一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用的制作方法

一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系及其应用。


背景技术：

2.随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学（precision medicine）的概念从系统医学、转化医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病的治疗水平。随着世界许多主要国家提出精准医学的战略，精准医学已经成为未来医学的发展方向，2015年作为精准医学的元年，具有重要的历史意义，时至今日，精准医学已成不可以逆转的发展趋势。
3.eml4
‑
alk融合基因是在2007年由日本学者soda等发现，研究表明不同的eml4
‑
alk融合基因亚型都具有恶性转化和致癌性能力。研究表明3%
‑
13%的非小细胞肺癌患者含有此基因，它为非小细胞肺癌的个体化治疗提供了一个新的靶点。eml4
‑
alk融合基因几种常见亚型包括亚型1（49.6%）、亚型2（10%）、亚型3a和3b（25.6%）、亚型4、亚型5a和5b、亚型6和亚型7。eml4
‑
alk融合基因亚型1（e13;a20）由eml4第13外显子和alk第20外显子融合而成；eml4
‑
alk融合基因亚型2（e20;a20）由eml4第20外显子和alk第20外显子融合而成；eml4
‑
alk融合基因亚型3a（e6;a20）由eml4第6外显子和alk第20外显子融合而成；eml4
‑
alk融合基因亚型3b（e6ins33;a20）由eml4第6外显子和alk第20外显子融合而成 ,第6外显子中插入了一段33bp片段；eml4
‑
alk融合基因亚型4（e14;ins11del49a20）由eml4第14个外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子中插入了一段11bp片段，删除了一段49bp片段；eml4
‑
alk融合基因亚型5a（e2;a2）0由eml4第2外显子和alk第20外显子融合而成；eml4
‑
alk融合基因亚型5b（e2;ins117a20）由eml4第2外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段117bp片段；eml4
‑
alk融合基因亚型6（e3;ins69a20）由eml4第3外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段69bp片段；eml4
‑
alk融合基因亚型7（e14;del12a20）由eml4第14外显子和alk第20外显子融合而成，第20外显子删除了一段12bp片段。
4.目前国内已上市了包括克挫替尼、塞瑞替尼、阿来替尼在内的多种alk抑制剂，因此，提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简单、成本较低的检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，在相关癌症的诊疗应用中具有重要意义。
5.

