一株昆虫蜚蠊肠道内生链霉菌WA5-1-7及其应用

一株昆虫蜚蠊肠道内生链霉菌wa5
‑1‑
7及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株昆虫蜚蠊肠道内生链霉菌 wa5
‑1‑
7及其应用。


背景技术：

2.放线菌是发现天然产物和多种活性先导化合物的资源宝库。在放线菌中链 霉菌数量占大部分，从放线菌中发现链霉素等多种抗生素约80％以上来源于链 霉菌。但近年来，陆生和海洋放线菌候选药物的命中率不断下降，这使科学家 的注意力转移到内生放线菌，它们处于特殊的生态位，这可能会成为天然生物 活性物质丰富的资源。昆虫内生菌是栖息在昆虫体内的一类特境微生物，目前 尚未发现无内生菌栖息的昆虫，因此昆虫体内蕴藏着庞大的微生物资源。
3.美洲大蠊(periplaneta americana)俗称“蟑螂”，属节肢动物门昆虫纲有翅 亚纲蜚蠊目，是地球上已知的生命力最顽强、最古老的昆虫类群之一。其在《神 农本草经》、《本草纲目》、《新修本草》等均有入药的记载，性寒、味咸、 归肝、脾、肾经，具有活血散瘀、健脾消疳、利水消肿生肌等功效。现代研究 表明美洲大蠊具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、组织修复和增强机体免疫能力等药理 作用。美洲大蠊长期生活在厨房、下水道、垃圾堆等黑暗潮湿存在大量病原微 生物环境中，仍具有极强生命力和繁殖能力，提示美洲大蠊的药理作用以及其 较强的环境适应能力、防御外来病原菌侵染的能力，与其肠道内丰富的微生物 菌群可能存在密切的关系。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一株从美洲大蠊肠道中分离筛选出的内生链霉菌wa5
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7 及其应用。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明的第一个目的是提供了一株昆虫蜚蠊肠道内生链霉菌wa5
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7，所 述链霉菌wa5
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7为从美洲大蠊肠道中分离、筛选获得的内生菌，保藏于广东 省微生物菌种保藏中心，地址为中国，广东，广东省微生物研究所，保藏菌种 名称为streptomvces sp.wa5
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7，分类学名称为streptomvces sp.，保藏编号为 gdmcc no.61630，保藏日期为2021年4月26日，保藏年限为30年。
7.本技术的另一目的是提供一种如上述方案所述链霉菌wa5
‑1‑
7的鉴定方法， 包括以下过程：
8.(1)从美洲大蠊肠道中分离得到159株放线菌，筛选出具有良好抗白色念 珠菌活性的菌株15株，进一步筛选出抗菌性好的菌株wa5
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7；
9.(2)对步骤(1)筛选出的抗菌性好的菌株wa5
‑1‑
7进行形态学观察、分 子生物学鉴定和系统发育树分析方法进行生物学分类鉴定，即可。
10.优选的，步骤(2)中所述形态学观察为对菌株wa5
‑1‑
7在高氏1号培养基 上的生长
形态进行观察，通过革兰氏染色法观察菌株wa5
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7的形态，通过扫 描电子显微镜观察菌株wa5
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7的形态。
11.优选的，步骤(2)中所述分子生物学鉴定和系统发育树分析过程为：
12.s1、对菌株wa5
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7的dna进行提取，选择细菌16s rrna通用引物27f 和引物1492r将所提取的dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
13.s2、将步骤s1所得pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序， 将测序得到的序列提交至ncbi中进行blast同源性比对，同时将序列信息提 交至genbank数据库中，获取菌株wa5
‑1‑
7 16s rrna的登录编号；
14.s3、将菌株wa5
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7的16s rrna序列与ncbi中的数据库序列进行blast 同源性比对，选取有效发表的不同种属中的代表性菌株，利用mega5.0软件中 的邻接法对多序列比对结果进行系统发育树分析，判断出菌株wa5
‑1‑
7所属的 种属。
15.优选的，步骤s1中所述引物27f的序列信息如seq id no.1所示，引物1492r的序列信息如seq id no.2所示。
16.27f：5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
(seq id no.1)；
17.1492r：5
′‑
tacggctaccttgttacgactt
‑3′
(seq id no.2)。
18.优选的，步骤s2中所述菌株wa5
‑1‑
7 16s rrna测序得到的16s rrna序列 信息如seq id no.3所示。
