用酶标仪测量od620的值。以抗菌肽浓度为横坐标，以od620值为纵坐标做曲线，曲线拐点右侧第一个测量数据的点所对应的浓度即为最小抑菌浓度(mic)。对于枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102和铜绿假单胞菌cmcc(b)10104的最小抑菌浓度(mic)测定同对金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003的活性测定。抗菌肽对四种细菌的最小抑菌浓度(mic)的结果见表1。表1根据表1可知，抗菌肽在4μg/ml以上对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑菌作用。实施例2体外溶血率检测抗菌肽对动物红细胞溶血率检测使用的血样为脱纤维绵羊血。抗菌肽的溶血活率检测方法为：将红细胞用pbs缓冲液(ph7.2，购买于北京索莱宝科技有限公司)洗涤后离心(1500r、15min)弃去上清液，将体积比为92:8的0.9wt％的氯化钠水溶液和弃去上清后的红细胞液混合，配制成8％的红细胞悬液，取100μl的8％红细胞悬液于96孔板各个孔中，然后向第一至三列中加入抗菌肽水溶液(由抗菌肽和纯化水配制溶液)，从而使第一列1-8行检测孔中的抗菌肽的终浓度分别为：2048μg/ml；1024μg/ml；512μg/ml；256μg/ml；128μg/ml；64μg/ml；32μg/ml；16μg/ml，第二列，第三列为第一列的重复列；阴性对照用pbs缓冲液，阳性对照为0.1％(v/v)tritonx-100溶液。37℃下培养1h，1500rpm离心5分钟，将100μl上清液转移到新的96孔板中，使用酶标仪测量od414值。根据od414值计算出抗菌肽溶血率，结果见表2。抗菌肽溶血率计算公式：(检测孔od414－阴性对照孔od414)/(阳性对照孔od414－阴性对照孔od414)×100％表2抗菌肽溶血活血检测结果抗菌肽浓度μg/ml抗菌肽溶血率(％)160320.5642.01284.32566.95128.6102414.7204818.0抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。从表2可以看出抗菌肽的溶血率很低，特别是在2.048mg/ml以下未有大幅度的溶血现象发生。实施例3选择玻璃酸钠、甘油、甘露醇、甘氨酸、泊洛沙姆188和枸橼酸缓冲剂，设计2个水平7个因素(见表3)的正交试验，得到样品1至样品8共计8个配方的滴眼液，具体见表4，其中，滴眼液中抗菌肽浓度为1mg/ml。表32水平7因素正交设计表表4通过正交试验得到的抗菌肽滴眼液抗菌肽滴眼液的制备过程如下：(1)根据表2分别称取玻璃酸钠、甘氨酸、甘油和泊洛沙姆188。(2)将玻璃酸钠、甘氨酸、甘油和泊洛沙姆188加入到无菌注射用水中，并溶解至无明显可见白色包块，用0.22μm滤膜过滤其中的不溶物，得到第一混合液。(3)称取抗菌肽，并将抗菌肽加入到第一混合液中，混合均匀，得到第二混合液。(4)向第二混合液中加入称重后的甘露醇、枸橼酸和枸橼酸钠，补充余量的无菌注射用水至1000ml，混合均匀，得到第三混合液。其中，枸橼酸和枸橼酸钠的用量参见枸橼酸缓冲液配方中的用量。(5)将第三混合液用0.22μm滤膜过滤，分装包装，所得即为抗菌肽滴眼液。在25±2℃下考察抗菌肽滴眼液30天稳定性：外观、可见异物、渗透压、ph值和抗菌活性，并与0时结果进行比较，以变化量为评价指标，确定滴眼剂处方。外观检测方式为：在光照度3000至5000lx下目视检测，其应澄明。可见异物：依照《中国药典》2020版第四部0904可见异物检查法：将抗菌肽滴眼液用无色透明容器包装，在光照度1000至1500lx下目视检测。结果判定：抗菌肽滴眼液中不得检出金属屑、玻璃屑、长度超过2mm的纤维、最大粒径超过2mm的块状物，以及静置后轻轻旋转时肉眼可见的烟雾状微粒沉积物、无法计数的微粒群或摇不散的沉淀，以及较难计数的蛋白质絮状物等明显可见异物。渗透压检测方法：采用摩尔渗透压仪测量，同一抗菌肽滴眼液取三次测量平均值。ph值检测方法为：采用ph计直接测量法，同一样品取三次测量平均值。抗菌活性检测：依据中国人民共和国卫生行业标准ws/t650-2019抑菌率检测方法进行，具体如下：将金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003接种于普通营养琼脂培养基，培养24小时候后用pbs缓冲液洗下，并用pbs缓冲液稀释至约5.0×105cfu/ml至4.5×106cfu/ml菌悬液，得到试验用菌悬液。取无菌试管，先加入5.0ml抗菌肽滴眼液，并置于20℃±1℃水浴中5min后，再加入0.1ml试验用菌悬液，迅速混匀，得到测试样品，立即计时。待测试样品中的金黄色葡萄球菌与抗菌肽滴眼液相互作用10min，分别吸取1.0ml测试样品接种于2个平皿中，在后续培养的菌落因过于密集而无法进行菌落计数时，则以pbs缓冲液做10倍系列稀释，然后选取适宜稀释度进行同样的操作，即分别吸取1.0ml接种2个平皿中；然后向加有测试样品的平皿中倾注普通营养琼脂培养基，并混合均匀，然后于36℃±1℃培养48h时进行菌落计数，根据菌落计数得出测试样品中的菌含量。试验重复3次。