一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置的制作方法

1.本发明涉及医用实验研究技术领域，具体地说，是一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置。


背景技术：

2.目前的生精小管微流控培养芯片包含两层聚二甲基硅氧烷结构(pdms)；上层芯片包含一个进样口及一个液体通道，用于培养液灌注；下层包括一个与进样口连接的样品腔，用于放置代培养样品；在上下两层芯片放置了一片多孔聚碳酸酯膜作为半透膜，两层芯片通过等离子清洗机键合完成制作。其芯片的使用是将生精小管组织从上层进样口加入下层样品腔，加入后封闭进样口，使用两根钢针插入两侧液体通道，由微流控泵将培养基由钢针通过微流控芯片，透过多空聚碳酸酯膜渗入下层，实现生精小管的微流控培养。而目前睾丸组织使用块状组织冷冻，冻存过程中加入相关保护剂浸泡后进行冻融，解冻后再将睾丸组织洗涤去除保护剂后再放入微流控行组织培养。
3.目前生精小管的冷冻主要以块状生精小管的冷冻为主，在冷冻过程中生精小管的渗透较差，冷冻保护剂无法迅速渗透进入生精小管管腔中，造成冷冻过程中近管腔处冰晶形成，从而引起细胞凋亡等不良结果；同时由于生精小管近管腔侧主要分布生精细胞和精子细胞，生精小管近管壁侧主要分布支持细胞和间质细胞，不同的细胞种类对同种保护剂的耐受性和效果不同，然而目前的冷冻只能选择一种保护剂渗透，易造成管腔内细胞差异化的冻存结局，影响生精小管整体复苏效果，从而造成复苏后生精微环境的损伤，最后影响生精小管培养结局。在生精小管复苏后，需要使用梯度洗涤液去除组织中的冷冻保护剂，在去除保护剂过程中面临和冷冻同样的问题，即液体渗透和管腔细胞差异化带来的影响。这些问题都会影响冻融的复苏率及随后的培养效果。
4.与此同时，目前的单通道微流控组织培养体系，仅能成功培养小鼠生精小管。对于人类生精小管的微流控体外培养仍没有有效的方法。单通道微流控睾丸培养芯片虽然可以初步模拟体内条件，组织的持续培养时间能维持3-6个月，但是人类生精小管的培养不仅需要模拟体内的毛细血管循环系统，也需要维持其中的生精细胞存活，维持生精微环境的稳态，而单通道芯片的仅能将培养基渗透到生精小管表面，对于生精小管管壁的渗透效果较差。同时，由于生精小管近管腔侧主要分布生精细胞和精子细胞，生精小管近管壁侧主要分布支持细胞和间质细胞，不同的细胞需要不同的特异性培养基培养，单通道微流控芯片仅能通过一种培养基，无法实现管腔内外差异细胞的差异化培养。所以，目前的单通道微流控芯片仅能维持生精小管一定时间的存活，并不能进行很好的冻存和细胞组织培养调控。
5.所以综上所述，现亟需要一种操作方便，适应性强，能够完成单根生精小管管腔内外的差异化培养基微流控灌注，同时还能够完成单根生精小管的冻融、培养和细胞生长调控的适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置，但是关于这种新型的适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置，目前还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决上述中所存在的问题，对此特提供一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置，包括双通道微流控芯片，所述的双通道微流控芯片由双层pdms及中间多孔聚碳酸酯膜共同键合而成；所述的双通道微流控芯片可分为上层腔体芯片和下层腔体芯片，且所述的上层腔体芯片和下层腔体芯片之间设置有一半透膜，所述的上层腔体芯片的上表面上设置有两个上层液体出入口，所述的下层腔体芯片中设置有三个相同的独立单元，且所述的独立单元为长行槽，所述的长行槽内设置有均匀排列的若干齿槽，且每个齿槽呈间隔设置；所述长行槽内的两侧还设置有微注射固定针。
9.在上述所述的适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中，作为一个优选方案，所述的上层腔体芯片用于生精小管管外微流控培养液流动。
10.在上述所述的适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中，作为一个优选方案，所述的长行槽的宽度为300μm，长度为1cm。
11.在上述所述的适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中，作为一个优选方案，所述的微注射固定针呈垂直结构，且穿过上层腔体芯片并预留出部分。
12.本发明优点在于：
13.1、本发明结构设计合理，操控方便，固定牢固，安全稳定，制作简便，易清洗消毒，可满足单根生精小管冻融及体外培养的需求，实用性强，为生精小管体外培养医学实验研究提供了极大的方便，提高工作效率。
14.2、本发明在单通道微流控芯片的培养存活基础上增加生精小管管腔内培养通道，不仅可以实现组织冻融过程中的保护剂差异化加载和去除，还可以在此基础上进行管内外差异化培养，也可以实现生精小管的长期培养及生精微环境的调控，更好地完成对人类生精微环境调控的研究及体外生精小管培养及体外精子发生的实现。
附图说明
15.附图1是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置的结构示意图。
