一种用于少量样本高通量染色质免疫共沉淀测序样品制备的方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于少量样本高通量染色质免疫共沉淀测序样品制备的方法。


背景技术：

2.表观遗传学是研究基因序列不发生变化的情况下，导致基因表达水平的变化，这种影响往往是可以遗传的。表观遗传学的研究内容包括：dna甲基化，组蛋白修饰，非编码rna以及染色质重塑等。其中组蛋白修饰是表观遗传学研究中的重要内容。
3.核小体作为染色质的基本结构单元是由组蛋白的八聚体结构及其上缠绕约为147bp的dna片段构成，而在组蛋白的n末端有多个氨基酸残基，如精氨酸残基和赖氨酸残基，在其上会发生多种化学修饰如甲基化、乙酰化和磷酸化等。这些修饰通过影响组蛋白和dna缠绕的紧密程度进而调控基因表达。在正常的细胞内，组蛋白的修饰处于动态平衡的过程，但癌细胞中会发生组蛋白修饰的紊乱，进而导致基因表达的异常。目前，在肝癌、肺癌、胃癌和结直肠癌等癌细胞中均发现了多种组蛋白的异常修饰。因此，探究细胞内组蛋白修饰参与基因表达的调控机制，对于了解疾病发生、早期疾病的发现以及预后效果的评价具有重要意义。
4.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，chip)技术是研究体内核酸
‑
蛋白质相互作用的主要手段，并广泛地用于组蛋白修饰和转录因子的研究。chip主要流程如下：首先用甲醛处理细胞，使细胞内的组蛋白和dna交联；将细胞裂解释放基因组dna，通过超声或微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化的方式将基因组片段化；加入特异性的抗体实现对细胞内的靶蛋白免疫共沉淀；提取沉淀下的dna片段进行pcr或测序分析。此外，将chip技术与第二代测序(next gene sequencing,ngs)技术结合形成的chip
‑
seq技术能够在全基因层面上对细胞内组蛋白修饰的分布进行高通量分析。
5.常规的chip
‑
seq样本制备实验由于步骤较为复杂、反应过程有损耗以及抗原抗体结合效率低等问题，通常需要106‑
107的初始细胞量，这限制其在少量样本如临床样本上的应用。
6.广大研究者渴望通过提高chip
‑
seq样品制备的反应效率和通量来扩展其应用。因此，研究者把目光投向了微流控芯片技术，与宏观的传统实验装置相比，微流控芯片具有集成化、自动化、小型化和高通量等特点。基于微流控芯片的生化实验能够显著减少样本和试剂的用量，提升反应效率，同时可以将多步实验操作集成在微流控芯片上，从而减少大量的人力劳动以及降低人为因素所导致的实验误差。此外，基于微流控芯片高通量的特点，还可以进行大规模的平行实验和筛选实验。
7.因此，从chip
‑
seq技术的样本制备方法出发，通过与微流控芯片技术相结合，有望解决常规chip
‑
seq实验中需要大量的初始样本以及通量低等问题。
8.目前，有研究组通过将chip
‑
seq样品制备与微流控芯片技术相结合，能够实现对
少量样本多个指标的检测。2015年lu chang等人开发了一款微流控反应腔室，并基于此实现对至少100个细胞的chip
‑
seq样品制备，但这种方法是通过从较多的细胞样本中稀释出等于少量细胞样本的染色质进行免疫共沉淀过程，并且捕获的样本需要回收到离心管中进行常规的dna文库构建，这就限制了实验的通量和集成化。
9.基于目前chip
‑
seq样本制备方法的研究进展，我们发现细胞量以及实验通量仍然是限制其进一步广泛应用的主要问题，尤其是以少量细胞为样本直接进行chip
‑
seq样本制备。


技术实现要素：

10.本发明的目的是通过将chip
‑
seq样品制备过程与微流控芯片相结合，来解决传统chip
‑
seq实验所需大量初始样本以及通量低的问题。
11.第一方面，本发明要求保护一种用于高通量染色质免疫共沉淀测序样品制备的方法。