19.gcttgtccgacgttgcttaccatgcgagtcgtaacatggtagccgtaa ggtggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccct tcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataacactct gtcccgcatgggacggggttgaaagctccggcggtgaaggatgagcccgc ggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggt agccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggccca gactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcc tgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctc tttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccg gctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtc cggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtg aaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagt gtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatc aggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctg aggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccac gccgtaaacgttgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgc cgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggcta aaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggc ttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatataccggaa agcatcagagatggtgccccccttgtggtcggtatacaggtggtgcatggc tgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc aacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcaca ggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtca tcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaat gagctgcgatgccgcgaggcggagcgaatctcaaaaagccggtctcagtt cggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcg cagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtcacaccgccc gtctcgtctacgtaatag(seq id no.3)。
20.优选的，步骤s3经分析后得出所述菌株wa5
‑1‑
7所属的种属为链霉菌属， 且同源性达到99％。
21.本发明的第三个目的是提供一种所述的链霉菌wa5
‑1‑
7的次级代谢产物在 制备
抑菌组合物中的应用。
22.优选地，所述抗菌组合物可以强效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa、 金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌生长。
23.本发明人前期从美洲大蠊肠道中分离得到的159株放线菌，其中有15株具有 良好抗白色念珠菌活性的菌株，选取具有良好抗白色念珠菌活性的菌株 wa5
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7。通过形态学观察，分子生物学鉴定，系统发育树分析等方法对菌株 wa5
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7进行生物学分类，初步确定该菌株为链霉菌属(streptomyces sp)，保 藏编号为gdmcc no.61630。此种子菌悬液以5％的接种量接种于装有300mlph7.2 isp2发酵培养基的500ml锥形瓶中，于160rpm、28℃液体摇瓶发酵。牛津 杯法进行抑菌实验发现，发酵上清液以及发酵液乙酸乙酯粗提物对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌mrsa、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌具有较强的抑制作用，对 肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌具有一定抑菌活性；最后通过高效液相外标法 检测菌株发酵粗提物中的放线菌素含量，发液粗提物中放线菌素含量高达80％， 放线菌素d和放线菌素x2产量分别达到138.36mg/l和227.21mg/l。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明提供的昆虫蜚蠊肠道内生链霉菌，其次级代谢产物抗菌活性强，对 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌具有较强的抑 制作用，对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌具有一定抑菌活性；放线菌素含量 和产量高，发酵粗提物中放线菌素含量高达80％，放线菌素d和放线菌素x2产量 分别达到138.36mg/l和227.21mg/l，具有广阔的发展空间和很好的开发应用前 景。
附图说明
26.图1为菌株wa5
‑1‑
7在高氏1号平板上的生长状态图；