16.附图2是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中上层腔体和下层腔体的局部结构示意图。
17.附图3是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中下层腔体的局部结构示意图。
18.附图4是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置的局部流程示意图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限
定的范围。
20.附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：
21.1.双通道微流控芯片2.上层腔体芯片3.下层腔体芯片
22.4.半透膜5.上层液体出入口6.长行槽
23.7.齿槽8.微注射固定针
24.实施例1一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置
25.请参见附图1-4所示，附图1是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置的结构示意图。附图2是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中上层腔体和下层腔体的局部结构示意图。附图3是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置中下层腔体的局部结构示意图。附图4是本发明中所述适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置的局部流程示意图。
26.本装置主要解决涉及单根生精小管冻融、培养等技术，具体是根据生精小管的管腔结构和生精小管管内外细胞分布差异，在传统的单通道微流控芯片中加入第二个通道，完成单根生精小管管腔内外的差异化培养基微流控灌注，完成单根生精小管的冻融、培养和细胞生长调控，为体外睾丸组织的冻存及培养提供实验平台；其具体提供一种适用于单根生精小管微流控冷冻培养装置，该装置主要包括双通道微流控芯片，所述的双通道微流控芯片由双层pdms及中间多孔聚碳酸酯膜共同键合而成；所述的双通道微流控芯片1可分为上层腔体芯片2和下层腔体芯片3，其上层腔体芯片2主要作为液体的流动通道，下层腔体芯片3主要作为生精小管的组织细胞培养；且所述的上层腔体芯片2和下层腔体芯片3之间设置有一半透膜4，所述的半透膜4用于阻绝下层腔体芯片中的组织细胞飘散到上层腔体芯片中，所述的上层腔体芯片2的上表面上设置有两个上层液体出入口5，所述的下层腔体芯片3中设置有多个相同的独立单元(在本实施例中优选为3个，且该设置可根据需要满足多情况下的培养需求，提高装置的实用性)，且所述的独立单元为长行槽6，所述的长行槽6内设置有均匀排列的若干齿槽7，且每个齿槽7呈间隔设置，所述的齿槽7用来固定生精小管，同时让一定量的液体接触小管进行营养交换；所述长行槽6内的两侧还设置有微注射固定针8。
27.在本实施例中，优选所述的上层腔体芯片2用于生精小管管外微流控培养液流动。
28.在本实施例中，所述的长行槽6的宽度为300μm，长度为1cm，且每个槽内可放置约1cm的单根生精小管。
29.在本实施例中，优选所述的微注射固定针8呈垂直结构，且穿过上层腔体芯片2并预留出部分，该设置可方便对下层腔体芯片中的组织进行培养注射。
30.本发明的使用方法：首先，将单根生精小管放置在下层腔体内得长行槽内，且每个槽内可放置长约1cm的单根生精小管，在放置完后，生精小管的两侧可由两根直径50μm的微注射固定针分别插入生精小管管腔并进行固定，待组织加载完毕后，将上层腔体与下层腔体以及位于上层腔体与下层腔体之间的半透膜键合，再通过钢针及毛细管建立液体通道后即可开始微灌注。
31.需要说明的是：本发明可以在单通道微流控芯片的培养存活基础上增加生精小管管腔内培养通道，不仅可以实现组织冻融过程中的保护剂差异化加载和去除，还可以在此基础上进行管内外差异化培养，也可以实现生精小管管腔内微环境调控，更好地完成对人
类生精微环境调控的研究及体外生精小管培养及体外精子发生的实现；其次由于冻存生精小管时需要将小管分为单根后放置于装置中，两侧再进行分别钢针固定，此时可以按照需要的保护剂种类、温度、流速、浓度、灌注时间进行冷冻保护剂加载、灌注、实现管内外差异化保护加载；且生精小管复苏后可将其再次置于双通道微流控制芯片中，两侧分别用钢针固定，此时可以按照需要的洗涤液种类、温度、流速、浓度、灌注时间进行灌注，以管内外最佳方式进行冷冻保护剂的去除，实现管内外差异化保护剂的去除，同时，还可以根据需要在去除过程中加入抗氧化应激及抗凋亡因子，通过微流控通道控制精准的流速和浓度，完成快速渗透，减少冻融损伤；且复苏完成后生精小管可不移出芯片，通过微灌注通道可以直接开始生精小管双通道微流控培养过程，根据生精小管内外细胞类型差异，使用不同的培养基进行灌注培养；并可以按需求加入细胞调控因子，实现管腔内外差异化培养；且本装置整体结构设计合理，操控方便，固定牢固，安全稳定，制作简便，易清洗消毒，可满足单根生精小管冻融及体外培养的需求，实用性强，为生精小管体外培养医学实验研究提供了极大的方便，提高工作效率；
32.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。