一种高凝血因子XIII效价的纤维蛋白原制备工艺的制作方法

一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺
技术领域
1.本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种高凝血因子 xiii效价的纤维蛋白原制备工艺。


背景技术：

2.纤维蛋白原是参与凝血或止血过程中的重要蛋白。在凝血过程中，纤维蛋白原在凝血酶作用下裂解形成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体通过氢键和疏水作用形成纤维蛋白多聚体，此多聚体不稳定，在凝血因子xiii和钙离子作用下内部相互共价结合形成稳定的纤维蛋白多聚体，最终达到止血和粘合的效果。
3.另外，实际生产过程中，由于生物制品的复杂性，纤维蛋白原中凝血因子xiii效价低且不稳定，限制了其在临床的广泛应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对纤维蛋白原中凝血因子xiii存在效价低且不稳定的问题，提出一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，以提高凝血因子xiii效价和质量稳定性。
5.本发明是通过如下技术方案实现的：
6.一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于，该工艺包括如下步骤：
7.(1)将冰冻血浆水浴解冻至完全融解，然后低温离心，收集上清血浆，将所述上清血浆升温，然后调节所述上清血浆ph；
8.(2)向所述上清血浆中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，混合混匀后离心，过滤，收集滤液；将滤液保温搅拌进行s/d病毒灭活，灭活后调节ph，得到s/d病毒灭活血浆；
9.(3)将所述s/d病毒灭活血浆预冷，加入乙醇进行低温醇沉，然后离心，收集沉淀；
10.(4)将沉淀粉碎后，再加入乙醇进行漂洗，离心收集沉淀；
11.(5)将步骤(4)收集的沉淀粉碎，然后加入一次复溶液，搅拌至沉淀完全溶解，得到溶解液；所述的一次复溶液是由枸橼酸钠溶液和氯化钠溶液混合而成；
12.(6)将步骤(5)中所述的溶解液过滤，收集滤液，向滤液中再次加入乙醇进行低温醇沉，然后离心收集沉淀；
13.(7)将步骤(6)中的沉淀粉碎，然后加入二次复溶液，搅拌至完全溶解，过滤，得到高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原；所述的二次复溶液由枸橼酸钠溶液、氯化钠溶液和盐酸精氨酸溶液混合而成。
14.进一步地，步骤(1)将冰冻血浆于0-4℃水浴中解冻脱袋，血浆脱袋后继续在0-4℃水浴中缓慢融化过夜，然后在3-4℃水浴中搅拌至完全融解，融解后将血浆在2-3℃下搅拌1-2小时，然后低温离心，离心后收集上清血浆，弃冷胶；将所述上清血浆升温至室温，然后用1-10wt％的盐酸溶液调节所述上清血浆ph至6.60-6.65。具体的，低温离心是在0-4℃下
进行，离心速率为10000rpm，离心 15分钟。
15.进一步地，步骤(2)向所述上清血浆中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，混合混匀后离心，然后经孔径1μm的聚丙烯材质滤器过滤，收集滤液；将滤液在25℃
±
1℃下保温搅拌3-6小时进行s/d病毒灭活，灭活后用1-10wt％的盐酸溶液调节ph为6.60
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6.65，得到s/d病毒灭活血浆；向所述上清血浆中加入所述聚山梨酯80和所述磷酸三丁酯后，所述聚山梨酯80的终浓度为0.85
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1.15wt％；所述磷酸三丁酯的终浓度也在0.85-1.15wt％范围内。将所述上清血浆用聚丙烯材质滤器过滤，除去血浆中可能存在的颗粒。
16.进一步地，步骤(3)将所述s/d病毒灭活血浆预冷至-3～ 4℃，然后按终浓度为8％～12％，喷雾加入体积分数为50％的乙醇溶液并搅拌20-40分钟，随后在-3～4℃下进行低温醇沉1-2小时，然后离心，收集沉淀。这里所述的终浓度为乙醇加入后的体积浓度。
17.进一步地，步骤(4)将步骤(3)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎后，再加入沉淀质量20-25倍的乙醇进行漂洗，然后离心收集沉淀；所加入的乙醇的体积分数为8-12％，温度为0-4℃。
18.进一步地，步骤(5)将步骤(4)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入沉淀质量25-30倍的一次复溶液，并在25-37℃下搅拌至沉淀完全溶解；所述的一次复溶液是由1.2-1.6wt％的枸橼酸钠溶液和0.7-1.0wt％的氯化钠溶液混合而成，且所述一次复溶液的 ph为6.8-7.2。
19.进一步地，步骤(6)将步骤(5)中所述的溶解液经孔径 0.45μm的聚丙烯材质滤器过滤，收集滤液并预冷至-3～4℃，然后按终浓度6-10％向滤液中喷雾加入体积分数50％的乙醇溶液，搅拌 30-40分钟，在-3～4℃下进行低温醇沉1-2小时，离心收集沉淀。该步骤中所述的终浓度为乙醇加入后的体积浓度。
