LDH、表达LDH的重组质粒、表达LDH的重组益生菌及应用

ldh、表达ldh的重组质粒、表达ldh的重组益生菌及应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种ldh、表达ldh的重组质粒、表达ldh的重组益生菌及用于制备治疗和/或预防消化性溃疡、炎症性肠病和心脑血管疾病药物的应用。
技术背景
2.消化性溃疡主要指发生于胃和十二指肠的慢性溃疡，是一种多发病、常见病，又称胃、十二指肠溃疡。溃疡的形成有多种因素，例如胃酸分泌过多、幽门螺杆菌感染和胃粘膜保护作用减弱等因素是引起消化性溃疡的主要环节。胃排空延缓和胆汁反流、胃肠肽的作用、遗传因素、药物因素、环境因素和精神因素等，都和消化性溃疡的发生有关。上腹部疼痛为本病的主要症状，多位于右上腹部，也可出现在左上腹部或胸骨、剑突后。常呈隐痛、钝痛、胀痛、烧灼样痛，以出血、穿孔等并发症作为首发症状。炎症性肠病为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病，临床表现主要有体重减少、里急后重、腹泻、腹痛、甚至血便。炎症性肠病主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，溃疡性结肠炎病变局限于大肠粘膜及粘膜下层，疾病通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延；克罗恩病可累及全消化道，为非连续性全层炎症，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周。目前市场上治疗消化性溃疡和炎症性肠病的药物，主要以缓解症状为主，无法治愈，属于对症治疗。长期使用可诱发多种不良反应，严重者可引发癌变，且停药易复发问题，因此，仍然需要开发用于治疗消化性溃疡和炎症性肠病的新药物，更好的为患者服务。
3.脑血管疾病(cerebrovascular disease)，泛指脑部血管的各种疾病，包括动脉粥样硬化、血栓形成、狭窄、闭塞、脑动脉炎、脑动脉损伤、脑动脉瘤、颅内血管畸形、脑动静脉瘘等，其共同特点是引起脑组织的缺血或出血性意外。典型的脑血管疾病主要有脑血栓、脑缺血、脑梗塞等。脑血栓是在脑动脉粥样硬化和斑块基础上，在血流缓慢和血压偏低的条件下，血液的有效成分附着在动脉的内膜形成血栓，成为脑血栓，临床上以偏瘫为主要临床表现。脑卒中是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。血栓可引起脑梗的形成，脑梗又称为缺血性脑卒中；脑血栓、脑梗塞最终均可归结于卒中。而卒中是严重危害中国国民健康的重大慢性非传染性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率和高经济负担五大特点。随着人口老龄化的加剧，脑血管病危险因素流行趋势更加明显，导致脑血管病的发病人数持续增加。目前，临床上面对这一危害严重的疾病，尚无有效的治疗方法。因此，如何开发出一种能够显著治疗缺血性脑卒中的新药物是目前亟待解决的问题。
4.如果要治愈此类疾病，有必要揭示消化性溃疡、炎症性肠病和脑血管疾病的关键病理机制，从而设计合理高效的治疗药物，完全恢复胃肠道和神经元功能。我们认为众多疾病的发生根本机制都是由细胞死亡引起的。据文献报道，胃上皮细胞死亡是诱发胃溃疡形成的关键病理(modulation of tumor necrosis factor
‑
related apoptosis
‑
inducing ligand(trail)
‑
mediated apoptosis by helicobacter pylori inimmune pathogenesis of gastric mucosal damage)；肠上皮细胞死亡会导致肠通透性增加和肠屏障功能障碍，
导致多种急性和慢性肠道疾病，例如炎症性肠病(cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases)；在缺血缺氧病理条件下，自由基、钙离子增多可激活神经元凋亡，从而导致脑功能的损害，引发脑血管疾病的发生。
5.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)是一类nad依赖性激酶。据文献报道，ldh亚型水平升高在恶性肿瘤中比正常细胞更常见。ldh水平升高可通过调节肿瘤代谢和微环境促进肿瘤发展，是癌症患者预后不良的指标。对实体瘤ldh水平预后价值荟萃分析表明，ldh水平升高与黑色素瘤、胃癌、肺癌、前列腺癌和肾癌的生存率低相关。
6.针对上述问题，本发明首先发现，乳酸脱氢酶能够治疗胃肠道疾病、心脑血管疾病和代谢性疾病；其次，本发明构建了表达乳酸脱氢酶的重组质粒及重组益生菌，相较于益生菌原菌，本发明所述重组益生菌能够实现口服给药的同时，起到治疗胃肠道疾病、心脑血管疾病和代谢性疾病，且具有更显著的治疗效果。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种乳酸脱氢酶用于制备治疗或预防消化系统疾病，和/或心脑血管疾病药物中的用途。所述乳酸脱氢酶可以为乳酸脱氢酶，或重组乳酸脱氢酶，或表达乳酸脱氢酶的重组质粒，或表达乳酸脱氢酶的重组菌株。
8.具体包括以下内容：
9.第一方面，本发明提供了一种乳酸脱氢酶在制备预防或治疗消化系统疾病，和/或心脑血管疾病药物中的应用。
10.优选地，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.优选地，所述消化系统疾病包括消化性溃疡、炎症性肠病；所述心脑血管疾病包括心力衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、心肌炎、高原型缺氧、脑水肿、脑缺血、脑血栓、脑梗死、脑卒中。
