一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽Pyr-2及其制备方法与应用

一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽pyr
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2及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽pyr
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2及其制备方法与应用。


背景技术：

2.在过去几十年，抗生素的滥用导致细菌耐药性不断变强，产生耐药性的细菌数量也日益变多，为防止这些细菌的传播与感染，开发新的、能够取代抗生素的药物成为了人们近些年迫切需要解决的问题。抗菌肽(amps)是一类具有广谱抗菌性的多肽类物质，是先天免疫系统中重要组成成分；存在范围广泛，在动物、植物中均发现其存在。与抗生素相比，抗菌肽具有无毒副作用(仅小部分对细胞具有溶血性)、不易产生耐药性、使用无残留、对环境无污染等优点逐渐成为取代抗生素的首要选择。
3.抗菌肽的抑菌机理一直是人们研究的热切话题。就目前而言，无论是已发现的天然存在的抗菌肽还是人工合成的抗菌肽，研究较多的均是抗菌肽通过破坏细菌细胞膜来发挥抑菌作用，但这种作用方式可能导致抗菌肽的特异性差，对机体正常细胞产生一定的毒性。近些年的研究发现，抗菌肽杀菌方式不仅是作用于细菌细胞膜，一些抗菌肽可跨膜进入细胞内部，与胞内核酸和蛋白质上的特定靶点相互作用，通过对基因转录、翻译和表达的调控，或者抑制胞内特定蛋白质的功能发挥从而抑制或杀死细菌。天然抗菌肽pyrrhocoricin是一种存在于昆虫体内的富脯氨酸抗菌肽，靶向作用于细菌核糖体，仅对革兰氏阴性菌有抑菌活性，但该肽溶血活性较高，且合成过程复杂，导致合成成本高昂，较高的合成难度使其在生产应用上产生了很大的局限性。


技术实现要素：

4.基于以上不足，本发明提供一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽pyr
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2，该抗菌肽是一种通过作用于细菌细胞内，靶向抑制革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽，对红细胞几乎没有溶血。
5.本发明所采用的技术方案如下：一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽pyr
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2，其序列如seq id no.1所示。
6.本发明的另一目的是还公开一种靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽pyr
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2的制备方法，步骤如下：
7.(1)天然抗菌肽pyrrhocoricin中第2
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10位氨基酸为核心序列，对多肽的抗菌活性及靶向性有很大的影响。利用脯氨酸分别对序列中第4、5位的甘氨酸和丝氨酸进行替换，增加脯氨酸的数量，提高疏水性；使用精氨酸对第11位的苏氨酸进行替换，增加了多肽的正电荷数，进而提高多肽的抗菌活性；
8.(2)采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成如seq id no.1所示的肽树脂，然后经过三氟乙酸切割；
9.(3)经过反相高效液相色谱(rp
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hplc)纯化，然后经过质谱(ms)鉴定，即完成抗菌肽pyr
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2的制备。
10.本发明的另一目的是提供一种靶向革兰氏阴性菌富脯氨酸抗菌肽pyr
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2在制备治疗革兰氏阴性菌引发的感染性疾病药物中的应用。
11.如上所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
12.本发明具有如下优点：通过本方法制备的靶向革兰氏阴性菌的富脯氨酸抗菌肽实验技术路线简单，对制备的抗菌肽进行抑菌活性、溶血活性测定，发现pyr
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2在很低的浓度下对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制作用，而对于金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌几乎没有抑制作用。pyr
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2对红细胞几乎没有溶血，有很好的生物相容性。综上所述，本发明的pyr
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2具有成为特异性抗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。
附图说明
13.图1抗菌肽pyr
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2的反相高效液相色谱图；
14.图2抗菌肽pyr
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2的质谱图；
15.图3抗菌肽pyr
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2的溶血活性。
具体实施方式
16.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
17.实施例1
18.将来源于昆虫的天然抗菌肽pyrrhocoricin进行氨基酸替换，利用脯氨酸对序列中的第4、5位的亲水性氨基酸进行替换，增加脯氨酸的数量从而增加抗菌肽疏水性；且用精氨酸对第11位的苏氨酸进行替换，增加抗菌肽的正电荷数。pyr
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2的序列及理化参数如表1所示。
19.表1肽的氨基酸序列及理化参数
[0020][0021]
实施例2
[0022]
固相化学合成法合成抗菌肽
[0023]
1、抗菌肽的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc
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x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后脱去fmoc基团后得到x
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wang树脂；再将fmoc
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y
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trt
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oh(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
‑
y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0024]
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉
淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由tfa、水和tis(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0025]
3、使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph 7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
[0026]
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如附图2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
[0027]
实施例3
[0028]
抗菌肽抗菌活性的测定
[0029]
1、最小抑菌浓度测定：采用标准微肉汤稀释法测定肽的最小抑菌浓度(mic)。细菌在220rpm恒定摇动下于37℃孵育过夜，然后转移至新的mhb直至生长的对数期，将对数期的细菌稀释至105cfu/ml。将50μl不同浓度的肽(肽的终浓度为1
‑
128μm)和50μl的细菌悬液添加到96孔板各孔中。阴性对照是未加菌的mhb培养基,阳性对照为加菌的mhb培养基，将96孔板置于37℃恒温培养箱18～20小时。肉眼和分光光度法下未观察到微生物生长的抗菌肽浓度为mic。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表2。
[0030]
表2抗菌肽的抑菌活性(μm)
[0031][0032]
由表2可以看出，pyr
‑
2仅对革兰氏阴性菌有抑菌作用，对革兰氏阳性菌在128μm时仍无明显抗菌活性。通过替换pyr中第4、5、11位的氨基酸，增加了多肽中脯氨酸个数以及正电荷数，且疏水性也得到了提升，使得pyr
‑
2在很低的浓度下对革兰氏阴性菌表现出了很好的抑菌作用，表现出极佳的靶向性。
[0033]
2、溶血活性的测定：健康人的新鲜血液1ml，1000g离心5min，弃上清液，收集红细胞；用pbs洗涤3遍，再用1ml pbs重悬；按比例在红细胞中添加pbs,使阳性对照的值在1左右。取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37混培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，1000g离心10min；取出50μl上清液移至新的96孔板中，用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μl pbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl 0.1％tritonx
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100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见说明书附图3。
[0034]
由说明书附图3可以看出，pyr
‑
2在256μm时仍未发生溶血，对红细胞没有产生破坏作用，说明pyr
‑
2有很好的生物相容性。
[0035]
综上所述，pyr
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2通过替换原多肽中的氨基酸，增加了脯氨酸个数，在提高抗菌肽
的正电荷及疏水性后，在低浓度下对革兰氏阴性菌仍有较好的抗菌活性，表现出极佳的靶向性。高浓度下pyr
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2的溶血活性几乎为0，表现出极好的生物相容性。以上结果表明pyr
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2具有成为特异性抗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。