鉴定克式棒状杆菌的方法与流程

1.本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及鉴定克式棒状杆菌的方法。


背景技术：

2.克氏棒状杆菌(corynebacterium kroppenstedtii)于1998年首次被collins等人从临床痰液标本中分离出来，归类于放线菌门放线菌目棒状杆菌科的棒状杆菌属，是一种革兰阳性短小棒状杆菌，亲脂生长。该菌不含分枝菌酸、无动力、无芽孢、不产生白喉毒素，过氧化氢酶和七叶甙反应阳性。
3.克氏棒状杆菌在普通培养基上(比如脑心培养基)难以生长，而在含tween 80的脑心培养基平板中生长良好。但即使如此，该菌通过传统培养的方式能被检测的阳性率也较低。
4.近年来，随着测序技术的发展，通过测序技术能够提升阳性检出率，但是测序技术成本较高，且需要专业的技术人员操作，流程较为复杂，因此不适合在临床大规模进行推广。
5.荧光定量pcr是一种核酸分析技术，因其具有操作简单、快捷方便，价格低廉等优点，目前使用最广泛。设计特异性引物和探针可对靶标序列双重识别，特异性好、假阳性低。此外，该技术综合了pcr扩增技术、荧光标记及信号获取技术，具有很高的灵敏度，可检测数个拷贝。通过荧光信号的采集可以直接对产物进行定量，线性关系好、线性范围宽。由于扩增和检测在同一管内完成，无需开盖，不存在污染的问题。因此通过荧光定量pcr来检测克氏棒状杆菌，具有准确、快速的优点。
6.目前有研究者利用克氏棒状杆菌的16s核糖体rna(16s rrna)为靶标进行荧光定量pcr的引物设计。16s rrna是原核生物的核糖体中30s亚基的组成部分，16s rrna的长度约为1.5kb，研究发现物种间16s rrna序列既有高变区(v区，物种之间有差异)也有保守区(物种之间高度相似)，往往需要对16s rrna的全长区域(～1.5kb)进行全长扩增测序才可能进行物种鉴定，而常用的16s rrna测序选取16s rrna可变区(约100-300bp)区域进行测序，虽然可以对物种鉴定区分到属水平，但很难区分到种水平。同样的，荧光定量pcr的靶标区域一般为100-200bp以内，虽然以探针引物作为杂交能够大幅提升特异性。但是，由于靶标区域有限，导致对于物种的鉴定的区分能力有限，在区分同属于棒状杆菌属但不同种的细菌的时候分辨能力有限，可能导致误检。因此，需要一种更特异的方式对克氏棒状杆菌进行鉴定。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了编码蛋白x的基因、编码蛋白mraz的基因和编码分泌蛋白的基因的至少之一在鉴定克式棒状杆菌中的用途、引物组、试剂盒及其在鉴定克式棒状杆菌中的应用、鉴定克式棒状杆菌的方法和引物组在制备试剂盒中的用途，蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白可作为鉴
定克式棒状杆菌的标志基因，通过检测这三种蛋白可以实现准确鉴定克式棒状杆菌的效果，并且，检测结果的准确性高，重现性好，应用前景好，尤其可应用于诊断感染克式棒状杆菌所患的肉芽肿性乳腺炎。
8.在本发明的一个方面，本发明提出了编码蛋白x的基因、编码蛋白mraz的基因和编码分泌蛋白的基因的至少之一在鉴定克式棒状杆菌中的用途，所述编码蛋白x的基因具有如seq id no：1所示的核苷酸序列或与seq id no：1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列。编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因可作为鉴定克式棒状杆菌的标志基因，通过检测这三种基因可以实现准确鉴定克式棒状杆菌的效果，并且，检测结果的准确性高，重现性好，应用前景好，尤其可应用于诊断感染克式棒状杆菌所患的肉芽肿性乳腺炎。
9.根据本发明的实施例，所述编码蛋白mraz的基因具有如seq id no：2所示的核苷酸序列或与seq id no：2所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列，所述编码分泌蛋白的基因具有如seq id no：3所示的核苷酸序列或与seq id no：3所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列。
10.在本发明的另一方面，本发明提出了一种引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括下列三组引物中的至少一组：第一引物组，所述第一引物组适用于扩增编码蛋白x的基因的至少一部分，所述蛋白x是如前面所述应用中所限定的；第二引物组，所述第二引物组适用于扩增编码蛋白mraz的基因的至少一部分，所述蛋白mraz是如前面所述应用中所限定的；第三引物组，所述第三引物组适用于扩增编码分泌蛋白的基因的至少一部分，所述分泌蛋白是如前面所述应用中所限定的。采用本发明的引物组可以扩增编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因，从而有助于克式棒状杆菌的鉴定。