12.优选地，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病；所述消化性溃疡包括胃溃疡、十二指肠溃疡、球后溃疡、幽门管溃疡、复合溃疡和对吻溃疡；所述脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。
13.优选地，所述疾病为胃溃疡、溃疡性结肠炎、缺血性脑卒中。
14.优选地，所述乳酸脱氢酶加入药学上可接受的载体制成片剂、注射剂、混悬剂、胶囊剂、颗粒剂中的任一种。
15.第二方面，本发明提供了一种表达乳酸脱氢酶的重组质粒，所述重组质粒是将表达乳酸脱氢酶的重组质粒是将编码乳酸脱氢酶的基因导入载体获得的。
16.优选地，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
17.优选地，所述编码乳酸脱氢酶的基因序列如seq id no.2所示。
18.优选地，所述载体包括但不局限于pet
‑
28a、pezz18、pta1529、piniii
‑
ompa、pub110、pe194、pucx05
‑
bgab、pht304、pmk3、ppic9、ppic9k、phil
‑
s1、ppiczα、pyam75p、pnz8149
‑
usp45。
19.优选地，所述载体为pet
‑
28a，所述重组质粒命名为pet
‑
28a
‑
ldh，所述的重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh的基因序列如seq id no.3所示。
20.第三方面，本发明提供了一种上述第二方面所述的表达乳酸脱氢酶的重组质粒在
制备预防或治疗消化系统疾病，和/或心脑血管疾病药物中的应用。
21.优选地，所述消化系统疾病包括消化性溃疡、炎症性肠病；所述心脑血管疾病包括心力衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、心肌炎、高原型缺氧、脑水肿、脑缺血、脑血栓、脑梗死、脑卒中。
22.优选地，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病；所述消化性溃疡包括胃溃疡、十二指肠溃疡、球后溃疡、幽门管溃疡、复合溃疡和对吻溃疡；所述脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。
23.优选地，所述疾病为胃溃疡、溃疡性结肠炎、缺血性脑卒中。
24.优选地，所述表达乳酸脱氢酶的重组质粒加入药学上可接受的载体制成片剂、注射剂、混悬剂、胶囊剂、颗粒剂中的任一种。
25.第四方面，本发明提供了一种表达乳酸脱氢酶的重组益生菌，所述表达乳酸脱氢酶的重组菌株是将上述第二方面所述的表达乳酸脱氢酶的重组质粒转化益生菌获得，或将编码ldh蛋白的基因整合至益生菌获得。
26.优选地，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
27.优选地，所述编码乳酸脱氢酶的基因序列如seq id no.2所示。
28.优选地，所述益生菌包括但不局限于大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917、益生芽孢杆菌、乳球菌、丁酸杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母。
29.优选地，所述益生菌为大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917。
30.第五方面，本发明提供了一种上述第四方面所述的表达乳酸脱氢酶的重组益生菌在制备预防或治疗消化系统疾病，和/或心脑血管疾病药物中的应用。
31.优选地，所述消化系统疾病包括消化性溃疡、炎症性肠病；所述心脑血管疾病包括心力衰竭、心肌缺血、心肌梗塞、心肌炎、高原型缺氧、脑水肿、脑缺血、脑血栓、脑梗死、脑卒中。
32.优选地，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病；所述消化性溃疡包括胃溃疡、十二指肠溃疡、球后溃疡、幽门管溃疡、复合溃疡和对吻溃疡；所述脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中。
33.优选地，所述疾病为胃溃疡、溃疡性结肠炎、缺血性脑卒中。
34.优选地，所述药物为口服药物。
35.优选地，所述表达乳酸脱氢酶的重组益生菌加入药学上可接受的载体制成口服制剂，所述口服制剂包括口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、混悬剂、乳剂、丸剂、散剂中的任一种。
36.优选地，所述口服制剂为表达乳酸脱氢酶的重组益生菌的活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊。
37.第六方面，本发明提供了一种上述第六方面所述表达乳酸脱氢酶的重组益生菌的制备方法，所述方法为：用上述第二方面所述的重组质粒转化益生菌，培养，筛选获得重组益生菌。
38.优选地，所述方法为：用上述第二方面所述的重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917，挑取单克隆，在含有卡那霉素的培养基中培养，筛选
获得表达乳酸脱氢酶的重组益生菌。
39.本发明的有益效果是：