技术实现要素：

6.针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，所述体系通过优化eml4
‑
alk融合基因的引物探针特异性，提高了融合突变的检出率，辅助特殊的rna样本前处理过程，进一步减小了假阳性概率，综合上述特点及优势，本发明所述的检测体系可以在一个反应中实现三种eml4
‑
alk融合突变位点的同
步检测，对于微量样本的检测具有巨大的应用价值，弥补了临床上取样困难、样本量少等不足。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由四条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性引物和三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针组成：（1）所述特异性引物包括：alk
‑
df1正向引物：5
’‑
aactactgtagagcccacacct
‑3’
，alk
‑
df2正向引物：5
’‑
acatcacacaccttgactggtc
‑3’
，alk
‑
df3正向引物：5
’‑
gttaccaaaactgcagacaagca
‑3’
，alk
‑
dr反向引物：5
’‑
cttgctcagcttgtactcaggg
‑3’
，（2）所述特异性探针包括：alk
‑
dp1融合探针：5
’‑
cctaaagtgtaccgccgg
‑3’
，alk
‑
dp2融合探针：5
’‑
ttgtacttgtaccgccgg
‑3’
，alk
‑
dp3融合探针：5
’‑
aaccaagtgtaccgccgg
‑3’
。
8.优选地，所述的四条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性引物序列跨eml4
‑
alk融合基因序列的融合断点，正向引物和反向引物之间的待扩增区域包含eml4
‑
alk融合基因的融合断点。
9.优选地，所述的三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针5’端具有fam荧光基团修饰，3’末端位修饰mgb非荧光淬灭基团。
10.优选地，所述的三条检测eml4
‑
alk融合基因的特异性探针序列跨eml4
‑
alk融合基因的融合断点。
11.优选地，所述反应体系由10
×
引物探针混合物、dpcr
‑
酶反应液、cdna模板和去离子水组成。
12.例如，本发明中，若所述反应体系的总体积为20μl，则其中10
×
引物探针混合物2.0μl、dpcr
‑
酶反应液10μl、cdna模板1
‑
8μl，去离子水补齐至20μl。
13.优选地，所述引物探针混合物的浓度分别为：alk
‑
df1正向引物浓度为4.0
‑
8.5 μmol/l；alk
‑
df2正向引物浓度为2.5
‑
5.0μmol/l；alk
‑
df3正向引物浓度为3.5
‑
6.5μmol/l；alk
‑
dr反向引物浓度为5.5
‑
10.0μmol/l；alk
‑
dp1融合探针浓度为2.5
‑
3.2μmol/l；alk
‑
dp2融合探针浓度为2.1
‑
3.0μmol/l；alk
‑
dp3融合探针浓度为2.2
‑
3.0μmol/l。
14.第二方面，本发明提供一种基于数字pcr检测eml4
‑
alk融合基因的反应体系的应用，所述检测体系用于检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中eml4
‑
alk基因融合变异。
15.优选的，检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中eml4
‑
alk基因融合变异方法包括如下步骤：
(1)提取样本中的rna；(2)将上述提取的rna进行逆转录反应，得到cdna；(3)采用由10
×
引物探针混合物、dpcr
‑
酶反应液、cdna模板和去离子水组成的检测体系配制扩增反应；(4)按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60
‑
63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；(5)通过数字pcr仪采集荧光信号，分析得到检测样本中eml4
‑
alk基因融合变异情况，给出判定结果。
16.优选的，述步骤（2）中rna逆转录反应的参数为：（1）变性反应：rna样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；（2）逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明提供的eml4
‑
alk基因融合变异的数字pcr检测体系，具有较高的特异性和灵敏性，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确度高；（2）本发明提供的eml4
‑
alk基因融合变异的数字pcr检测体系，可以应用于肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等多种生物样本类型，同时一个反应可以同步检测三种融合突变类型（占eml4
‑
alk基因融合变异亚型的85%以上），检测成功率高，针对微量模板的检测具有明显的优势，在临床检验中具有较高的应用价值。
18.（3）本发明提供的扩增体系操作简单，节省原料，且整个扩增流程所需时间短，方便操作，结果直观，便于分析，检测结果更为准确、灵敏；本发明提供的检测体系可大规模用于分析临床样本，提供准确稳定的检测结果。
19.附图说明
20.图1为采用本发明检测的外周血rna样本1中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图2为采用本发明检测的外周血rna样本2中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图3为采用本发明检测的肿瘤组织rna样本1中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图4为采用本发明检测的肿瘤组织rna样本2中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图5为采用本发明检测的血浆游离rna样本1中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图6为采用本发明检测的血浆游离rna样本2中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图7为采用本发明检测的外泌体rna样本1中eml4
‑
alk基因融合变异的结果；图8为采用本发明检测的外泌体rna样本2中eml4
‑
alk基因融合变异的结果。
具体实施方式
21.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
22.实施例1 eml4
‑
alk基因融合变异的数字pcr检测体系的设计与建立
1.引物探针组合的设计首先，根据文献报道的eml4
‑
alk基因融合变异的亚型，对其中多种亚型进行分析，选取了三种最主要的融合变异类型（占eml4
‑
alk基因融合变异亚型的85%以上）。在跨融合断点区域设计多组引物和探针进行特异性筛选。
23.引物设计原则：本发明中用于检测eml4
‑
alk基因融合变异的引物对是由primer5和ncbi blast软件设计完成；引物长度在18
‑
25个核苷酸之间，引物的gc含量在40%
‑
60%之间，引物的tm值≥60℃。各引物的tm值大致接近，以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用ncbi blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够特异比对到目标区域。引物的扩增产物大小在100
‑
150bp范围内。所设计的引物用auto dimer软件分析引物二聚体情况，确保特异性和避免二聚体的出现。
24.探针设计的原则：本发明中用于检测eml4
‑
alk基因融合变异的特异性探针，在3’末端均经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸，同时3’末端位修饰mgb非荧光淬灭基团；探针5’端具有fam荧光基团修饰用于检测融合区域的变异情况。
25.eml4
‑
alk基因融合变异类型与引物/探针序列如表1所示：表12. 检测系统建立2.1 将上述设计的引物探针按照不同的浓度比例配制10
×
引物探针混合物，具体的各引物和探针的浓度如表2所示：表2
2.2 按照数字pcr反应体系配制扩增反应：其中dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物2.0μl、cdna模板1
‑
8μl和去离子水补齐至20μl。
26.2.3 使用bio
‑
rad qx200 autodg droplet digital pcr系统中的automated droplet generator 微滴发生器对dpcr反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步pcr反应。