12.本发明要求保护的用于高通量染色质免疫共沉淀测序样品制备的方法，是将chip
‑
seq样品制备过程与微流控芯片相结合，可包括如下芯片上步骤和芯片外步骤。
13.其中，所述芯片上步骤可包括：细胞接种、交联、细胞裂解、染色质片段化、特异性免疫共沉淀反应、原位dna文库构建以及高通量样品编码；
14.所述芯片外步骤可包括：将编码后样本从芯片上回收后进行非特异性清洗、解交联、纯化、预扩增，得到待测序样品。
15.在所述方法中，所述芯片为新型超疏水微孔阵列芯片。
16.进一步地，所述超疏水是指水或水溶液与材料表面的接触角大于150
°
。
17.更进一步地，所述新型超疏水微孔阵列芯片可通过包括以下步骤的方法制备得到：
18.步骤1：通过一体注塑形成包括微孔阵列和位于所述微孔阵列之间的超疏水材料涂层池的芯片基底；所述微孔阵列的微孔直径在300
‑
1500μm(如1000μm)，微孔深度小于500μm，但不为零(如300μm)，微孔间距为1500
‑
3000μm(如2250μm)；所述超疏水材料涂层池的深度为50
‑
300μm(如100μm)，所述涂层池与所述微孔之间的微孔壁厚为50
‑
300μm(如150μm)。
19.步骤2：将超疏水涂料注入所述芯片基底的所述超疏水材料涂层池中，所述超疏水涂料挥发后形成超疏水层；所述超疏水层为表面与水或水溶液的接触角大于150
°
(如168
°
)的疏水层。
20.其中，所述超疏水涂料是包括1h,1h,2h,2h
‑
全氟辛基三乙氧基硅烷、二氧化钛纳米粒子和p25氧化钛混匀的悬浮液。
21.进一步地，所述超疏水涂料可通过包括如下步骤的方法制备得到：将1h,1h,2h,2h
‑
全氟辛基三乙氧基硅烷与无水乙醇在机械力的搅拌下混合1
‑
4h(如搅拌2h)，再加入二氧化钛纳米粒子和p25氧化钛混匀并超声分散1
‑
4h(如超声分散1h)后制备成悬浮液。
22.其中，所述1h,1h,2h,2h
‑
全氟辛基三乙氧基硅烷、所述无水乙醇、所述二氧化钛纳米粒子和所述p25氧化钛的配比可为2g：198g：10g：10g。
23.进一步地，步骤1中，所述微孔为圆柱形。所述微孔在所述微孔阵列中均匀分布，且任意两个相邻微孔底面圆心之间的距离为1500
‑
3000μm(如2250μm)。
24.进一步地，步骤1中，所述微孔和微孔壁外围均为所述涂层池。
25.在本发明的具体实施方式中，所述芯片基底由pmma材料制备而成。所述芯片基底有108个微孔阵列(12
×
9)，微孔为圆柱型，微孔直径为1mm，微孔深度300μm，微孔间距为2.25mm(任意两个相邻微孔底面圆心之间的距离为2.25mm)。
26.在所述芯片上步骤中，所述“细胞接种”可按照如下(a1)进行：
27.(a1)将细胞悬液浸没第一张所述芯片，记为chip
‑
1，完成将细胞接种到所述chip
‑
1上的每个微孔中；或者，将不同数量和种类的细胞通过移液器加入到所述chip
‑
1上的不同微孔中。
28.在所述芯片上步骤中，所述“交联”可按照如下(a2)进行：
29.(a2)用交联液和终止液先后浸没所述chip
‑
1，实现对细胞的交联和终止交联。
30.在所述芯片上步骤中，所述“细胞裂解”和“染色质片段化”可按照如下(a3)进行：
31.(a3)将2
×
裂解液加入到第二张所述芯片上(如通过点样的方式完成)，记为chip
‑
2，将所述chip
‑
2通过倒置后与经步骤(a2)处理过的所述chip
‑
1上下对准的方式，实现所述chip
‑
2中的所述2
×
裂解液到所述chip
‑
1的转移，先4℃孵育10min，再37℃孵育15min，从而完成对细胞的原位裂解以及对染色质的片段化。
32.在所述芯片上步骤中，所述“特异性免疫共沉淀反应”按照如下(a4)进行：
33.(a4)将抗体
‑
磁珠复合物加入到第三张所述芯片上，记为chip
‑
3，将所述chip
‑
3通过倒置后与经步骤(a3)处理过的所述chip
‑
1上下对准的方式，实现所述chip