20.进一步地，步骤(7)将步骤(6)中的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入与沉淀等质量的二次复溶液，在25-37℃下搅拌至完全溶解，然后用孔径1-2μm的玻璃纤维滤器过滤，再用孔径0.22
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0.45μm的聚醚砜eav滤器二次过滤，得到高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原。
21.进一步地，所述的二次复溶液由0.5-0.8wt％的枸橼酸钠溶液、 0.4-0.5wt％的氯化钠溶液和5-6wt％的盐酸精氨酸溶液混合而成，且所述二次复溶液的ph为6.8-7.2。
22.本发明的有益效果：
23.本发明提供的高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，提高了凝血因子xiii效价和质量稳定性，解决现有纤维蛋白原制备过程中凝血因子xiii效价低和质量不稳定的问题；本发明将纤维蛋白原生产工艺中血浆脱袋和融浆温度改变，增加了离心去冷胶、去冷胶和s/d灭活后血浆ph调节工艺，引进了醇沉工艺并且严格控制醇沉温度和时间，再利用乙醇漂洗，结合使用一次/二次复溶液进行洗脱，优选漂洗液和复溶液的添加量，使得凝血因子xiii效价提高并稳定。
附图说明
24.图1为江西博雅、上海莱士纤维蛋白原制备工艺制得人纤维蛋白原和本发明实施例1-3制备的纤维蛋白原的凝血因子xiii效价对比。
具体实施方式
25.实施例1
26.一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，包括如下具体步骤：
27.(1)将冰冻血浆于2℃的水浴中解冻脱袋，血浆脱袋后继续在 2℃的水浴中缓慢融化过夜，然后在3℃的水浴中搅拌至完全融解，融解后将血浆在3℃下搅拌1小时，然后低温离心，离心后收集上清血浆，弃冷胶；然后将所述的上清血浆升温至室温，然后用 2wt％的盐酸溶液调节上清血浆ph为6.6；
28.(2)向上述的上清血浆中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，混合混匀后离心，离心后经孔径1μm的聚丙烯材质滤器过滤，除去血浆中可能存在的颗粒，收集滤液；将滤液在25℃下保温搅拌6小时进行s/d病毒灭活，灭活后用2wt％的盐酸溶液调节ph为6.6，得到 s/d病毒灭活血浆；在向所述上清血浆中加入所述聚山梨酯80和所述磷酸三丁酯后，使得所述聚山梨酯80的终浓度为0.85wt％，使得所述磷酸三丁酯的终浓度为1.15wt％；
29.(3)将所述s/d病毒灭活血浆预冷至-3℃，然后按终浓度为10％，喷雾加入体积分数为50％的乙醇溶液并搅拌30分钟，随后在-3℃下进行低温醇沉1小时，然后离心，收集沉淀；
30.(4)将步骤(3)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎后，再加入沉淀质量20倍的乙醇进行漂洗，然后离心收集沉淀；所加入的乙醇的浓度为8％，温度为2℃；
31.(5)将步骤(4)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入沉淀质量25倍的一次复溶液，并在 25℃下搅拌至沉淀完全溶解，得到溶解液；所述的一次复溶液是由 1.3wt％的枸橼酸钠溶液和0.85wt％的氯化钠溶液混合而成，且所述一次复溶液的ph为6.8；
32.(6)将步骤(5)中所述的溶解液经孔径0.45μm的聚丙烯材质滤器过滤，收集滤液并预冷至4℃，然后按终浓度8％向滤液中喷雾加入体积分数50％的乙醇溶液，搅拌30分钟，在4℃下进行低温醇沉2小时，离心收集沉淀；
33.(7)将步骤(6)中的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入与沉淀等质量的二次复溶液，在25℃下搅拌至完全溶解，然后用孔径 1μm的玻璃纤维滤器过滤，再用孔径0.22μm的聚醚砜eav滤器二次过滤，得到高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原；其中所述的二次复溶液由0.6wt％的枸橼酸钠溶液、0.425wt％的氯化钠溶液和 5.5wt％的盐酸精氨酸溶液混合而成，且所述二次复溶液的ph为 6.8。
34.实施例2
35.一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，包括如下具体步骤：
36.(1)将冰冻血浆于3℃的水浴中解冻脱袋，血浆脱袋后在 0℃的水浴中缓慢融化过夜，然后在4℃的水浴中搅拌至完全融解，融解后将血浆在2℃下搅拌1小时，然后低温离心，离心后收集上清血浆，弃冷胶；然后将所述的上清血浆升温至室温，然后用2wt％的盐酸溶液调节上清血浆ph为6.65；
37.(2)向上述的上清血浆中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，混合混匀后离心，离心后经孔径1μm的聚丙烯材质滤器过滤，除去血浆中可能存在的颗粒，收集滤液；将滤液在26℃下保温搅拌4小时进行s/d病毒灭活，灭活后用5wt％的盐酸溶液调节ph为6.65，得到s/d病毒灭活血浆；在向所述上清血浆中加入所述聚山梨酯80和所述磷酸三丁酯后，使得所述聚山梨酯80的终浓度为0.95wt％，使得所述磷酸三丁酯的终浓度为1.00wt％；