40.(1)首先，本发明通过构建ldh基因重组质粒并在益生菌中高效表达制备的重组益生菌能够显著降低胃溃疡的溃疡指数和溃疡面积，同时改善胃粘膜的损伤程度，相较于益生菌原菌，表达ldh的重组益生菌具有更显著的治疗效果。表明表达ldh的重组益生菌能够作为治疗或者缓解胃溃疡的药物，为临床治疗胃溃疡提供新的选择；其次，本发明通过试验直接证明了表达ldh的重组益生菌在胃溃疡方面的有效性，但不局限于胃溃疡，表达ldh的重组益生菌对其他消化性溃疡具有治疗作用；
41.(2)首先，本发明通过构建ldh基因重组质粒并在益生菌中高效表达制备的重组益生菌能够显著的减少结肠炎小鼠的体重下降百分率、降低疾病活动改善、减轻结肠组织病理损伤、改善结肠缩短情况，相较于益生菌原菌，表达ldh的重组益生菌具有更显著的治疗效果。表明表达ldh的重组益生菌能够作为治疗或者缓解溃疡性结肠炎的药物，为临床治疗溃疡性结肠炎提供新的选择；其次，本发明通过试验直接证明了表达ldh的重组益生菌在溃疡性结肠炎方面的有效性，但不局限于溃疡性结肠炎，表达ldh的重组益生菌对其他炎症性肠病具有治疗作用；
42.(3)首先，本发明通过构建ldh基因重组质粒并在益生菌中高效表达制备的重组益生菌能够显著减少脑卒中大鼠的神经功能缺损评分和脑梗死体积，相较于益生菌原菌，表达ldh的重组益生菌具有更显著的治疗效果。表明表达ldh的重组益生菌能够作为治疗或者缓解缺血性脑卒中的药物，为临床治疗缺血性脑卒中提供新的选择；其次，本发明通过试验直接证明了表达ldh的重组益生菌在缺血性脑卒中方面的有效性，但不局限于缺血性脑卒中，表达ldh的重组益生菌对其他缺血缺氧相关的心脑血管疾病具有治疗作用；
43.(4)本发明首先将表达ldh的基因导入载体pet
‑
28a构建了表达ldh的重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh，然后将其转化益生菌大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917获得了表达ldh的重组益生菌，所述重组益生菌能够显著降低胃溃疡、溃疡性结肠炎及缺血性脑卒中的发病程度，未观察到不良反应和副作用；但本发明并不局限于载体pet
‑
28a，也不局限于大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917，只要根据本领域常规技术手段，构建表达ldh的重组益生菌均能实现相同的效果；
44.(5)本发明改变了蛋白药物常规的用药方式(肌注或静注)，以口服给药的方式将蛋白药物应用于心脑血管疾病和代谢性疾病的治疗，解决了本领域长期未解决的技术问题，取得了意想不到的技术效果。
附图说明
45.图1表达ldh的重组质粒转化dh5α菌株pcr反应结果显示图；
46.图2表达ldh的重组质粒转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917 pcr反应结果显示图；
47.图3表达ldh的重组益生菌对胃溃疡小鼠胃粘膜损伤平面图；
48.图4表达ldh的重组益生菌对胃溃疡小鼠溃疡指数、溃疡面积和溃疡抑制率的影响结果；
49.图5表达ldh的重组益生菌对溃疡性结肠炎小鼠结肠损伤示意图；
50.图6表达ldh的重组益生菌对溃疡性结肠炎dai评分和结肠长度的影响结果；
51.图7表达ldh的重组益生菌对mcao大鼠ttc染色结果；
52.图8表达ldh的重组益生菌对mcao大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积结果。
具体实施方式
53.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法若无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买。
54.以下列实施例中的大肠杆菌菌种(escherichia coli)dh5α购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌菌种大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917购自德国(商标名为mutaflor)；重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp购自淼灵质粒平台；无水乙醇，天津大茂化学试剂公司；西咪替丁片(cimetidine，cim)购自上海信谊天平药业有限公司；β
‑
乳糖(β
‑
lactose，含70％的β
‑
乳糖和30％的α
‑
乳糖)购自麦克林生物科技有限公司；柳氮磺吡啶肠溶片(salazosulfapyridine，sasp)购自上海信谊天平药业有限公司；葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，dss)，mw:40000，购自阿拉丁生物科技有限公司；丁苯酞软胶囊(恩必普，nbp)，购自石药集团恩必普药业有限公司；2，3，5
‑
氯化三苯基四氮唑(ttc)，购自solarbio公司；所用pcr引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，分别引入相应的酶切位点；所述细菌质粒dna提取试剂盒购自axygen公司；所述primestar hs(premix，2x)、t4 dna ligase购自takara公司；所述dna内切酶hindⅲ和ecori购自北京neb公司；
55.所述lb(luria
‑
bertani)液体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl；所述lb固体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl、2％琼脂。