‑
3中的所述抗体
‑
磁珠复合物到所述chip
‑
1的转移，从而完成染色质免疫共沉淀。
34.在所述芯片上步骤中，所述“原位dna文库构建”和“高通量样品编码”可按照如下(a5)
‑
(a7)进行：
35.(a5)将2
×
末端修复反应缓冲液加入到第四张所述芯片上，记为chip
‑
4，将所述chip
‑
4通过倒置后与经步骤(a4)处理过的所述chip
‑
1上下对准的方式，实现所述chip
‑
4中的所述2
×
末端修复反应缓冲液到所述chip
‑
1的转移，置于20
‑
25℃(如20℃)孵育30
‑
60min(如30min)，从而完成dna的末端修复。
36.(a6)将2
×
加a反应缓冲液加入到第五张所述芯片上，记为chip
‑
5，将所述chip
‑
5通过倒置后与经步骤(a5)处理过的所述chip
‑
1上下对准的方式，实现所述chip
‑
5中的所述2
×
加a反应缓冲液到所述chip
‑
1的转移，置于37℃孵育30
‑
60min(如30min)，从而完成dna的3’末端加a。
37.(a7)将添加有不同编码接头的2
×
快速连接反应缓冲液加入到第六张所述芯片上，记为chip
‑
6，将所述chip
‑
6通过倒置后与经步骤(a6)处理过的所述chip
‑
1上下对准的方式，实现所述chip
‑
6中的所述添加有不同编码接头的2
×
快速连接反应缓冲液到所述chip
‑
1的转移，置于20℃孵育15
‑
30min(如15min)，从而完成所述编码接头与dna的连接。
38.进一步地，在步骤(a1)中，可通过控制所述细胞悬液的浓度使每个微孔中接种100
‑
3000个细胞(如每个微孔中100
‑
1000个细胞，再如每个微孔中1000个细胞)。
39.进一步地，在步骤(a2)中，所述交联液可为1％(1g/100ml)甲醛溶液；所述终止液可为0.125m甘氨酸溶液(溶剂为水)，用于终止交联。
40.进一步地，在步骤(a3)中，所述2
×
裂解液中含有微球菌核酸酶。该步骤通过微球菌核酸酶实现对染色质的片段化。
41.更进一步地，所述2
×
裂解液组成如下：100mm tris
‑
cl(ph 7.5)；2％(体积百分含量)tritonx
‑
100；300mm sodium chloride；0.2％(0.2g/100ml)sodium deoxycholate；10mm calcium chloride；2
×
protease inhibitor cocktail(thermo fisher,78425)；1.2％(体积百分含量)微球菌核酸酶(thermo fisher,88216)。可以理解，其中的所述微球菌核酸酶不局限于“thermo fisher,88216”该商品，可以替换为等酶活的其他微球菌核酸酶。所述微球菌核酸酶(thermo fisher,88216)，≥100units/μl，1unit定义为在25℃下，高度聚合dna使260nm处吸光度增加0.001/min/ml所需的酶量。
42.进一步地，在步骤(a4)中，所述抗体
‑
磁珠复合物为靶向抗原的特异性抗体
‑
磁珠复合物，预先在ep管中孵育过，然后用egta缓冲液清洗后重悬于所述egta缓冲液，然后加入到所述chip
‑
3中。所述egta缓冲液组成如下：60mm egta(leagene,r00020)；10mm tris
‑
cl；1mm edta；150mm sodium chloride；0.1％(0.1g/100ml)sodium deoxycholate；1
×
protease inhibitor cocktail(thermo fisher,78425)。
43.进一步地，在步骤(a4)中，还可包括将加入所述抗体
‑
磁珠复合物后的所述chip
‑
1置于4℃孵育10
‑
16h的步骤。
44.进一步地，在步骤(a4)中，将加入所述抗体
‑
磁珠复合物后的所述chip
‑
1置于4℃孵育10
‑