27.图2为菌株wa5
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7在革兰氏染色在油镜100x下的形态图；
28.图3为菌株wa5
‑1‑
7在扫描电镜2kx下形态图；
29.图4为菌株wa5
‑1‑
7在扫描电镜10kx下形态图；
30.图5为菌株wa5
‑1‑
7的16s rrna扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
31.图6为菌株wa5
‑1‑
7的16s rrna扩增产物的系统发育树的构建图；
32.图7为不同发酵天数发酵液抗mrsa活性图；
33.图8为不同发酵天数发酵液抗mrsa活性统计图；
34.图9为发酵液粗提物抗菌谱分析图；
35.图10为wa5
‑1‑
7发酵液上清粗提物色谱分析结果图。
具体实施方式
36.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详 细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
37.所述革兰氏染色试剂盒购自广东环凯微生物科技有限公司，型号为029010； 所述ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术股份有 限公司，型号为no.b518255；所述放线菌素d、放线菌素x2由本课题组分离 纯化鉴定；所述氨苄青霉素购自广州齐云生物技术有限公司，型号为k0020； 所述两性霉素b购自上海阿拉丁生化科技股份
有限公司，型号为 a105482
‑
250mg；所述环丙沙星购自上海麦克林生化科技有限公司，型号为 c824343
‑
25g；所述ymc
‑
pack ods
‑
aq(4.6
×
250mm)色谱柱购自日本ymc 公司，型号为aq12s05
‑
2546wt；所述甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、 无水乙醇购自广东光华科技股份有限公司，均为分析纯；所述试剂或生物材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。
38.实施例1菌株wa5
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7形态学鉴定
39.1.1菌株wa5
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7在高氏1号培养基上的生长形态
40.从保存在
‑
20℃冰箱菌库中找出菌株wa5
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7的保种管，吸取100μl菌液至 高氏1号琼脂的平板上，玻璃棒均匀涂布，此操作在超净台中进行，置于恒温 培养箱中，28℃倒置培养5d，待菌株wa5
‑1‑
7在平板中菌落的状态平稳后，用 已经火焰灭菌的接种环挑选单菌落的孢子分区划线接种于高氏1号琼脂平板中， 28℃培养箱中倒置培养5d，封口膜密封，置于4℃冰箱保存备用。采用涂片法 将菌株wa5
‑1‑
7接种于高氏1号平板中，于28℃培养箱中倒置培养5d，待菌株 的孢子成熟后，观察菌落的生长形态及气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素产生 等情况；
41.所述高氏1号琼脂的配制方法：将可溶性淀粉20.0g、氯化钠0.5g、磷酸氢 二钾0.05g、硫酸亚铁0.01g、硫酸镁0.05g、硝酸钾1.0g、琼脂15.0g溶于蒸馏 水中，并定容至1000ml，调节ph值至7.3，分装，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
42.实验结果：菌株wa5
‑1‑
7接种至高氏1号平板上在28℃恒温培养箱培养5d 后观察菌落形态特征，如图1所示，该菌株在高氏1号平板上生长良好，菌落 圆形，干燥不透明，呈现出内外两个圆环，菌丝向四周伸展，基内菌丝淡黄色， 气生菌丝白色。
43.1.2革兰氏染色法观察菌株wa5
‑1‑
7的形态
44.经酒精灯火焰灭菌的接种环从高氏1号平板上挑取单克隆菌体置于含有 0.5ml无菌dh2o的离心管中重悬，吸取1滴菌液滴加至洁净的载玻片上，酒精 灯上烤干之后根据革兰氏染色试剂盒的说明书进行革兰氏染色，然后将其置于 光学显微镜下观察。首先在低倍镜下寻找到样品的视野区，使用粗准焦螺旋调 高物镜，在样品区域上滴加1
‑
2滴香柏油，物镜切换到100倍(油镜)，将聚光 器上升至最高位置并把光圈开到最大，在侧面水平注视下慢慢将镜筒降下，使 油镜浸没在油中但不能压破载玻片，慢慢调节细调节器至视野中出现物象并清 晰准焦为止，观察并记录菌株的菌体颜色与形态特征。
45.实验结果如图2所示，经革兰染色呈紫色，确定菌株wa5
‑1‑
7为革兰氏阳 性菌。
46.1.3扫描电子显微镜观察菌株wa5
‑1‑
7的形态
47.2.5％戊二醛溶液的配制：称取na2hpo4·
12h2o 7晶体1.64g，去离子水溶解 并定容至1l，为a液。称取31.21g nah2po4·
2h2o，去离子水溶解并定容至1l， 为b液。将50ml的50％戊二醛加入到0.2mol磷酸盐缓冲液(由a液360ml 和b液140ml配置而成，ph值7.2)中，去离子水定容至1l，再加入活性炭 20.0g。封口避光置于4℃冰箱中备用。
48.取上述已配制好的2.5％戊二醛溶液1.0ml置于1.5ml已高压灭菌的ep管 中，接种环加入在高氏1号平板上生长的菌株wa5
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7菌体，置于4℃冰箱， 固定12h左右，2000rpm离心5min，弃上清；然后加入1.0ml磷酸缓冲液(pbs) 反复吹打，2000rpm离心5min，弃上清，重复3次，每次10min；紧接着使用 不同浓度的乙醇(30％、50％、70％、80％、90％、100％)进行梯度脱水，相同 条件下离心弃上清，每次脱水6min；然后把样品滴加到载玻片上，室温条件下 自然干燥；最后将处理好的样品置于离子溅射仪(hitachi mc1000)喷金键膜后， 扫描