56.本发明以下实施例2中的西咪替丁，也称甲氰咪胍，是一种组胺h2受体阻抗剂，主要用于抑制胃酸的分泌，能明显抑制基础和夜间胃酸分泌，也能抑制由组胺、分肽胃泌素、胰岛素和食物等刺激引起的胃酸分泌，并使其酸度降低，对因化学刺激引起的腐蚀性胃炎有预防和保护作用，对应激性胃溃疡和上消化道出血也有明显疗效。本发明实施例2将西咪替丁作为阳性药物使用。
57.本发明以下实施例3使用葡聚糖硫酸钠用于小鼠结肠炎的造模。
58.本发明以下实施例3中，柳氮磺吡啶肠溶片的适应症为(1)溃疡性结肠炎治疗轻至中度的溃疡性结肠炎；在重度溃疡性结肠炎中可作为辅助疗法。亦可用于溃疡性结肠炎缓解期的维持治疗；(2)crohn’s病用于治疗活动期的克隆病，特别是那些累及结肠的患者；(3)类风湿性关节炎对水杨酸类或其他非甾体抗炎药疗效不显著的类风湿性关节炎和幼年类风湿性关节炎(多关节型)，本发明实施例3中将柳氮磺吡啶肠溶片作为阳性药物使用。
59.本发明以下实施例4中，mcao是指middle cerebral artery occlusion，大脑中动脉缺血；丁苯酞主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。本发明实施例四将丁苯酞作为阳性药使用。
60.以下实施例所述的km小鼠是指昆明小鼠；实验动物km小鼠和sd大鼠均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，实验前未使用任何药物，许可证号为scxk(甘)
‑
2020
‑
0002，适
应性饲养一周，给予动物饮食并自由饮用蒸馏水，然后分组进行实验。
61.实施例1表达ldh的重组质粒和重组益生菌的制备
62.1.引物合成
63.根据ldh的核苷酸序列(seq id no.2所示)，与pet
‑
28a质粒图谱比较，设计特异引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点hindⅲ和ecori，具体信息见表
‑
1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
64.用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10μmol/l。
65.表1引物信息及合成
[0066][0067]
2.重组质粒的构建
[0068]
pet
‑
28a
‑
ldh质粒由金唯智生物科技有限公司合成。
[0069]
3.用重组质粒转化escherichia coli dh5α菌
[0070]
从
‑
80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，在冰盒上放置10
‑
20分钟，使其融化；取50μl感受态细胞加入5μl质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置25min；42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min，加0.5ml室温的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃、200rpm振摇培养1h，取200μl上述菌液涂布于含有15μg/ml卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养12h。
[0071]
4.热激转化成功菌落验证
[0072]
挑取单克隆，在含有15μg/ml的卡那霉素的液体培养基中扩增培养，进行pcr验证、酶切验证。验证结果如图1所示。
[0073]
5.提取重组质粒dna
[0074]
将成功转入重组质粒的菌株转接至lb培养基中放大培养，培养条件为：转速200rpm，温度为37℃。用axygen公司的质粒小提试剂盒提取质粒。
[0075]
6.大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917化学感受态细胞
[0076]
从
‑
80℃冰箱中取出保种的大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917(mutaflor)菌株，用灭菌的枪头挑取少量保菌液，在lb固体培养基上划线处理，并于37℃培养箱中过夜培养：从lb固体培养基上挑取湿润，圆滑的单菌落，放入lb培养液中，37℃培养12h；当菌液od600值为0.3
‑
0.5时，将菌液转移到冰上预冷的已灭菌离心管中，冰浴30min，在4℃条件下，1520g离心10min；弃去上清，用500μl预冷的cacl2溶液(已过滤除菌)轻轻悬浮细胞，4℃条件下，1520g离心10min；重复上一步骤一次；弃去上清，加入500μl预冷的cacl2溶液(已过滤除菌)，小心悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液；制备好的感受态细胞悬液直接用于转化实验。未用完的感受态细胞加入等体积的已灭菌的20％甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中(每管100μl)，置于
‑
80℃冰箱保存。
[0077]
7.将重组质粒转入大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株
[0078]
从
‑
80℃冰箱中取出大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917化学感受态细胞，在冰盒上放置10
‑