16h后还可包括用te缓冲液浸没清洗所述chip
‑
1的步骤。
45.进一步地，在步骤(a5)中，所述2
×
末端修复反应缓冲液可为2
×
end repair buffer(neb,e6050)。
46.进一步地，在步骤(a5)中，完成所述dna的末端修复后还可包括用te缓冲液浸没清洗所述chip
‑
1的步骤。
47.进一步地，在步骤(a6)中，所述2
×
加a反应缓冲液可为2
×
da
‑
tailing buffer(neb,e6053)。
48.进一步地，在步骤(a6)中，完成所述dna的3’末端加a后还可包括用te缓冲液浸没清洗所述chip
‑
1的步骤。
49.进一步地，在步骤(a7)中，所述编码接头可为y型编码接头。
50.更进一步地，每个所述y型编码接头带有不同barcode序列，不同的所述y型编码接头带有相同的通用序列。
51.在本发明的具体实施方式中，所述y型编码接头可按照包括如下步骤的方法制备得到：设计合成两种寡核苷酸单链：通用序列和编码序列，不同的所述编码序列带有不同barcode序列(长度如8bp)。将不同的所述编码序列分别与等量的所述通用序列混合，通过退火形成所述y型编码接头。
52.进一步地，在步骤(a7)中，所述添加有不同编码接头的2
×
快速连接反应缓冲液为将3μm所述编码接头与2
×
快速连接反应缓冲液按照2：3的体积比混合而成的；和/或
53.在本发明的具体实施方式中，所述2
×
快速连接反应缓冲液为2
×
quick ligation buffer(neb,e6056)。
54.进一步地，在步骤(a7)中，完成所述编码接头与dna的连接后还可包括用te缓冲液浸没清洗所述chip
‑
1的步骤。
55.进一步地，在步骤(a4)之后，还可包括在所述chip
‑
1下方放置磁铁的步骤。
56.将磁铁置于芯片下方可将磁珠
‑
抗体
‑
抗原复合物固定在微孔底部，既可以保证后
续的dna文库构建步骤中磁珠不会在微孔之间相互串扰，也可以通过将磁铁在芯片上下方移动来驱动磁珠与溶液充分接触，进一步提高dna文库构建反应效率。
57.在所述芯片外步骤中，所述“非特异性清洗”可按照如下(b1)进行：
58.(b1)将已经被编码的磁珠
‑
抗体
‑
染色质片段从所述chip
‑
1的微孔中回收出来至1.5ml蛋白低吸附ep管(eppendorf，0030108442)中后，依次用低盐溶液、高盐溶液、licl溶液和te缓冲液清洗以去除非特异性吸附，然后用洗脱缓冲液重悬。
59.在所述芯片外步骤中，所述“解交联”可按照如下(b2)进行：
60.(b2)向步骤(b1)处理后体系中加入添加有rnasea和蛋白酶k的洗脱缓冲液，37℃孵育1
‑
2h(如2h)，65℃孵育6
‑
8h(如8h)，然后从磁珠
‑
抗体复合物上释放已编码的dna片段(可通过将上述1.5ml ep管置于磁力架上静置10min的方式实现)。
61.在所述芯片外步骤中，所述“纯化”可按照如下(b3)进行：
62.(b3)采用ampure xp磁珠进行纯化。
63.在所述芯片外步骤中，所述“预扩增”可按照如下(b4)进行：
64.(b4)根据步骤(a7)中的所述编码接头设计扩增引物，进行pcr；
65.进一步地，在步骤(b1)中，所述低盐溶液中nacl含量可为140mm；所述高盐溶液nacl含量可为500mm。
66.更进一步地，所述低盐溶液的组成如下：1％(体积百分含量)tritonx
‑
100；0.1％(0.1g/100ml)十二烷基硫酸钠(thermo fisher,15553
‑
027)；0.1％(0.1g/100ml)sodium deoxycholate；140mm nacl；10mm tris
‑
hcl ph 8.0；1mm edta。所述高盐溶液的组成如下：1％(体积百分含量)tritonx
‑
100；0.1％(0.1g/100ml)十二烷基硫酸钠；0.1％(0.1g/100ml)sodium deoxycholate；500mm nacl；10mm tris