11.根据本发明的实施例，所述第一引物组包括具有如seq id no：4所示核苷酸序列的第一引物、具有如seq id no：5所示核苷酸序列的第二引物和具有如seq id no：6所示核苷酸序列的第一探针引物；所述第二引物组包括具有如seq id no：7所示核苷酸序列的第三引物、具有如seq id no：8所示核苷酸序列的第四引物和具有如seq id no：9所示核苷酸序列的第二探针引物；所述第三引物组包括具有如seq id no：10所示核苷酸序列的第五引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的第六引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的第三探针引物，所述第一探针引物、第二探针引物和第三探针引物具有荧光基因。
12.在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述引物组。利用前面所述引物组可以扩增编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因，从而有助于克式棒状杆菌的鉴定。
13.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组或试剂盒在鉴定克式棒状杆菌中的应用。如前所述，本发明的引物组或试剂盒可以扩增编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因，从而实现克式棒状杆菌的鉴定，有助于克式棒状杆菌特性的深入理论研究和实践应用，例如诊断感染克式棒状杆菌所患的肉芽肿性乳腺炎。
14.在本发明的又一方面，本发明提出了一种鉴定克式棒状杆菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：确定待测菌株中是否含有蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的至少之一；当所述克式棒状杆菌中含有蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的至少之一，是所述待测菌株为克式棒状杆菌的指示，所述蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白是如前面所述用途中所限定的。
编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因可以作为克式棒状杆菌标志基因，通过检测这三种基因可以实现准确鉴定克式棒状杆菌的效果。
15.根据本发明的实施例，所述方法包括：提取所述待测菌株的dna；以所述dna为模板，利用前面所述引物组或试剂盒进行扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物进行比对分析，确定是否可以编码蛋白x、蛋白mraz和/或分泌蛋白；当所述扩增产物能够编码蛋白x、蛋白mraz和/或分泌蛋白，是所述待测菌株为克式棒状杆菌的指示。
16.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述引物组在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断肉芽肿性乳腺炎。采用本发明的引物组可以扩增编码蛋白x、蛋白mraz和分泌蛋白的基因，实现克式棒状杆菌的鉴定，有助于诊断感染克式棒状杆菌所患肉芽肿性乳腺炎。
17.根据本发明的实施例，所述肉芽肿性乳腺炎是因感染克式棒状杆菌所造成的。
18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
19.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
20.图1～3分别显示了根据本发明一个实施例的扩增结果示意图。
具体实施方式
21.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
22.在本发明的一个方面，本发明提出了编码蛋白x的基因、编码蛋白mraz的基因和编码分泌蛋白的基因的至少之一在鉴定克式棒状杆菌中的用途，所述编码蛋白x的基因具有如seq id no：1所示的核苷酸序列或与seq id no：1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列。研究发现，蛋白x(未知蛋白)、蛋白mraz和分泌蛋白的编码基因可作为鉴定克式棒状杆菌的标志基因，通过检测这三种基因可以实现准确鉴定克式棒状杆菌的效果，并且，检测结果的准确性高，重现性好，应用前景好，尤其可应用于诊断感染克式棒状杆菌所患的肉芽肿性乳腺炎。
23.编码蛋白x的基因具有如下核苷酸序列或与该序列具有至少70％同源性的核苷酸序列：
