一种基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明涉及力学信号调控水凝胶领域，具体涉及基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.水凝胶是一类内部含有大量水的三维网络，它一般由亲水聚合物通过化学交联或物理交联形成。由于其理化性质和人体细胞外基质性质接近(高含水量低表面张力等)，与人体组织接触表现出良好的生物相容性，因此其在组织工程，细胞培养平台，及伤口敷料等生物医学领域中广泛应用。
3.近些年来，越来越多的研究专注于利用水凝胶网络包裹内含物，在一定条件下将其释放的应用。由于水凝胶更有利于蛋白质等活性因子的负载，本身质地柔软，且方便使用模具制造成各种形状，因此受到了很高的期待。然而目前的水凝胶降解释放内含物时，往往需要浸泡在特殊药物溶液中，或者只能延迟释放和/或立即释放和/或恒定释放，无法通过更加简单的外界条件来控制其降解释放。
4.因发现gb1蛋白可以保护中间的多肽序列不被mmp2降解而受到启发，目前，缺乏一种可受力学信号调控可降解的基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶及其制备方法和应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种可受力学信号调控可降解的基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
6.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)质粒的构建：在两蛋白gb1的基因序列之间插入多肽序列gpqgiwgq，将蛋白gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1的基因片段通过限制性内切酶处理克隆到pqe80l载体中；
8.(2)蛋白的表达纯化：将步骤(1)所得质粒转入大肠杆菌bl21感受态细胞表达蛋白并将所得蛋白纯化；
9.(3)力信号调控可降解蛋白水凝胶的制备：将步骤(2)所得蛋白与多臂亲水高分子4臂
‑
降冰片烯
‑
聚乙二醇溶液混合，制得基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶。
10.进一步地，在步骤(1)中，gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1的基因片段通过限制性内切酶bamhi和kpni处理，pqe80l载体通过限制性内切酶bglii和kpni处理，蛋白基因序列带有pqe80l载体的n
‑
末端6
×
his标记。
11.进一步地，在步骤(2)中，蛋白表达条件为16
‑
37℃，4
‑
20小时，用co
2+
‑
nta蛋白树脂纯化，透析至1
×
磷酸盐缓冲液，并在使用前保存在4℃下。
12.更进一步地，在步骤(3)中，蛋白gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1与4臂
‑
降冰片烯
‑
聚乙二醇以
摩尔比2:1混合，随后加入1mg/ml的苯基(2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐lap，紫外灯照射1.5小时成胶。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述的1
×
磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为10mm，ph为6.21
‑
8.21，含137mm nacl和2.7mm kcl。
14.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶。
15.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在探测力学信号图案化中的应用。
16.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在药物释放中的应用。
17.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在细胞培养和释放中的应用。
18.有益效果：本发明的水凝胶当受到外加压力作用时会被降解。本发明的基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶能够通过力学信号来控制其降解与否；无细胞毒害性；在受到外力作用时，可以被迅速降解，可以作为药物释放的载体或者细胞释放的平台。
19.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
20.(1)在功能上，相对于现有的释放内含物水凝胶，可以通过力学信号，随时控制其降解能力与速率。本发明基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶，可以广泛应用于药物释放，细胞培养和释放，力学信号检测等。控制其降解只需要外界的力学信号，而不需要复杂、特殊的药物环境。
21.(2)通过对水凝胶施加外力，来调控其降解以及降解的速度。所述的可受力学信号调控的蛋白，其中间含有多肽序列gpqgiwgq，可被mmp2蛋白酶特异性识别。其多肽序列两端各带有蛋白结构域gb1，可以在无外力影响时保护内侧多肽序列不被mmp2蛋白酶识别、降解。在受到一定外力后，水凝胶会被mmp2蛋白酶迅速降解。
22.(3)首先蛋白构建方面，在gpqgiwgq多肽序列两端插入gb1蛋白序列，保护其不被切开；其次在宏观调控上，当水凝胶受到外力，两端的gb1受力解折叠成为无结构多肽链，失去对gpqgiwgq多肽序列的保护作用，使其可以被降解，从而使水凝胶降解，释放其内含物。
附图说明