同时用pbs缓冲液代替抗菌肽滴眼液，进行平行试验，作为阳性对照。经菌落计数，计算出阳性对照中的菌含量在1.0×104cfu/ml至9.0×104cfu/ml之间。取同批次不加入试验用菌悬液的pbs缓冲液和液体普通营养培养基分别作阴性对照。计算抑菌率计算抑菌率的公式如下：式中：x—抑菌率，％；a0—阳性对照的菌含量，单位为cfu/ml；a1—测试样品的菌含量，单位为cfu/ml；活性级差计算方式为：以上检测项目获得的结果见表5。表5抗菌肽滴眼液的稳定性试验结果根据表5可知，在样品1至8中，样品3、8渗透压过高，予以剔除，样品7渗透压过低，予以剔除，样品1在25±2℃，30天条件下，观察其外观、澄明度、ph、渗透压均无明显变化，抑菌率与0小时相比变化小，说明稳定性越好，样品1、2、4、5、6合格，其中样品1为最优，即枸橼酸根的浓度为10mm的枸橼酸盐缓冲剂，ph6.4，10mg/ml甘油，10mg/ml甘露醇，2mg/ml甘氨酸，0.1mg/ml玻璃酸钠，1mg/ml泊洛沙姆188。实施例4抗菌肽滴眼液的杀菌活性检测选用的抗菌肽滴眼液配方：1mg/ml抗菌肽，10mm枸橼酸盐缓冲液，ph6.0，10mg/ml甘油，10mg/ml甘露醇，2mg/ml甘氨酸，0.1mg/ml玻璃酸钠，1mg/ml泊洛沙姆188。采用琼脂板扩散法对抗菌肽滴眼液杀菌活性进行检测，以评价抗菌肽滴眼液的杀菌活性。以左氧氟沙星滴眼液(包含24.4mg/5ml的左氧氟沙星)作为阳性对照，以纯化水作为阴性对照。抗菌肽的杀菌活性检测方法具体为：先采用常规菌种复苏的方法将枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501、金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102和铜绿假单胞菌cmcc(b)10104复苏，并接种于普通营养琼脂培养基斜面上，于37℃培养过夜；然后挑菌于液体营养肉汤培养基中，37℃培养过夜，得到发酵菌液；将发酵菌液稀释至菌浓度为1×105至1×106cfu/ml，以100μl菌液涂布于15ml普通营养琼脂固体培养基平板上，然后向每个平板放置三个经打孔的无菌滤纸片，并向每个平板中的滤纸片上依次滴加10μl抗菌肽滴眼液、10μl左氧氟沙星滴眼液和10μl纯化水，先于4℃条件下静置3h，再将平板置于37℃培养8h，测量抑菌圈大小，判定杀菌能力。设置三个重复。结果见表6。表6注：“+”代表抑菌圈5mm，“++”为抑菌圈10mm“+++”为抑菌圈15mm或大于15mm，*为未产生抑菌圈。从表6可看出来，抗菌肽滴眼液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌的抗菌能力与化学药剂左氧氟沙星滴眼液水平相当，而对枯草芽孢杆菌的抗菌能力优于左氧氟沙星滴眼液。实施例5抗菌肽滴眼液的配方为1g抗菌肽、1.6g磷酸二氢钾、0.4g磷酸氢二钾、10g甘油、10g甘露醇、2g甘氨酸、0.1g玻璃酸钠和1g泊洛沙姆188，用注射用水补至1000ml。在25±2℃下考察抗菌肽滴眼液30天稳定性：外观、可见异物、ph值、渗透压和抗菌活性，并与0时结果进行比较。结果见表7。其中，制备过程和稳定性考察同实施例3。实施例6抗菌肽滴眼液的配方为1g抗菌肽、2.79g枸橼酸钠、0.11g枸橼酸、10g甘油、10g甘露醇、2g甘氨酸、0.1g玻璃酸钠和1g泊洛沙姆188，用注射用水补至1000ml。在25±2℃下考察抗菌肽滴眼液30天稳定性：外观、可见异物、ph值、渗透压和抗菌活性，并与0时结果进行比较。结果见表7。其中，制备过程和稳定性考察同实施例3。依据《中国药典》2020版四部0633方法测定抗菌肽滴眼液的动力黏度，重复3次，计算3次的平均值，结果见表8。实施例7抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将玻璃酸钠替换为聚乙烯醇。稳定性考察见表7。实施例8抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将玻璃酸钠替换为羧甲纤维素钠。稳定性考察见表7。实施例9抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将甘露醇替换为葡萄糖。稳定性考察见表7。实施例10抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将甘露醇替换为氯化钠。稳定性考察见表7。实施例11抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将2g甘氨酸替换为5g海藻糖。即抗菌肽滴眼液的配方为1g抗菌肽、2.79g枸橼酸钠、0.11g枸橼酸、10甘油、10g甘露醇、5g海藻糖、0.1g玻璃酸钠和1g泊洛沙姆188，用注射用水补至1000ml。稳定性考察见表7。实施例12抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，将泊洛沙姆188替换为吐温80。稳定性考察见表7。实施例13抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，不含甘油。稳定性考察见表7。