一种引物组合、探针、试剂盒及其使用方法与流程

1.本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一种用于检测百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法，具体涉及用于扩增百日咳杆菌序列的引物组合、探针、含探针的实时荧光扩增试剂，用于检测百日咳杆菌的核酸检测试剂盒。


背景技术：

2.百日咳杆菌(bordetella pertussis)为卵圆形短小杆菌，大小为0.5～1.5
×
0.2～0.5μm，属鲍特氏菌属bordetella，无鞭毛、芽孢。百日咳杆菌主要经飞沫传播，可引起人类百日咳，易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周。发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大，且该病病程较长，故名百日咳。百日咳杆菌以分离培养为主，标本采用鼻咽拭子或咳皿法，根据菌落形态，涂片染色镜检作出初步诊断。
3.近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
4.mira(multienzyme isothermal rapid amplification)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体rec/ssdna，在辅助蛋白和单链结合蛋白ssb的帮助下，侵入双链dna模板；在侵入位点形成d
‑
loop区域，并开始对dna双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体rec/ssdna解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。mira技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。
5.针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了多酶快速恒温扩增荧光mira法作为百日咳杆菌核酸检测的试剂盒。


技术实现要素：

6.因此，本发明为了解决上述技术问题中的至少一个，提供了一种百日咳杆菌核酸检测的试剂盒，该试剂盒能够节约反应时间，反应温度要求低。
7.根据本公开的第一方面，提供了一种引物组合，包括：所述引物组合包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物用于扩增包括百日咳杆菌基因序列的扩增片段；所述第一引物和第二引物序列的长度范围为30～35bp；所述扩增片段的长度范围为150～300bp。
8.所述引物组合中的第一引物和第二引物的长度范围为30～35bp，第一或第二引物的序列过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度。第一引物和第二引物的扩增出的目的片
段长度通常不超过500bp，优选范围为150～300bp。
9.在一些可能的实现方式中，所述第一引物和第二引物的gc含量范围为30％～70％。第一引物和第二引物的碱基排布要求随机性高，且gc含量在30％～70％之间，能够避免形成二级结构而影响扩增。
10.在一些可能的实现方式中，所述第一引物的序列为：
11.gcaccgctttacccgaccttaccgcccaca；
12.所述第二引物的序列为：
13.tgtgaactgtcaataggttgtattcgtccaggttg。
14.在一些可能的实现方式中，还包括第三引物；
15.所述第三引物的识别位点位于所述扩增片段内；
16.所述第三引物的识别位点且不与所述第一引物和第二引物的识别位点重叠。
17.在一些可能的实现方式中，所述第三引物的序列长度范围为46～52nt。
18.在一些可能的实现方式中，所述第三引物的序列为：
19.tcatccagtcggccttgcgtgagtgggctacgcacacctaccagaact。
20.根据本公开的第二方面，提供了一种探针组合，用于百日咳杆菌的核酸检测，其特征在于，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。
21.在一些可能的实现方式中，所述荧光探针序列为：
22.tcatccagtcggccttgcgtgagtgggct[fam
‑
dt]acg[thf][bhq1
‑
dt]cacacctaccagaact
‑
c3spacer。
[0023]
thf位点，该位点的位置优选位于距离5’端的≥35nt的中部位置的dspacer(四氢呋喃，thf)，用于作为核酸外切酶的识别位点。
[0024]
位于thf位点上游的t碱基上的荧光基团(如fam)；位于thf位点下游在t碱基上的淬灭基团(如bhq1)；该荧光基团和淬灭基团间的距离优选为2～4nt。
[0025]
位于thf位点3’末端约15nt处的修饰基团，该修饰基团为胺基、磷酸基团或c3
‑
spacer。
[0026]
根据本公开的第三方面，提供了一种试剂盒，用于百日咳杆菌的核酸检测，其特征在于，包括扩增反应试剂，所述扩增反应试剂中包括如权利要求7所述的探针组合。
[0027]
在一些可能的实现方式中，还包括缓冲液、阳性质控品和阴性质控品。
[0028]
在一些可能的实现方式中，所述阳性质控品为百日咳杆菌的分离培养物。
[0029]
在一些可能的实现方式中，所述阴性质控品为生理盐水。
[0030]