20分钟，使其融化。从中取出50μl感受态细胞加入5μl质粒，用手指轻
轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置25min；在42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min，加0.5ml室温的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃，200rpm振摇培养1h，取200μl上述菌液涂布于含有15μg/ml卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养12h。
[0079]
8.热激转化成功菌落验证
[0080]
挑取单克隆，在含有15μg/ml的卡那霉素的液体培养基中扩增培养，之后进行pcr验证、酶切验证，验证正确得到重组菌株。实验结果如图2所示。
[0081]
3.实验结果
[0082]
(1)重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh热激转化escherichia coli dh5α菌株结果：
[0083]
以ldh基因序列为模板，进行pcr扩增，利用克隆技术获得重组质粒ldh基因。上游引物序列为5
’‑
ggaattcatgaaaataggtatcgtaggac
‑3’
，下游引物序列为5
’‑
cccaagcttttaaccgctggtgttctggtg
‑3’
；并引入hindiii和ecori酶切位点，扩增产物胶回收纯化后与pet
‑
28a载体连接，获得重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh。将重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh用热激法转化入escherichia coli dh5α菌株中，挑取单克隆进行pcr验证、酶切验证，实验结果如图1所示，目标条带分子量大小为960bp，验证结果正确(图中箭头所指位置为目标条带)。
[0084]
(2)重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh热激转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株结果：
[0085]
以ldh基因序列为模板，进行pcr扩增，利用克隆技术获得重组质粒ldh基因。上游引物序列为5
’‑
ggaattcatgaaaataggtatcgtaggac
‑3’
，下游引物序列为5
’‑
cccaagcttttaaccgctggtgttctggtg
‑3’
；并引入hindiii和ecori酶切位点，扩增产物胶回收纯化后与pet
‑
28a载体连接，获得重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh。将重组质粒质粒pet
‑
28a
‑
ldh用热激法转化入大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株中，挑取单克隆进行pcr验证、酶切验证，实验结果如图2所示，目标条带分子量大小为960bp，验证结果正确(图中箭头所指位置为目标条带)。
[0086]
需要说明的是，本发明所述方法并不是对表达ldh重组益生菌构建的唯一限定方法，通过常规的技术手段，构建任一表达ldh的重组质粒，并通过常规的转化操作，将所述的表达ldh的重组质粒转化大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917菌株或其他益生菌，均能够筛选获得表达ldh的重组益生菌。
[0087]
实施例2表达ldh的重组益生菌对胃溃疡小鼠的治疗效果
[0088]
1.km小鼠酒精性胃溃疡模型的制备
[0089]
48只km雄性小鼠(20
‑
25g)，饲养于兰州大学实验动物房，小鼠适应性饲养一周后，随机分为6组，每组8只，分组情况及给药量如所示：
[0090]
空白对照组：灌胃给予0.25ml 11.1mg/ml(m/v)的β
‑
乳糖溶液；
[0091]
乙醇对照组：灌胃给予0.25ml的无水乙醇；
[0092]
阳性对照组：灌胃西咪替丁80mg/kg/day；
[0093]
e.coli nissle 1917组：灌胃0.25ml的大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌；
[0094]
pet
‑
28a
‑
egfp组：灌胃0.25ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0095]
pet
‑
28a
‑
ldh组：灌胃0.25ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0096]
上述各组小鼠预给药5天(细菌数量为1
×
109cfu，均由11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液进行配制)，造模前2h再给药一次，2h后灌胃无水乙醇，刺激2h后结束实验，分离血清和胃组织测定各项指标。
[0097]
2.溃疡面积、溃疡指数与抑制率
[0098]
将胃取出，沿胃大弯剪开，冲洗干净内容物，观察胃粘膜溃疡情况，用直尺测量溃疡的横径与纵径，两者乘积为溃疡面积(mm2)，如公式1所示；然后计算整个胃组织的溃疡面积，从而计算溃疡抑制率(％)，见公式2。同时以各组鼠溃疡点数之和的均值作为溃疡指数(愈合记0分、表浅性黏膜糜烂记1分、深陷性溃疡或透壁性坏死记2分、穿孔或穿透性溃疡记3分)。