实施例14抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，甘油的用量由10g调整为2g。稳定性考察见表7。实施例15抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，甘油的用量由10g调整为4g。稳定性考察见表57。实施例16抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，甘油的用量由10g调整为6g。稳定性考察见表7。实施例17抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，甘油的用量由10g调整为8g。稳定性考察见表7。实施例18抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，玻璃酸钠的用量由0.1g调整为0.3g。稳定性考察见表7。动力黏度结果见表8。实施例19抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，玻璃酸钠的用量由0.1g调整为0.5g。稳定性考察见表7。动力黏度结果见表8。实施例20抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，玻璃酸钠的用量由0.1g调整为0.7g。稳定性考察见表7。动力黏度结果见表8。实施例21抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，玻璃酸钠的用量由0.1g调整为0.9g。稳定性考察见表7。动力黏度结果见表8。实施例22抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，玻璃酸钠的用量由0.1g调整为1.1g。稳定性考察见表7。动力黏度结果见表8。实施例23抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为0.5g。稳定性考察见表7。实施例24抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为1.5g。稳定性考察见表7。实施例25抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为2.0g。稳定性考察见表7。实施例26抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为2.5g。稳定性考察见表7。实施例27抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为3.0g。稳定性考察见表7。实施例28抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为3.5g。稳定性考察见表7。实施例29抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为4.0g。稳定性考察见表7。实施例30抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为4.5g。稳定性考察见表7。实施例31抗菌肽滴眼液与实施例6的不同之处在于，泊洛沙姆188的用量由1g调整为5.0g。稳定性考察见表7。表7表8实施例动力黏度(cpa.s)实施例64.0实施例188.0实施例1915.0实施例2020.2实施例2125.2实施例2235.5根据表5和表7，依据实施例3中样品1、2、4、5、6和实施例5、实施例6-31的结果可知，组合物的ph值为6.1-7.1，ph缓冲剂优选浓度为10mm或20mm，ph缓冲剂为枸橼酸缓冲剂或磷酸盐缓冲剂是适宜的。其中，10mm的枸橼酸缓冲剂为最优。根据表7，依据实施例6、实施例9、实施例10的结果可知，组合物的渗透压调节范围在226至350mmol/l，渗透压调节剂为甘露醇、葡萄糖或氯化钠是适宜的，其中，甘露醇为最优。根据表7，依据实施例6、实施例11、实施例13至17的结果可知，组合物保护剂的浓度在2-12mg/ml，保护剂剂的种类为甘油、甘氨酸或海藻糖是适宜的，其中保护剂浓度为12mg/ml(甘油10mg/ml，甘氨酸2mg/ml)为最优。根据表7，依据实施例6、12实施例21至31的结果可知，组合物表面活性剂浓度为0.5-5mg/ml，表面活性剂的种类为吐温-80或泊洛沙姆188是适宜的，其中，含量为0.5mg/ml的泊洛沙姆188为最优。根据表7和表8，依据实施6、实施例7、实施例8、实施例18-22的结果可知，组合物增稠剂的浓度为0.1-1.1mg/ml，增稠剂的种类为玻璃酸钠、聚乙烯醇或羧甲基纤维素钠是适宜的。其中，含量为0.1mg/ml的玻璃酸钠为最优。序列表<110>温州大学<120>一种抗菌肽、含有其的组合物及应用<130>lha2160253<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cysalatrplyssergluservalcysvalthrglyleuleuglnthr151015ilethrcysasncyslys20当前第1页12