24.atgcatattcggccaacatttgaccggtattctcctagtgacctgtcttggcttggttcacgtcatgctgtggacaatgcggagacgggaacattgggggaaaagacaacccatattcgacgggcagttttaccgtcgggcaccgctttgcaccgtgacggcgactactggcttccggtgacatcgaaaacgcagtctgtggacggttttttgctcactgaccaggacaatgttcctggagaggttgtacccattgtgtggcatggccgtatccgcgttgatcgtcttccagattcaaacaaccgcgtgaaaatcgcagaatgcgatcatcctgagttcactttcgttcacgagccgtccgattctctatggaatgaggatggctcgacgaattttgatcaggtcggatcactgcgaggtgatatttaa(seq id no：1)
25.编码蛋白mraz的基因具有如下核苷酸序列或与该序列具有至少70％同源性的核苷酸序列：
26.atgttcttcggtactttcacccccaagatggacgacaaaggacgcttgactcttccggccaagtttcgcgatgagttagcagaaggcttgatggtgacgaaaggccaagaccattcattagccatctatccgcgcaacgtgttcctcgaacgcgctcgcaaagctgctgctgcatctcgaacgaacccggaggctcgcgcatttgtgcgtaacttagcggccagcgcggatgaacaatctgttgatggtcatgggcgaataacgatttcgcctgatcatcgtcgctacgcagggttaagcaaagaatgcgtcgtgattggttctgttgacttcgtcgaaatctggaatgcggagtcgtggaatcagtaccaagccgaacatgaagaaagctacgccaacggtgacgatgctgctttcatggacttcctctaa(seq id no：2)
27.编码分泌蛋白的基因具有如下核苷酸序列或与该序列具有至少70％同源性的核苷酸序列：
28.atgagccacggaaagtcaatattcctccggatcattatgatcctggtcgccgccatcctcatcgcaggcggtctatggggcatcggcctagccttgcacctcacaccagccgaaaagctcggtgagtacgcagacaccagcttctggggcacgttgaccgataagtcctggtacccgacggtcctcggtgtggcgtcggcaatcctgattcttcttggcctctggttctggtggttaatcatcgatcgccgccgcgtcaccaaggtggaagcaaaagaatctgccgacaacggacgagtcaccgttcggctggacgacatcgcgtccgctgtgtcgcaggatctcacccggtatgacggtattgcggactgcaaataccgctctgaggtggaccgtggccagaaggtgctgacgatgacgttgcggtgcgacccgcatgccgatctggatcatgtgcggggcgagtgccgccaagcagcgtcggatatcgtttctgcgctcccccaggaagacgtggatacgcgattcctcatccacctggataaagcgagctag(seq id no：3)
29.在本发明的另一方面，本发明提出了一种引物组，该引物组中含有三组引物，分别用于扩增编码蛋白x的基因的至少一部分、编码蛋白mraz的基因的至少一部分和编码分泌蛋白的基因的至少一部分。
30.具体地，第一引物组包括具有如seq id no：4所示核苷酸序列的第一引物、具有如seq id no：5所示核苷酸序列的第二引物和具有如seq id no：6所示核苷酸序列的第一探针引物，采用上述第一引物和第二引物可以特异性地扩增编码蛋白x基因的部分序列。
31.第二引物组包括具有如seq id no：7所示核苷酸序列的第三引物、具有如seq id no：8所示核苷酸序列的第四引物和具有如seq id no：9所示核苷酸序列的第二探针引物，采用上述第三引物和第四引物可以特异性地扩增编码蛋白mraz基因的部分序列。第二探针引物具有荧光基因，可以产生荧光信号，从而基于荧光信号判断出是否含有蛋白mraz。
32.第三引物组包括具有如seq id no：10所示核苷酸序列的第五引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的第六引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的第三探针引物，采用上述第五引物和第六引物可以特异性地扩增编码分泌蛋白基因的部分序列。第三探针引物具有荧光基因，可以产生荧光信号，从而基于荧光信号判断出是否含有分泌蛋白。