‑
hcl ph 8.0；1mm edta。所述licl溶液的组成如下：0.5％(体积百分含量)nonidet np 40；250mm licl；0.5％(0.5g/100ml)sodium deoxycholate。所述洗脱缓冲液的组成如下：300mm nacl；0.5％(0.5g/100ml)十二烷基硫酸钠；10mm tris
‑
hcl；5mm edta。
67.在本发明的具体实施方式中，具体是通过图2所示装置实现一个所述芯片与另一个所述芯片上下对准，从而完成液体转移的。当然实际中也可根据实际情况手动完成。
68.第二方面，本发明要求保护一种用于高通量染色质免疫共沉淀测序的样品制备方法。
69.本发明要求保护的用于高通量染色质免疫共沉淀测序的样品制备方法，可包括前文第一方面中所述的芯片上步骤。
70.第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述方法或第二方面所述方法在对少量初始样本进行高通量染色质免疫共沉淀测序中的应用。
71.其中，所述少量初始样本可为每个样本100
‑
3000个细胞(如100
‑
1000个细胞，再如1000个细胞)。
72.第四方面，本发明要求保护前文所述新型超疏水微孔阵列芯片在对少量初始样本进行高通量染色质免疫共沉淀测序样品制备和/或对少量初始样本进行高通量染色质免疫共沉淀测序中的应用。
73.其中，所述少量初始样本可为每个样本100
‑
3000个细胞(如100
‑
1000个细胞，再如1000个细胞)。
74.在本发明中，所述测序的平台可为illumina hiseqxten双端150bp测序。
75.本发明提供了基于一款新型超疏水微孔阵列芯片进行高通量染色质免疫共沉淀
‑
测序(high
‑
throughput chromatin immunoprecipitation sequencing,hit chip
‑
seq)样品制备的方法。通过与微流控芯片技术相结合，实现对少量细胞、高通量的chip
‑
seq样品制备平台搭建。
76.新型超疏水微孔阵列芯片具有加工工艺简单，原材料价格低廉等优势，同时由于芯片微孔反应体系为纳升级，因此能够显著的提升微孔内生化反应的效率并大大节约反应试剂的消耗。本发明所提供的基于此芯片所搭建的高通量染色质免疫共沉淀测序(chip
‑
seq)技术平台能够为实现少量细胞的chip
‑
seq技术提供方便可行的解决方案。
附图说明
77.图1为新型超疏水微孔阵列芯片上液滴接触角。
78.图2为新型超疏水微孔阵列芯片的结构示意图。
79.图3为新型超疏水微孔阵列芯片的加工流程图。
80.图4为基于新型超疏水微孔阵列芯片高通量染色质免疫共沉测序(chip
‑
seq)技术样品制备流程示意图。
81.图5为本发明实现一个所述芯片与另一个所述芯片上下对准从而完成液体转移的装置结构示意图。
82.图6为同时对100个样本，每个样本1000个k562初始细胞量进行h3k4me3的chip
‑
seq结果。
83.图7为在一张芯片上用四种不同组蛋白抗体的chip
‑
seq结果。
具体实施方式
84.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
85.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
86.实施例1、基于新型超疏水微孔阵列芯片高通量染色质免疫共沉
‑
测序(chip
‑
seq)技术样品制备流程
87.首先，进行新型超疏水微孔阵列芯片的加工，具体如下：
88.1)pmma模具设计。模具材料为pmma，模具上设计有108个微孔阵列(12
×
9)，微孔为圆柱形，微孔在微孔阵列中均匀分布，微孔直径为1mm，微孔深300μm，微孔间距为2.25mm。在所述微孔阵列之间设计有超疏水材料涂层池，所述微孔和微孔壁外围均为所述涂层池，涂层池深度为0.1mm，涂层池与微孔之间的微孔壁厚0.15mm。