[0099]
溃疡面积(mm2)＝溃疡最大长径*垂直于最大长径的最大宽径
ꢀꢀ
(1)
[0100][0101]
3.数据处理
[0102]
实验数据采用spss23.0软件进行统计学分析，数据以(x
±
s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)和lsd
‑
t法进行两两比较。p<0.05认为具有统计学意义。
[0103]
4.胃溃疡小鼠胃组织形态、溃疡指数、溃疡面积及溃疡抑制率
[0104]
上述各组小鼠处死后，迅速取其胃组织，观察其形态改变及溃疡损伤情况，并对其溃疡面积和溃疡指数进行统计分析，实验结果如图3和图4所示。由图3可知，空白对照组小鼠胃组织宏观形态正常，未出现明显出血性病变，而乙醇模型组小鼠胃组织出血性病变明显，溃疡最为严重，表明乙醇胃溃疡模型制备成功；与乙醇模型组相比，大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌的溃疡抑制率为51.91％，西咪替丁的溃疡抑制率为46.67％，本发明所述的表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌的溃疡抑制率高达63.19％，显著高于大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌和西咪替丁对照组的溃疡抑制率；而阴性对照pet
‑
28a
‑
egfp治疗组未表现出明显的溃疡保护作用。上述溃疡面积、溃疡指数与抑制率，及胃组织形态学测定结果表明，表达ldh的重组益生菌能改善胃粘膜的损伤程度，减少溃疡面积，对胃溃疡具有更强的预防和保护作用，且疗效显著强于临床用药西咪替丁的疗效，能够用于预防或治疗胃溃疡，为胃溃疡的治疗提供新策略。
[0105]
消化性溃疡是临床常见的消化性疾病之一，具有发病率高、复发率高的特点。消化性溃疡多发生于人体的胃和十二指肠溃疡，因其病源于胃酸的消化作用而得名。由于各种原因，胃酸在消化食物的同时侵蚀了胃壁和肠壁从而引发疾病。消化性溃疡由于发生的部位不同，可以分为胃溃疡、十二指肠溃疡和复合型溃疡，其发生由于胃和十二指肠侵袭因子和防御因子(胃粘膜屏障、前列腺素等)之间的失衡有关。另外每天胃肠道会产生大量氧自由基，目前研究显示，自由基产生过多或者清除不足时，氧自由基会损伤胃肠黏膜、造成细胞和组织损害，形成炎症和溃疡，总之胃溃疡和消化系统疾病在病因学上有着相似的病因基础，是典型的消化系统疾病，胃粘膜屏障是疾病发生过程的保护因素。因此，可以推论出，本发明所述的表达ldh的重组益生菌对其他消化系统疾病，尤其是消化性溃疡也具有治疗
效果。
[0106]
实施例3表达ldh的重组益生菌对溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果
[0107]
1.实验方法
[0108]
将8周龄雄性km小鼠随机分为6组，每组8只，分组和给药剂量如下：
[0109]
正常对照组(control，口服给予等体积11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液)；
[0110]
dss模型对照组(dss，口服给予等体积11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液)；
[0111]
阳性药组(sasp，口服给予柳氮磺吡啶80mg/kg/day)；
[0112]
e.coli nissle 1917组：灌胃0.25ml的大肠埃希菌(escherichia coli)nissle
[0113]
1917原菌；
[0114]
pet
‑
28a
‑
egfp组：灌胃0.25ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0115]
pet
‑
28a
‑
ldh组：灌胃0.25ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0116]
上述给药组均由11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液进行配制。
[0117]
溃疡性结肠炎模型的制备：配制4％的dss蒸馏水溶液，dss模型对照组小鼠自由饮用dss水溶液造模、dss+各细菌治疗组小鼠自由饮用dss水溶液造模同时给予0.25ml的菌液，细菌密度为1
×
109cfu；dss+sasp组小鼠自由饮用dss水溶液造模同时给予80mg/kg/day的sasp；空白对照组小鼠自由饮用蒸馏水，所有小鼠保持常规饲料喂养，出现血性腹泻或血性便时将含dss的水溶液换成常规饮用水，继续给予药物治疗，第八天末次给药2h后，分离血清及结肠组织备用。
[0118]
2.溃疡性结肠炎检测指标
[0119]
疾病活动指数(dai)评分：参照文献方法，对各组小鼠体重质量下降率、粪便性状及大便隐血情况进行评分。
[0120]
dai＝(体重质量下降+粪便性状+大便隐血)/3
[0121]
结肠损伤评价：各组小鼠处死后，分离小鼠结肠，从回肠和结肠结合处剪断回肠，再在结肠近肛门处剪断，分离结肠外的筋膜，使结肠完全伸展开，用直尺测量小鼠结肠自回结肠处至肛门的长度，并拍照记录。
[0122]
3.数据处理
[0123]
实验数据采用spss23.0软件进行统计学分析，数据以(x
±
s)表示，组间比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)和lsd
‑
t法进行两两比较。p<0.05认为具有统计学意义。
[0124]
4.结果分析
[0125]