在一些可能的实现方式中，还包括一种内标引物组合，用于扩增含人体gapdh基因的核酸片段，所述内标引物组合包括：
[0031]
第一内标引物，其序列为：
[0032]
tctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggt；
[0033]
第二内标引物，其序列为：
[0034]
aaaggtggaggagtgggtgtcgctgttgaagt；
[0035]
第三内标引物，其序列为：
[0036]
caggcgtcggagggccccctcaagggca[vic
‑
dt]c[thf][bhq1
‑
dt]
gggctacactgagcaccc3spacer。
[0037]
根据本公开的第四方面，提供了一种前述试剂盒的使用方法，该包括以下步骤：
[0038]
提取待测样本的核酸；
[0039]
配制反应体系，向所述反应体系中加入所述核酸，进行mira扩增反应；
[0040]
根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有百日咳杆菌核酸。
[0041]
在一些可能的实现方式中，所述试剂盒用于口咽拭子、鼻咽拭子核酸检测。
[0042]
在一些可能的实现方式中，mira扩增反应在温度设定为39℃的荧光检测器中进行。
[0043]
通过以上的技术方案可知，本发明具有优势如下：
[0044]
能够节约反应时间，降低反应温度。具体地，mira反应只需要5～20min，加上样品处理以及准备时间，整个检测过程能够在1h之内完成，而且与常规pcr相比，不经过变温过程，只需要在恒温39℃即可反应。
[0045]
扩增所需的酶和引物探针等冻干成粉，能够在常温下保存。
[0046]
操作更加简单、便携：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测出结果，不需要熟练的专业人员操作。
[0047]
特异性强、灵敏度高，检测结果真实可靠。
[0048]
在扩增反应试剂的a buffer中添加了核酸外切酶iii，切割扩增产物，降低产物污染的可能性。
附图说明
[0049]
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0050]
图1为mira荧光法检测百日咳杆菌核酸的灵敏度示意图；
[0051]
图2为mira荧光法检测百日咳杆菌核酸的特异性示意图。
具体实施方式
[0052]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0053]
荧光mira引物、探针的设计
[0054]
根据百日咳杆菌的基因序列，采用dnaman软件比对找出特异插入重复序列is481区域，以is481序列为模板，根据mira扩增反应原理进行引物、探针的设计。
[0055]
本实施例中使用的引物组合和探针序列如表1所示：
[0056]
表1引物与探针序列
buffer加至反应管的盖子内侧，请务必上下颠倒反应管8
‑
10次混匀)；
[0074]
5)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。
[0075]
其中，荧光检测程序设置为：恒温39℃；每30s采集一次fam通道和vic通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间20mins。
[0076]
试验1多酶恒温快速扩增mira荧光法检测百日咳杆菌核酸的灵敏度
[0077]
以包含百日咳is481核酸序列的质粒为模板，进行10倍梯度稀释，使稀释后的终浓度分别为1
×
105copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
10copies/μl、0copies/μl，以生理盐水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光mira反应，每个浓度重复3次试验。
[0078]
图1为试验1的结果。由图1可知：本试验中1
×
105copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
10 3
copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
10copies/μl结果均为阳性，即荧光mira法检测试剂盒的灵敏度达到10copies/μl。
[0079]
试验2多酶恒温快速扩增mira荧光法检测百日咳杆菌核酸的特异性
[0080]
为评价本发明提供的试剂盒的检测特异性，实验从临床样本中筛选了一组常见的呼吸道病原体，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、人腺病毒、肺炎支原体、人冠状病毒以及与百日咳杆菌有一定同源性的副百日咳杆菌和霍氏鲍特菌。上述样本采用天根生化科技(北京)有限公司《磁珠法病原微生物dna/rna提取试剂盒》提取。
[0081]
图2为试验2的结果。由图2可知，本试验提供的试剂盒检测常见呼吸道病原体结果均为阴性；检测与百日咳杆菌同源性的较高的副百日咳杆菌和霍氏鲍特菌，结果亦为阴性说明该荧光mira法具有良好的检出效果和特异性。
[0082]
尽管已经通过优选实施例进一步详细说明和描述了本发明，但是本发明不限于所公开的示例，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下从其中得出其他变型。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。