89.2)新型超疏水涂料的合成。将2g 1h,1h,2h,2h
‑
全氟辛基三乙氧基硅烷(sigma，718467)与198g无水乙醇在机械力的搅拌下混合2小时，加入10g二氧化钛纳米粒子(sigma，914673)和10g p25氧化钛(赢创德固赛，65471)混匀并超声分散1小时后制备成超疏水涂料
悬液，即新型超疏水涂料。经测试，液滴在该涂料制备的涂层表面形成接触角为168
°
(如图1所示)，符合超疏水材料特征。
90.3)新型超疏水微孔阵列芯片的制备。使用移液枪吸取新型超疏水涂料注入pmma基底微孔阵列芯片微孔之间的超疏水材料涂层池，待涂料中的酒精蒸发，芯片表面便形成一层具有超疏水性的涂层，即完成了一张集成式新型超疏水微孔阵列芯片的加工。
91.图2为新型超疏水微孔阵列芯片的结构示意图。图中的超疏水材料涂层是新型超疏水涂料注入pmma基底微孔阵列芯片微孔之间的超疏水材料涂层池，涂料中的酒精蒸发后形成的涂层，具有较高的疏水性，可将微孔之间进行有效的物理隔绝。微孔的内径为1.0mm，微孔的间距为2.25mm，微孔深度0.3mm，超疏水材料涂层厚度(即超疏水材料涂层池深度)为0.1mm，涂层池与微孔之间的微孔壁厚0.15mm。
92.图3为新型超疏水微孔阵列芯片的加工流程图。
93.然后，基于上述新型超疏水微孔阵列芯片，本发明将chip
‑
seq样品制备流程集成在芯片上。搭建一款基于新型超疏水微孔阵列芯片的高通量chip
‑
seq平台。区别于目前基于微流控芯片的chip
‑
seq样品制备方案将染色质通入微管道中完成免疫共沉淀反应后在芯片外完成样本dna文库构建。本发明直接以少量细胞为初始样本并在该平台上集成了细胞接种、交联、细胞裂解、染色质片段化、特异性抗体与抗原免疫反应、dna文库构建以及高通量的样本编码，并将已编码的样本回收后依次进行非特异性清洗、解交联、纯化、预扩增和上机测序。通过测序分析，能够精确定位各个微孔中样本的信息，以图4为例，介绍流程示意图中的反应条件和试剂组分。
94.首先通过将细胞悬液浸没芯片(chip
‑
1)，可以将细胞接种至芯片上每个微孔中，并且通过控制细胞悬液的浓度可使每个微孔中接种100至1000个细胞。此外本发明也可以将不同数量和种类的细胞通过移液器加入芯片不同微孔中。细胞接种至芯片后用1％w/v甲醛溶液(thermo fisher,28908)和0.125m甘氨酸溶液(溶剂为水)浸没芯片实现对细胞的交联和终止交联。随后将2
×
lysis buffer(配方：(100mm tris
‑
cl(ph7.5)，2％(体积百分含量)tritonx
‑
100，300mm sodium chloride，0.2％(0.2g/100ml)sodium deoxycholate，10mm calcium chloride，2
×
protease inhibitor cocktail(thermo fisher,78425)，1.2％(体积百分含量)微球菌核酸酶(thermo fisher,88216))通过点样的方式加至另外一张芯片(chip
‑
2)，将chip
‑
2与接种有细胞的chip
‑
1通过上下对准的方式完成对细胞的原位裂解以及利用微球菌核酸酶对染色质片段化(先4℃孵育10min，再37℃孵育15min)，并将预先在ep管中孵育的多种类型的抗体
‑
磁珠(dynabeads protein a,thermo fisher,26162)复合物用egta buffer(配方：60mm egta(leagene,r00020)，10mm tris
‑
cl，1mm edta，150mm sodium chloride，0.1％(0.1g/100ml)sodium deoxycholate，1
×
protease inhibitor cocktail(thermo fisher,78425))清洗并重悬后加入一张新的芯片(chip
‑