4.1重组益生菌对结肠炎小鼠结肠形态及结肠长度的影响
[0126]
上述各组小鼠处死后，迅速摘除其结肠组织，观察其形态改变，同时测量其长度，对各组数据进行统计分析，实验结果如图5、图6中b所示。与空白对照组相比，dss模型组结肠长度显著的缩短(
###
p<0.001)，表明dss模型构建成功；与dss模型对照组相比，大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌治疗组和阴性对照pet
‑
28a
‑
egfp治疗组虽然能够改善结肠水肿及缩短情况，但改善趋势并无显著性差异；与原菌大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917治疗组相比，表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌治疗组能显著改善结肠水肿及缩短情况，且具有统计学差异(
**
p<0.01)。上述结
果表明表达ldh的重组益生菌对溃疡性结肠炎有治疗作用，即ldh具有预防或治疗溃疡性结肠炎的作用。
[0127]
4.2重组益生菌对溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数的影响
[0128]
上述小鼠在实验过程中，对其体重、粪便粘稠度、便血及隐血情况进行监测，数据统计用spss23.0软件进行单因素方差分析。结果如图6中a可知，与空白对照组相比，dss模型组dai评分呈显著的上升趋势(
###
p<0.001)，表明dss模型构建成功的；与dss模型对照组相比，柳氮磺吡啶给药组、e.coli nissle 1917给药组、pet
‑
28a
‑
egfp给药组和pet
‑
28a
‑
ldh给药组均能降低dai评分(
*
p<0.05)，初步表明大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌和含表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌对溃疡性结肠炎具有治疗作用，且相较于大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌，表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌治疗效果显著。
[0129]
以上所述dai评分、结肠形态及结肠长度测定表明，表达ldh的重组益生菌对dss诱导的溃疡性结肠炎有治疗作用，无明显的毒副作用，即ldh及表达ldh的重组益生菌具有预防或治疗溃疡性结肠炎的作用，为溃疡性结肠炎的治疗提供新策略。
[0130]
溃疡性结肠炎的病因和发病机制尚不明确，已知的肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症过程在本疾病发生过程中起重要作用，目前认为是多因素相互作用所致，主要包括环境、遗传、感染与菌群失调和免疫因素等。近年来，肠黏膜屏障功能在uc发病中的变化受到越来越多的关注。uc患者的肠黏膜存在不同程度的损伤，通透性大大增加。肠上皮细胞旁路通透性增加，允许肠腔内病原菌及其毒素通过并进入上皮下层，这是导致炎症反应发作的重要因素。溃疡性结肠炎与消化性溃疡的病因均与感染、遗传、精神、自身免疫反应相关，可见两种疾病在病因学上有着相似的病因基础。两者的发生都是各种影响因素激活免疫系统，从而导致炎症和溃疡的形成。两者同属于消化系统疾病，氧自由基产生对胃肠黏膜的炎症刺激是两类疾病发生的共同环节。因此，可以推论出，本发明所述的表达ldh的重组益生菌对其他消化系统疾病，包括其他炎症性肠炎也具有治疗效果。
[0131]
实施例4表达ldh的重组益生菌对缺血性脑卒中大鼠的治疗效果
[0132]
1.mcao模型的制备和给药时间：
[0133]
spf级健康雄性sd大鼠，体重180
‑
220g，适应性饲养一周后，随机分为7组，分组和给药剂量如下：
[0134]
正常对照组(sham，口服给予等体积11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液)；
[0135]
ir模型组(mcao模型，口服给予等体积0.9％生理盐水)；
[0136]
ir+lactose组(mcao模型+lactose，口服给予等体积11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液)；
[0137]
阳性药组(mcao模型+nbp，口服给予丁苯酞20mg/kg/day)；
[0138]
e.coli nissle 1917组(mcao模型+e.coli nissle 1917)：灌胃2.5ml的大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌；
[0139]
pet
‑
28a
‑
egfp组(mcao模型+pet
‑
28a
‑
egfp)：灌胃2.5ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
egfp的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0140]
pet
‑
28a
‑
ldh组(mcao模型+pet
‑
28a
‑
ldh)：灌胃2.5ml含重组质粒pet
‑
28a
‑
ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌；
[0141]
上述给药组均由11.1mg/mlβ
‑
乳糖溶液进行配制；
[0142]
