技术特征：
1.一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，包含引物探针混合物，其特征在于，所述引物探针混合物由四条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性引物和三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针组成：（1）所述特异性引物的序列，其特征在于：alk
‑
df1正向引物：5
’‑
aactactgtagagcccacacct
‑3’
，alk
‑
df2正向引物：5
’‑
acatcacacaccttgactggtc
‑3’
，alk
‑
df3正向引物：5
’‑
gttaccaaaactgcagacaagca
‑3’
，alk
‑
dr反向引物：5
’‑
cttgctcagcttgtactcaggg
‑3’
；（2）所述特异性探针的序列，其特征在于：alk
‑
dp1融合探针：5
’‑
cctaaagtgtaccgccgg
‑3’
，alk
‑
dp2融合探针：5
’‑
ttgtacttgtaccgccgg
‑3’
，alk
‑
dp3融合探针：5
’‑
aaccaagtgtaccgccgg
‑3’
。2.根据权利要求1所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，其特征在于，所述的四条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性引物序列跨eml4
‑
alk融合基因的融合断点，正向引物和反向引物之间的待扩增区域包含eml4
‑
alk融合基因的融合断点。3.根据权利要求1所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针5’端具有fam荧光基团修饰，3’末端位修饰mgb非荧光淬灭基团。4.根据权利要求1所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针序列跨eml4
‑
alk融合基因的融合断点。5.根据权利要求1所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系由10
×
引物探针混合物、dpcr
‑
酶反应液、cdna模板和去离子水组成。6.根据权利要求5所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，其特征在于，所述引物探针混合物的浓度分别为：alk
‑
df1正向引物浓度为4.0
‑
8.5 μmol/l；alk
‑
df2正向引物浓度为2.5
‑
5.0μmol/l；alk
‑
df3正向引物浓度为3.5
‑
6.5μmol/l；alk
‑
dr反向引物浓度为5.5
‑
10.0μmol/l；alk
‑
dp1融合探针浓度为2.5
‑
3.2μmol/l；alk
‑
dp2融合探针浓度为2.1
‑
3.0μmol/l；alk
‑
dp3融合探针浓度为2.2
‑
3.0μmol/l。7.根据权利要求5或6所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述检测体系用于检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中eml4
‑
alk基因融合变异。8.根据权利要求7所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系的应用，其特征在于，检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中eml4
‑
alk基因融合变异方法包括如下步骤：提取样本中的rna；
将上述提取的rna进行逆转录反应，得到cdna；采用由10
×
引物探针混合物、dpcr
‑
酶反应液、cdna模板和去离子水组成的检测体系配制扩增反应；按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60
‑
63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；通过数字pcr仪采集荧光信号，分析得到检测样本中eml4
‑
alk基因融合变异情况，给出判定结果。9.根据权利要求8所述的基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述步骤（2）中rna逆转录反应的参数为：（1）变性反应：rna样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；（2）逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
技术总结
本发明提供了一种基于数字PCR检测EML4
技术研发人员：徐梅波 张建
受保护的技术使用者：远辰生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：2021.07.07
技术公布日：2021/9/9