电子显微镜(hitachi s
‑
3400n)观察菌丝特征以及孢子形状。实验结果如图 3和图4所示，扫描电镜结果显示，菌株的基内菌丝和气生菌丝较为丰富，孢子 成熟后脱落呈柱状形，证明该菌株形态特征与链霉菌基本相符。
49.实施例2菌株wa5
‑1‑
7的分子生物学鉴定
50.2.1 16s rrna基因序列的提取及比对
51.使用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒，对菌株wa5
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7的dna进 行提取，选细菌通用引物27f和引物1492r将所提取的基因序列进行pcr扩增， 引物信息如seq id no.1和seq id no.2所示；
52.pcr反应体系如下：
53.表1 pcr反应体系
54.试剂体积(μl)primer star max premix(2
×
)12.5100μm上游引物27f1.0100μm下游引物1492r1.0dna模板1.5灭菌水9.0
55.扩增条件：预热94℃、3min，变性95℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、 1min，共进行35个循环，再72℃后延伸10min，4℃保存)。
56.pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳(恒压120v，15min)检测，在 1000～2000bp处出现明亮的条带，符合放线菌特征，如图5所示，送至华大基因 公司测序，将测序得到的序列提交至ncbi中进行blast同源性比对，同时将 序列信息提交至genbank数据库中，获取菌株wa5
‑1‑
7 16s rrna的登录编号 mn759381。
57.2.2 16s rrna系统发育树分析
58.将菌株wa5
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7的16s rrna序列与ncbi中的数据库序列进行blast同 源性比对，选取有效发表的不同种属中的代表性菌株，利用mega5.0软件中的 邻接法(neighbor
‑
joining)对多序列比对结果进行系统发育树分析，判断出菌 株wa5
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7所属的种属。
59.菌株wa5
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7的同源性比较及系统发育树分析结果：
60.菌株wa5
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7的pcr扩增产物经测序为1371bp的16s rrna序列，将序列 上传至genbank数据库中进行blast同源性比对，选取不同种的代表性菌株， 如图6所示为多序列比对进行系统发育树分析，结果表明该菌株与链霉菌 (streptomyces sp.cp010833.1)处于同一分支，同源性达到99％，鉴定菌株 wa5
‑1‑
7为链霉菌(streptomyces sp.)。将菌株序列提交至ncbi的genbank 数据库中，获得菌株wa5
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7序列登录编号mn759381，经过测序后得菌株 wa5
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7的16s rrna基因序列如seq id no.3所示。
61.实施例3菌株的发酵及不同天数发酵液抗mrsa活性测定
62.取高氏1号平板上单菌落接种到含有50ml的isp
‑
1种子液体培养基中，并 置于恒温摇床中28℃、160rpm培养2～3天，直至种子液浑浊后，按5％的接种 量接种到装有300ml isp
‑
2培养基的500ml锥形瓶中，并置于恒温摇床中28℃、 160rpm进行发酵，在开始发酵第4天起，隔天取发酵液1ml，于4℃冰箱保存 备用。使用牛津杯法检测发酵液的抗mrsa活性：将取得的发酵液样品于 12000rpm下离心5min备用。将高压蒸汽灭菌的tsa培养基于微波炉中
融化， 待培养基温度下降至43℃时，加入适量新鲜培养的终浓度为4
×
106cfu/ml的 mrsa菌液，并将其混匀，采用双层倒板法倒入适量混匀后的培养基于培养皿 中，待培养基凝固，在培养基上放置牛津杯，往其中加入200μl的发酵上清液， 将加好样的平板放置在37℃的恒温培养箱中培养12h，并观察和记录结果。其 中每株菌作3个重复，使用甲醇溶解的128μg/ml放线菌素d、128μg/ml放线 菌素x2作为阳性对照，使用甲醇作为阴性对照。
63.所述种子液体培养基的制备过程为：将葡萄糖10.0g、酵母提取物2.0g、胰 蛋白胨12.0g溶解于蒸馏水中，并定容1000ml，调节ph值至7.3，分装，于121℃ 高压蒸汽灭菌20min；
64.所述isp
‑
2培养基的制备过程为将葡萄糖4.0g、酵母提取物4.0g、麦芽糖提 取物10.0g溶解于蒸馏水中，并定容1000ml，调节ph值至7.3，分装，于121℃ 高压蒸汽灭菌20min；
65.所述大豆酪蛋白琼脂(tsa)培养基的配制过程为：将酪蛋白胰酶消化物 15.0g、大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g溶解于蒸馏水 中，并定容1000ml，调节ph值至7.3，分装，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
66.不同天数发酵液抗mrsa活性结果：
67.如图7和图8所示，其中，图7中1为放线菌素d，2为放线菌素x2，3 为阴性对照甲醇溶剂，4为wa5
‑1‑
7；菌株wa5
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7发酵4天上清液就具有很 强的抗mrsa活性，在发酵第10天发酵液上清抗mrsa活性达到高峰，随后 发酵时间延长抗mrsa活性有所回落。