预给药10天，参照文献(reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.)所述的线栓法制作大鼠右侧中动脉闭塞动物模型。
[0143]
模型组：将麻醉后的大鼠固定，备皮，碘伏消毒，并消毒手术器械，预备好结扎用的4号线，沿颈部正中偏右行纵向切口约1.5cm。小心分离右侧颈动脉和迷走神经后，用手术缝合线将颈总动脉与颈内动脉结扎，颈总动脉结扎位置在分岔口10mm处，之后在离颈总动脉分叉处5mm处切口，将直径为0.32mm的线栓经切口插入颈内动脉，线栓深度约为18
‑
20mm时，停止插线，系紧结扎线。清洗后，进行分层缝合。在动物缺血2h后去除线栓，动物会自然苏醒，再灌注24h，进行相关指标检测。与永久性脑缺血不同的是，在阻断2h后拔出尼龙线栓，扎紧动脉残端，消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤。
[0144]
假手术组：除不插入线栓外其余操作同模型组。待实验动物清醒后，再进行药物干预，给药24h后处死取材。
[0145]
2.检测指标
[0146]
2.1神经功能缺损评分
[0147]
依据zea longa 5级评分：0分：无神经功能缺损；1分：病灶对侧前爪不能完全伸展；2分：向病灶对侧自发性旋转；3分：向病灶对侧倾倒；4分：无自发性行走且出现意识丧失。
[0148]
2.2 ttc染色
[0149]
取每组大鼠，断头，冰上分离脑组织，去除嗅球和脑干，生理盐水冲洗后立即放入
‑
20℃冷冻15min，取出，将大脑沿视交叉平面至垂体平面冠状切均匀切成4片冠状切片，浸入1.5％ttc溶液，37℃恒温水浴中孵育染色(避光)45min，每15min翻一次，使染色均匀，与正常组织中的脱氧酶反应呈红色，缺血区呈白色，即未染色的区域为梗死区域，根据脑组织各冠状切片梗死体积总和占全脑体积百分比测定动物脑组织梗死体积。
[0150]
脑梗死体积＝(缺血侧面积均值总和
‑
对侧面积均值总和)
×
梗死脑组织厚度
[0151]
3.实验结果
[0152]
神经功能缺损评价、ttc染色和脑梗死体积结果如图7和图8所示。由图7可知，与假手术组相比，模型组的神经功能评分显著升高(
###
p﹤0.001)，脑组织ttc染色呈均匀的红色，未见缺血白色梗死灶，而mcao模型组可见大区域的白色梗死灶，表明大鼠mcao模型构建成功。与模型组ir相比，模型组ir+lactose大鼠无明显的改善作用，表明乳糖溶液(lactose)对脑卒中没有神经保护作用；与ir模型组相比，e.coli nissle 1917组和pet
‑
28a
‑
egfp给药组对脑卒中大鼠的神经功能和脑梗死体积无改善作用，表明大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917原菌和含pet
‑
28a
‑
egfp的益生菌对脑卒中无神经保护作用；同时，与ir模型组相比，阳性药丁苯酞和表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌均能显著的降低神经功能缺损评分(
**
p<0.01)，改善梗死灶(
***
p<0.001)，表明表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌和丁苯酞一样具有脑卒中的神经保护作用，且表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌的神经保护作用(79.20％)显著强于临床用药丁苯酞的神经保护作用(45.08％)。上述结果表明，本发明所述的表达ldh的重组大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917益生菌具备更佳的治疗缺血性脑卒中神经损伤的作用，即ldh及表达ldh的重组益生菌具有预防或治疗脑卒中的作用，为脑卒中的治疗提供新策略。
[0153]
脑中风与心脑血管疾病有千丝万缕的关系，密不可分；脑中风又分为脑出血和脑梗死，脑梗就是我们常说的缺血性脑卒中，是由于各种原因导致患者的血液循环障碍，出现急性神经功能缺损的症状，患者往往会出现眼前发黑、头晕、头痛、心慌、手足软弱无力等症状。造成脑梗的原因主要包括心脑动脉血管的动脉粥样硬化。心脏疾病是脑梗的主要原因，比如发作性房颤或持续性房颤、风湿性的心脏瓣膜疾病，心律失常，左心肥厚，心肌梗死等，容易形成附壁血栓。当患者有心力衰竭或房颤的时候，腹壁的血栓脱落，容易造成患者脑栓塞。无论是出血性脑卒中还是缺血性脑卒中，高血压是最主要的独立诱发因素，在长期高血压情况下，会导致患者的大脑动脉粥样硬化，形成血管的弹性降低，从而诱发患者脑梗。同时血液流变学紊乱，特别是全血黏度增加时脑血流量下降，其中红细胞比积增高和纤维蛋白原水平增高是缺血性中风的主要诱发因素。从机理上来讲，缺血性脑卒中和心脏疾病均是由于血管堵塞引起缺血缺氧，使得细胞无法及时获得能量，最终导致细胞死亡而引发相关疾病。因此，可以推论出，本发明所述的表达ldh的重组益生菌对其他心血管疾病，尤其是各类脑卒中均具有良好的治疗效果。
[0154]
需要说明的是，本发明虽然以大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917为益生菌构建了表达ldh的重组益生菌，并具有显著的预防或治疗胃溃疡、溃疡性结肠炎、脑卒中的作用，但本发明并不局限于益生菌大肠埃希菌(escherichia coli)nissle 1917，在本发明的基础上，构建能够表达ldh的其他重组益生菌也能实现预防或治疗胃溃疡、溃疡性结肠炎、脑卒中的作用。
[0155]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。