33.第一探针引物、第二探针引物和第三探针引物具有荧光基因。由此，可以产生可检测的荧光信号，从而基于荧光信号判断出是否含有蛋白x、marz和分泌蛋白。本发明对于荧光基因的类型不做严格限定，只要是可以产生可检测的荧光信号且不影响引物和dna链结合即可，具体可以根据实际情况灵活选择。例如，可以为fam、rox、vic等。
34.表1 引物序列
[0035][0036]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0037]
实施例1选取能够特异性代表克氏棒状杆菌的特异基因
[0038]
metaphian可以将已知数据库的序列信息进行分析，最终形成每个物种独特的标志基因(marker gene)，该独特的标志基因只在该物种存在，而在别的物种中不存在或存在的基因序列有明显差异。因此，这些标志基因可作为鉴定该物种的靶标区域。但在进行引物设计时，由于该数据库都是基于已有的测序基因组进行分析，可能某些物种仅有1-2条测序的全基因组，因此标记基因可能由于测序的随机错误或自身的碱基突变导致在实际菌株中有差异。因此最好收集同一个物种的不同菌株，验证序列保守性，抓取标志基因中最保守的区段设计适合进行广谱检测的引物。
[0039]
基于此，将5株克氏棒状杆菌进行全基因组测序，再利用metaphlan先从数据库中寻找克氏棒状杆菌的标志基因，并将寻找到的标志基因的序列与测序的5个菌株的测序数据中的该序列进行比对，选取长度大于300bp，且同一性》98％的基因为靶标，结果如表2所示，有3个基因可作为靶标。
[0040]
表2：克氏棒状杆菌的靶标区域
[0041]
[0042][0043]
实施例2设计引物并验证引物特异性
[0044]
针对靶标序列设计荧光定量pcr引物，设计后的引物序列逐一与数据库中的序列以及测序菌株中的序列进行比对，确认其能跟现有序列进行匹配。进行筛选后，针对蛋白x、mraz和分泌蛋白，设计的引物如表1。针对蛋白x，发明人设计了ck-f1/ck-f2的扩增引物，而探针引物为ck-pt1。通过对蛋白x进行扩增、杂交，从而产生荧光信号来确认是否含有蛋白x，从而确认是否含有克氏棒状杆菌。同理，扩增引物ck-f2/ck-f2和探针引物ck-pt2用于验证mraz基因，扩增引物ck-f3/ck-f3和探针引物ck-pt3用于验证分泌蛋白。
[0045]
无枝酸棒状杆菌(c.amycolatum)和结核硬脂酸棒状杆菌(c.tuberculostearicum)这两个物种跟克氏棒状杆菌的亲缘性非常近，因此以该两个物种为对照菌，验证设计的引物的特异性。实验流程以分离的5株克氏棒状杆菌、1株无枝酸棒状杆菌和1株结核硬脂酸棒状杆菌的基因组dna为模板，尝试选用roche公司的荧光定量pcr酶进行检测，按照该酶的说明书推荐的体系进行转录荧光定量pcr体系配置及反转录荧光定量pcr反应，其中因为三个靶标基因的探针引物带了不同的荧光标记，所以将设计的扩增引物和探针引物投入同一管，利用荧光标记进行区分，结果如表3所示，在五株克氏棒状杆菌作为模板的检测中，均成功检测到vic、rox和fam荧光，而在以无枝酸棒状杆菌和结核硬脂酸棒状杆菌的检测中均无法检测到这三个荧光信号，因此说明设计的引物对克氏棒状杆菌有良好的特异性，且三组引物均可用于作为检测克氏棒状杆菌的引物序列。
[0046]
表3.验证三组引物的特异性
[0047][0048]
注：ct值《37为真实检出。
[0049]
实施例3用验证的引物组检测肉芽肿乳腺炎病人的样本
[0050]
选取经由已报道的纳米孔测序方法(xin-qian li,jing-ping yuan,ai-si fu,hong-li wu,ran liu,tian-gang liu,sheng-rong sun&chuang chen(2021)new insights of corynebacterium kroppenstedtii in granulomatous lobular mastitis based on nanopore sequencing,journal of investigative surgery,doi:10.1080/08941939.2021.1921082)验证的3份来自于肉芽肿乳腺炎病人样本的核酸来实际验证上述3组引物在实际临床样本中的鉴别能力，选用roche公司的荧光定量pcr酶进行检测，按照该酶的说明书推荐的体系进行转录荧光定量pcr体系配置及反转录荧光定量pcr反应，其中因为三个靶标基因的探针引物带了不同的荧光标记，所以将设计的扩增引物和探针引物投入同一管，利用荧光标记进行区分，结果如图1-3所示，在三份样本中均成功扩增了三个靶标基因，从而证明检测到了三份样本中的克氏棒状杆菌。说明本发明的三组引物有很好的临床应用价值。
[0051]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0052]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。