38.(3)将所述s/d病毒灭活血浆预冷至2℃，然后按终浓度为12％，喷雾加入体积分数为50％的乙醇溶液并搅拌20分钟，随后在2℃下进行低温醇沉2小时，然后离心，收集沉淀；
39.(4)将步骤(3)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎后，再加入沉淀质量25倍的乙醇进行漂洗，然后离心收集沉淀；所加入的乙醇的浓度为10％，温度为4℃；
40.(5)将步骤(4)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入沉淀质量30倍的一次复溶液，并在37℃下搅拌至沉淀完全溶解，得到溶解液；所述的一次复溶液是由1.4wt％的枸橼酸钠溶液和0.85wt％的氯化钠溶液混合而成，且所述一次复溶液的ph为7.2；
41.(6)将步骤(5)中所述的溶解液经孔径0.45μm的聚丙烯材质滤器过滤，收集滤液并预冷至0℃，然后按终浓度6％向滤液中喷雾加入体积分数50％的乙醇溶液，搅拌40分钟，在0℃下进行低温醇沉1小时，离心收集沉淀；
42.(7)将步骤(6)中的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入与沉淀等质量的二次复溶液，在30℃下搅拌至完全溶解，然后用孔径 2μm的玻璃纤维滤器过滤，再用孔径0.45μm的聚醚砜eav滤器二次过滤，得到高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原；其中所述的二次复溶液由0.65wt％的枸橼酸钠溶液、0.45wt％的氯化钠溶液和5wt％的盐酸精氨酸溶液混合而成，且所述二次复溶液的ph为7.2。
43.实施例3
44.一种高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原制备工艺，包括如下具体步骤：
45.(1)将冰冻血浆于0℃的水浴中解冻脱袋，血浆脱袋后在 4℃的水浴中缓慢融化过夜，然后在3℃的水浴中搅拌至完全融解，融解后将血浆在3℃下搅拌2小时，然后低温离心，离心后收集上清血浆，弃冷胶；然后将所述的上清血浆升温至室温，然后用10wt％的盐酸溶液调节上清血浆ph为6.62；
46.(2)向上述的上清血浆中加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，混合混匀后离心，离心后经孔径1μm的聚丙烯材质滤器过滤，除去血浆中可能存在的颗粒，收集滤液；将滤液在24℃下保温搅拌4小时进行s/d病毒灭活，灭活后用10wt％的盐酸溶液调节ph为6.62，得到s/d病毒灭活血浆；在向所述上清血浆中加入所述聚山梨酯80和所述磷酸三丁酯后，使得所述聚山梨酯80的终浓度为1.15wt％，使得所述磷酸三丁酯的终浓度为0.85wt％；
47.(3)将所述s/d病毒灭活血浆预冷至 4℃，然后按终浓度为8％，喷雾加入体积分数为50％的乙醇溶液并搅拌20分钟，随后在2℃下进行低温醇沉2小时，然后离心，收集沉淀；
48.(4)将步骤(3)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎后，再加入沉淀质量25倍的乙醇进行漂洗，然后离心收集沉淀；所加入的乙醇的浓度为12％，温度为2℃；
49.(5)将步骤(4)收集的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入沉淀质量30倍的一次复溶液，并在30℃下搅拌至沉淀完全溶解，得到溶解液；所述的一次复溶液是由1.4wt％的枸橼酸钠溶液和 0.9wt％的氯化钠溶液混合而成，且所述一次复溶液的ph为7.0；
50.(6)将步骤(5)中所述的溶解液经孔径0.45μm的聚丙烯材质滤器过滤，收集滤液并预冷至-3℃，然后按终浓度10％向滤液中喷雾加入体积分数50％的乙醇溶液，搅拌40分钟，在-3℃下进行低温醇沉1小时，离心收集沉淀；
51.(7)将步骤(6)中的沉淀用低温粉碎机粉碎，然后加入与沉淀等质量的二次复溶液，在35℃下搅拌至完全溶解，然后用孔径 2μm的玻璃纤维滤器过滤，再用孔径0.22μm的聚醚砜eav滤器二次过滤，得到高凝血因子xiii效价的纤维蛋白原；其中所述的二次复溶液由
0.8wt％的枸橼酸钠溶液、0.5wt％的氯化钠溶液和5.8wt％的盐酸精氨酸溶液混合而成，且所述二次复溶液的ph为7.0。
52.检测：根据《中国药典》(2020年版)三部“人纤维蛋白粘合剂”3.3.1.5人凝血因子xiii效价进行检定江西博雅、上海莱士纤维蛋白原制备工艺制得人纤维蛋白原和本发明实施例1-3制备的纤维蛋白原的凝血因子xiii效价，结果见图1。
53.从图1中可以看出江西博雅人纤维蛋白原的凝血因子xiii效价为1.25iu/ml；上海莱士人纤维蛋白原的凝血因子xiii效价为 2.5iu/ml；本发明实施例1-3所制得的纤维蛋白原的凝血因子 xiii效价均为10iu/ml，明显要更高，且效价稳定。
54.上述为本发明的较佳实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。凡由本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。