27.2.4 将微滴体系置于pcr仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
28.2.5 将扩增产物置于数字pcr仪器内进行荧光信号读取，分析得到检测样本中eml4
‑
alk基因融合变异情况，给出判定结果。
29.在建立eml4
‑
alk基因融合变异检测体系测试中，本发明使用了两例肿瘤病人外周血样本进行检测。血液样本使用qiagen公司的rneasy mini kit进行rna提取，使用qubit进行rna浓度及质量检测，备用。
30.由图1和2可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本eml4
‑
alk基因融合变异情况。
31.图1外周血rna样本的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信号copies为78 copies/20μl；图2外周血rna样本的检测结果为eml4
‑
alk未发生基因融合变异，样本为野生型，其中fam检测的信号copies为0 copies/20μl。
32.本发明所述的eml4
‑
alk基因融合变异的数字pcr检测体系，使用单色荧光标记检测样本的eml4
‑
alk基因融合变异情况，可以在结果图谱中直观的观察到样本是否存在变异情况，从而直观的判断检测样本的阴阳性结果。
33.实施例2 肿瘤组织样本的检测选取了2例肿瘤组织样本，采用本发明的检测体系，对其rna进行检测，具体操作步骤如下：1. 肿瘤组织样本rna提取
使用qiagen公司的rneasyffpekit分别对2例肿瘤组织样本进行rna提取，使用qubit进行rna浓度及质量检测，备用。
34.2.rna进行逆转录反应，得到cdna。
35.2.1rna样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；2.2逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
36.3.pcr扩增3.1dpcr扩增体系配制按照数字pcr反应体系配制扩增反应：其中dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物2.0μl、cdna模板1μl、去离子水7μl，补齐至20μl。
37.3.2使用bio
‑
radqx200autodgdropletdigitalpcr系统中的automateddropletgenerator微滴发生器对dpcr反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步pcr反应。
38.3.3将微滴体系置于pcr仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
39.3.4将扩增产物置于数字pcr仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的fam信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本eml4
‑
alk基因融合变异情况。
40.由图3和4可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的肿瘤组织样本eml4
‑
alk基因融合变异情况。
41.图3肿瘤组织rna样本1的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信号copies为2120copies/20μl；图4肿瘤组织rna样本2的检测结果为eml4
‑
alk未发生基因融合变异，样本为野生型，其中fam检测的信号copies为0copies/20μl。
42.实施例3血浆游离核酸样本的检测选取了2例肺癌病人的血浆样本，采用本发明的检测体系，对其血浆cfrna进行检测，具体操作步骤如下：1.血浆cfrna提取使用qiagen公司的qiaampccfdna/rnakit分别对2例血浆样本进行rna提取，使用qubit进行rna浓度及质量检测，备用。
43.2.rna进行逆转录反应，得到cdna。
44.2.1rna样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；2.2逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
45.3.pcr扩增3.1dpcr扩增体系配制按照数字pcr反应体系配制扩增反应：其中dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物2.0μl、cdna模板8μl，补齐至20μl。
46.3.2 使用bio
‑
rad qx200 autodg droplet digital pcr系统中的automated droplet generator 微滴发生器对dpcr反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步pcr反应。
47.3.3 将微滴体系置于pcr仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
48.3.4 将扩增产物置于数字pcr仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的fam信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本eml4
‑
alk基因融合变异情况。
49.由图5和6可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的血浆游离rna样本中eml4
‑
alk基因融合变异情况。
50.图5血浆游离rna样本1的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信号copies为274 copies/20μl；图6血浆游离rna样本2的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信号copies为34 copies/20μl。
51.实施例4 外泌体样本的检测选取了2例肺癌病人的血浆样本，采用本发明的检测体系，对其外泌体rna进行检测，具体操作步骤如下：1. 外泌体rna提取使用qiagen公司的exorneasy serum/plasma midi kit分别对2例血浆样本进行外泌体rna提取，使用安捷伦4200的rna分析试剂盒进行外泌体rna浓度及质量检测，备用。
52.2. rna进行逆转录反应，得到cdna。
53.2.1 rna样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；2.2 逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。
54.3. pcr扩增3.1 dpcr扩增体系配制按照数字pcr反应体系配制扩增反应：其中dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物2.0μl、cdna模板8μl，补齐至20μl。
55.3.2 使用bio
‑
rad qx200 autodg droplet digital pcr系统中的automated droplet generator 微滴发生器对dpcr反应体系进行“油包水”微滴生成，待微滴体系完成则可进行下一步pcr反应。
56.3.3 将微滴体系置于pcr仪上进行扩增反应，扩增条件参数如下：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束。
57.3.4 将扩增产物置于数字pcr仪器内进行荧光信号读取。根据实际读取到的fam信号值对2例样本进行信号统计，最终判断该样本eml4
‑
alk基因融合变异情况。
58.由图7和8可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测的外泌体rna样本中eml4
‑
alk基因融合变异情况。
59.图7外泌体rna样本1的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信
号copies为10.7 copies/20μl；图8外泌体rna样本2的检测结果为eml4
‑
alk发生基因融合变异，其中fam检测的信号copies为9.8 copies/20μl。
60.综上所述，本发明提供的eml4
‑
alk基因融合变异的数字pcr检测体系，特异性好，灵敏性高，相比市场上其他公司的产品在特异性检测中灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；检测的假阳性率大幅度降低，检测结果准确度高。同时本发明提供的检测体系，可以应用于肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等多种生物样本类型，同时一个反应可以同步检测三种融合突变类型（占eml4
‑
alk基因融合变异亚型的85%以上），检测成功率高针对微量模板的检测具有明显的优势，在临床检验中具有较高的应用价值。