23.图1为本发明的gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1蛋白受力学调控的原理示意图。
24.图2为本发明的基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶设计原理示意图。
25.图3为本发明的基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶分别在有无外力情况下的降解情况图。
具体实施方式
26.下面结合附图对本发明内容作进一步详细说明。
27.实施例1
28.如图1所示，在正常情况下，gpqgiwgq多肽序列被两个gb1包裹在中间，无法与mmp2蛋白酶结合。但是在外力作用下，两端的gb1发生解折叠，使得中间的gpqgiwgq暴露出来，从而让mmp2可以识别、降解蛋白。
29.本发明的一种基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
30.(1)质粒的构建：在两蛋白gb1的基因序列之间插入多肽序列gpqgiwgq，将蛋白gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1的基因片段通过限制性内切酶处理克隆到pqe80l载体中；gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1的基因片段通过限制性内切酶bamhi和kpni处理，pqe80l载体通过限制性内切酶bglii和kpni处理，蛋白基因序列带有pqe80l载体的n
‑
末端6
×
his标记。
31.(2)蛋白的表达纯化：将步骤(1)所得质粒转入大肠杆菌bl21感受态细胞表达蛋白并将所得蛋白纯化；蛋白表达条件为37℃，4小时，用co
2+
‑
nta蛋白树脂纯化，透析至1
×
磷酸盐缓冲液，并在使用前保存在4℃下。所述的1
×
磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为10mm，ph为7.21，含137mm nacl和2.7mm kcl。
32.(3)力信号调控可降解蛋白水凝胶的制备：将步骤(2)所得蛋白与多臂亲水高分子4臂
‑
降冰片烯
‑
聚乙二醇溶液混合，制得基于可受力学信号调控可降解性的水凝胶。蛋白gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1与4臂
‑
降冰片烯
‑
聚乙二醇以摩尔比2:1混合，随后加入1mg/ml的苯基(2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐lap，紫外灯照射1.5小时成胶，如图2所示。
33.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解的蛋白水凝胶。
34.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在探测力学信号图案化中的应用。
35.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在药物释放中的应用。
36.本发明所述的方法制备的基于可受力学信号调控可降解性的蛋白水凝胶在细胞培养和释放中的应用。
37.本发明的原理，首先，通过突变以及氨基酸序列的添加为蛋白gb1
‑
gpqgiwgq
‑
gb1引入两个额外的暴露在溶剂中的半胱氨酸残基让它们能够与含有聚乙二醇的降冰片烯反应生成水凝胶。其次，由于蛋白两端的gb1将中间的gpqgiwgq包裹在内，使得mmp2无法与其结合，防止水凝胶被降解；而当水凝胶受到外力，两端的gb1蛋白受力发生解折叠，形成无结构的多肽链，将中间的gpqgiwgq多肽序列暴露出来，使得水凝胶可以被mmp2降解。最后，可以通过人为控制外力的大小以影响gb1发生解折叠的概率与速度，从而控制水凝胶降解的速度。
38.使用这样的蛋白水凝胶设计，所用材料无细胞毒害性，可以通过力信号简单方便地控制水凝胶的降解。力信号本身对细胞无害，而mmp2酶本就存在于生物体内，因此不会引入可能损伤机体的额外机制来控制水凝胶的降解，可以运用于药物释放等医药领域或者作为细胞培养与释放的平台。如果将内含物改为荧光物质，还可以通过水凝胶降解与否来判断其受力情况，从而使其具有探测监视力信号的功能。
39.实施例2
40.实施例2与实施例1的区别在于：在步骤(2)中，蛋白的表达纯化：将步骤(1)所得质粒转入大肠杆菌bl21感受态细胞表达蛋白并将所得蛋白纯化；蛋白表达条件为15℃，16小时，用co
2+
‑
nta蛋白树脂纯化，透析至1
×
磷酸盐缓冲液，并在使用前保存在4℃下。所述的1
×
磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为10mm，ph为8.21，含137mm nacl和2.7mm kcl。
41.实施例3
42.实施例3与实施例1的区别在于：在步骤(2)中，蛋白的表达纯化：将步骤(1)所得质粒转入大肠杆菌bl21感受态细胞表达蛋白并将所得蛋白纯化；蛋白表达条件为37℃，20小时，用co
2+
‑
nta蛋白树脂纯化，透析至1
×
磷酸盐缓冲液，并在使用前保存在4℃下。所述的1
×
磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为10mm，ph为6.21，含137mm nacl和2.7mm kcl。
43.试验例1
44.下面对本发明各项性能进行实施例测试：
45.本发明在有无力信号情况下降解速率对比
46.如图3所示，上方a组图片为水凝胶无外力作用下效果，可见经过120小时后形态仍未发生明显变化；下方b组图片为水凝胶外力作用下效果，可见48小时内已有过半水凝胶发生降解。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。