68.实施例4发酵液粗提取制备及抗菌谱分析
69.菌株发酵15天将发酵液于高速冷冻离心机中转速8000rpm离心15min，收 集发酵液上清250ml，使用乙酸乙酯按体积比1：1重复萃取3次，使用旋转蒸 发仪于40℃将萃取相蒸发浓缩至干，往旋蒸瓶内加入少量甲醇，转移到带有克 重的西林瓶内，并放置于40℃恒温干燥箱内挥发多余甲醇，最终获得发酵液固 体粗提物，称重待用。
70.取一定量的的粗提物溶解于甲醇，配成1mg/ml的粗提物甲醇溶液。使用 牛津杯法检测粗提物的抗菌活性：将高压蒸汽灭菌的tsa培养基、pda培养基 于微波炉中融化，待培养基温度下降至43℃时，按体积比例5％加入新鲜培养的 终浓度为4
×
106cfu/ml的菌液，其中，白色念珠菌(candida albicans atcc 10231) 使用pda培养基，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，atcc 25213)，金黄 色葡萄球菌(atcc 25923)，大肠埃希氏菌(atcc 25922)，铜绿假单胞菌(atcc27853)，肺炎克雷伯杆菌(atcc 13883)等使用tsa培养基，并将培养基与 菌液混匀，采用双层倒板法倒入适量混匀后的培养基于培养皿中，待培养基凝 固，在培养基上放置牛津杯，往其中加入100μl的粗提物甲醇溶液，将加好样 的tsa培养基平板放置在37℃的恒温培养箱中培养12h，pda培养基平板放置 在28℃的恒温培养箱中培养36h，并观察和记录结果。其中，每株菌作3个重 复，抗mrsa使用甲醇溶解的128μg/ml放线菌素d作为阳性对照，抗金黄色 葡萄球菌和抗大肠埃希氏菌使用64μg/ml氨苄青霉素作为阳性对照，抗白色念 珠菌使用64μg/ml两性霉素b作为阳性对照，抗铜绿假单胞菌和抗肺炎克雷伯 杆菌使用64μg/ml环丙沙星作为阳性对照，甲醇作为阴性对照。
71.所述pda培养基的制备过程为：马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基：将马 铃薯(从中提取浸出粉)300.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15.0g、氯霉素0.1g溶解 于蒸馏水中，并定容1000ml，调节ph值至7.3，分装，于121℃高压蒸汽灭菌 20min。
72.发酵液粗提物抗菌谱分析结果：
73.将发酵液上清萃取干燥后称重，获得发酵液粗提物0.1145g。将发酵液粗提 物溶于甲醇，配成1mg/ml粗提物甲醇溶液进一步通过牛津杯法对其进行抗菌 谱分析，抑菌圈结果如表2和图9所示：
74.表2发酵液粗提物抗菌谱统计表(抑菌圈直径mm，n＝3)
[0075][0076][0077]
其中，图9中a为mrsa，b为金黄色葡萄球菌，c为大肠埃希氏菌，d 为白色念珠菌，e为肺炎克雷伯杆菌，f为铜绿假单胞菌，1为阳性对照，2为 阴性对照甲醇溶剂，3为wa5
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7；如图9所示粗提物对耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌mrsa、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌具有较强的抑制作 用，对肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌具有一定抑菌活性。
[0078]
实施例5粗提物中放线菌素含量测定
[0079]
使用外标法对粗提物中的放线菌素含量进行测定，其中色谱条件为：使用 ymc
‑
pack ods
‑
aq(4.6
×
250mm)色谱柱，进样量10μl，流动相为甲醇：水(80： 20)，检测波长为254nm。准确称量对照品放线菌素d、放线菌素x2配置成 1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01mg/ml浓度的标准甲醇溶液，按照上述 色谱条件进样分析，重复进样三次，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为 纵坐标拟合直线方程，得到外标工作曲线。
[0080]
将粗提物配成0.5mg/ml的甲醇溶液，按照同样的色谱条件进样分析，重复 进样三次，记录放线菌素峰面积，通过上述求得的对照品外标工作曲线得到粗 提物中放线菌素含度。
[0081]
粗提物放线菌素含量测定结果：
[0082]
将不同浓度的对照品放线菌素d、放线菌素x2和粗提物甲醇溶液进行色谱 分离，获得不同溶液的峰面积。以对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标拟 合直线得到回归方程，获得放线菌素d的工作曲线(y＝6766334.53x
‑
424127.78， r2＝0.9980)和放线菌素x2的工作曲线(y＝1761112.43x
‑
5741.18，r2＝0.9999)。 将粗提物的峰面积代入工作曲线得到粗提物中放线菌素d和放线菌素x2的含 量和百分比，并根据发酵体积推算出放线菌素产量，结果如图10和表2所示。
[0083]
表2放线菌素含量测定结果
[0084][0085]
wa5
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7菌株粗提物中放线菌素x2含量最高，约达到50％，产量为 227.21mg/l；放线菌素d含量可达到30％，产量为138.36mg/l。
[0086]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。 任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进 行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所 揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利 要求所涵盖。