3)，将chip
‑
3与chip
‑
1通过上下对准，实现多指标的chip，并将芯片置于4℃冰箱中过夜孵育10
‑
16h。
95.第二天从冰箱中取出芯片，用te缓冲液浸没清洗所述chip
‑
1，将磁铁置于芯片下方可将磁珠
‑
抗体
‑
抗原复合物固定在微孔底部，既可以保证后续的dna文库构建步骤中磁珠不会在微孔之间相互串扰，也可以通过将磁铁在芯片上下方移动来驱动磁珠与溶液充分接触，进一步提高dna文库构建反应效率。
96.在芯片上原位dna文库构建之前，本发明首先在96孔板和pcr管中制备y型编码接头文库，流程如下：设计合成了两种寡核苷酸单链：通用序列和编码序列，其中编码序列包含有100个带有不同barcode(8bp)的编码序列。其中通用序列如seq id no.1所示(3’末端最后一个碱基经磷酸化修饰)，带有barcode的编码序列如seq id no.2所示(其中的8个连续的n为barcode序列)。为了形成y型编码接头文库，本发明将通用接头平均分成100份，每份通用接头浓度100μm，将编码序列分别与等摩尔的通用接头混合，通过退火形成50μm的y型编码接头，其中退火条件为95℃孵育3min，并以每秒0.1℃的速度降温至4℃，最后，带有不同标签的y型编码接头文库保存在
‑
20℃备用。
97.随后本发明将chip
‑
4的每个微孔中加入0.5μl 2
×
end repair buffer(neb,e6050)，与chip
‑
1对准并置于20℃孵育30min；孵育结束后用预冷的1
×
te buffer浸没清洗芯片；接下来用同样的方式向chip
‑
5每个微孔中加入0.5μl 2
×
da
‑
tailing buffer(neb,e6053)，与chip
‑
1对准并置于37℃的细胞培养箱中孵育30min；孵育结束后同样用预冷的1
×
te buffer浸没清洗芯片。用depc水将100个50μm y型编码接头稀释成3μm，并将0.8μl 3μm y型编码接头与1.2μl 2
×
quick ligation buffer(neb,e6056)在96孔板中混匀，随后分别将带有不同y型编码接头的2
×
quick ligation buffer加入chip
‑
6每个微孔，与chip
‑
1对准并将芯片置于20℃孵育15min，孵育完成后用预冷的1xte浸没清洗芯片。已被编码的磁珠
‑
抗体
‑
染色质片段可直接从芯片微孔中回收至1.5ml蛋白低吸附ep管(eppendorf，0030108442)中，所有的样本将在相同的反应条件下统一用低盐溶液(配方：1％(体积百分含量)tritonx
‑
100，0.1％(0.1g/100ml)十二烷基硫酸钠(thermo fisher,15553
‑
027)，0.1％(体积百分含量)sodium deoxycholate，140mm nacl，10mm tris
‑
hcl ph 8.0,1mm edta)，高盐溶液(配方：1％(体积百分含量)tritonx
‑
100，0.1％(0.1g/100ml)十二烷基硫酸钠，0.1％(体积百分含量)sodium deoxycholate，500mm nacl，10mm tris
‑
hcl ph 8.0，1mm edta)，licl溶液(配方：0.5％(体积百分含量)nonidet np 40，250mm licl，0.5％(体积百分含量)sodium deoxycholate)和te溶液清洗一次以去除非特异性吸附，将所用样本同时在相同条件下进行操作，可有效避免人为因素以及试剂因素所导致的实验误差。最后用50μl elution buffer(配方：300mm nacl，0.5％(0.5g/100ml)十二烷基硫酸钠，10mm tris
‑
hcl，5mm edta)重悬于200μl pcr管中。
98.将2μl rnasea(thermo fisher,12091
‑
021)和2.5μl蛋白酶k(neb,p8107s)加入到上述elution buffer中37℃孵育2h，65℃孵育8h，从磁珠抗体复合上释放已编码的dna片段。孵育完成后将pcr管置于96孔磁力架上(thermo fisher,12331d)静置10min，待溶液澄清后，取上清于新的pcr管中。
99.转移到新pcr管中的54.5μl上清液用1
×
ampure xp beads(beckman coulter,a63881)纯化后重悬与25μl depc水中，并用qubit 3(thermo fisher,q33238)和配套的检测试剂盒dsdna hs assay kit(thermo fisher,q32854)测定dna文库的浓度。
100.接下来对dna文库预扩增，体系如下：25μl 2
×
kapa hifi hotstartreadymix(kapa,kk2611)；1μl 10μm正向引物(5
′‑
aatgatacggcgaccaccgagatctac actctttccctacacgac
‑3′
，seq id no.3)、1μl 10μm反向引物(5
′‑
caagcaga ag acggcatacgagat
‑3′
，seq id no.4)和23μl dna文库，程序如下：95℃3min；98℃20s，65℃15s，72℃15s，3
‑
15个循环；72℃延伸1min。并根据qubit测定的dna文库总量来确定循环数。
最后，pcr产物用1
×
ampure xp beads纯化，并用qubit和bioanalyzer 2100分别测定dna文库的总量和片段的大小。合格的样本可上机测序，测序平台为illumina hiseqxten双端150bp测序。
101.在上述步骤中，实现一个所述芯片与另一个所述芯片上下对准从而完成液体转移具体是通过图5所示装置实现的，当然也可以通过手动完成。
102.图5所示装置是利用芯片对准平台和ccd显微镜(三锵泰达，td
‑
2khu)对准完成上下两张芯片的微孔中液体的交换和转移。真空泵工作时，能保证在负压条件下超疏水微阵列芯片被倒置吸附在对准平台的操作杆上。该芯片对准平台有x，y和z三个移动方向，首先通过调整x和y方向的调节轴，可将操作杆所吸附的倒置芯片与正置芯片在水平方向完成两张芯片微孔对准，再调整z方向调节轴使两张芯片在垂直方向相互接触。芯片对准过程在湿箱中完成，保证了对准操作期间无液体蒸发。同时湿箱由于经过紫外灭菌，整个操作环境为无菌。
103.实施例2、实施例1方法的具体应用实例
104.一、采用实施例1中的方法，基于芯片完成对100个样本，每个样本1000个k562细胞的h3k4me3 chip
‑
seq，由于对每个微孔独立的进行了编码，因此在测序后能够拆分出不同编码的样本，并且与encode数据库中k562细胞h3k4me3 chip
‑
seq结果对比具有较好的一致性。具体结果图见图6。
105.二、采用实施例1中的方法，基于芯片实现四种不同组蛋白修饰(h3k4me1(abcam,ab8895)；h3k4me3(millipore,07
‑
473)；h3k27ac(abcam,ab4729)和h3k27me3(millipore,07
‑
449))的chip
‑
seq样品制备，每种组蛋白修饰有24个微孔重复，每个样本约为1000个k562细胞的初始量。具体结果图见图7。其中，图7中a是四种组蛋白抗体在芯片上的接种的分布示意图，其中nc组为无细胞阴性对照组，图7中b为四种组蛋白修饰的主成分分析结果，图7中c为四种组蛋白修饰在基因分布以及encode数据库中对应样本类型和组蛋白修饰类型的igv峰图。结果表明，基于此方法能够在同一张芯片上实现少量样本多种组蛋白修饰的chip
‑
seq，并且不同组蛋白修饰根据其在基因组上分布区域的特点可以有效区分，同时也证明相同组蛋白修饰的样本间重复性较好。
106.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。